Name: workflow and tools for crystallographic fragment screening at the helmholtz-zentrum berlin
Uploaded: 2021-03-03T14:00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin at JoVE.com

Мы благодарим многочисленные группы пользователей, которые проводили кампании CFS в HZB. Их отзывы привели к постепенному улучшению нашего рабочего процесса. Мы хотим поблагодарить группу по разработке лекарств в Университете Марбурга и группу FragMAX в MAX IV, поскольку тесное сотрудничество было основой для нескольких скачков развития для улучшения СХУ. Мы благодарны за поддержку Со стороны Федерального министерства образования и науки Германии (BMBF) в реализации проектов Frag2Xtal и Frag4Lead (номера 05K13M1 и 05K16M1). Мы также благодарны за поддержку через iNEXT-Discovery, проект no 871037, финансируемый программой Horizon 2020 Европейской комиссии.

<ol>
	<li>Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+on:+the+impact+of+fragments+on+drug+discovery.">Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).</li><li>Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+exploration+of+chemical+space+by+fragment-based+screening.">Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).</li><li>Erlanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+fragment-based+drug+discovery.">Introduction to fragment-based drug discovery.</a> Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).</li><li>Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment-based+approaches+in+drug+discovery+and+chemical+biology.">Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology.</a> Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).</li><li>Lamoree, B., Hubbard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+in+fragment-based+lead+discovery+(FBLD).">Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD).</a> Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).</li><li>Schiebel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+Biophysical+Screening+Methods+Miss+a+Large+Proportion+of+Crystallographically+Discovered+Fragment+Hits:+A+Case+Study.">Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study.</a> ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).</li><li>Schiebel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Crystallography:+Reliable+and+Efficient+Identification+of+Fragment+Hits.">High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits.</a> Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).</li><li>Krojer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+XChemExplorer+graphical+workflow+tool+for+routine+or+large-scale+protein-ligand+structure+determination.">The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).</li><li>Radeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Site+Mapping+of+an+Aspartic+Protease+by+Multiple+Fragment+Crystal+Structures:+Versatile+Warheads+to+Address+a+Catalytic+Dyad.">Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).</li><li>Cox, O. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP(2),+an+atypical+bromodomain.">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).</li><li>Wollenhaupt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F2X-Universal+and+F2X-Entry:+Structurally+Diverse+Compound+Libraries+for+Crystallographic+Fragment+Screening.">F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening.</a> Structure. 28 (6), 694-706 (2020).</li><li>. EU OPENSCREEN fragment library Available from: <a target="_blank" href="https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html">https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html</a> (2020)</li><li>Pearce, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-crystal+method+for+extracting+obscured+crystallographic+states+from+conventionally+uninterpretable+electron+density.">A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density.</a> Nature Communications. 8, 15123 (2017).</li><li>Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitated+crystal+handling+using+a+simple+device+for+evaporation+reduction+in+microtiter+plates.">Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates.</a> Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).</li><li>Mueller, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macromolecular+crystallography+beamlines+at+BESSY+II+of+the+Helmholtz-Zentrum+Berlin:+Current+status+and+perspectives.">The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives.</a> The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).</li><li>Oscarsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MXCuBE2:+The+dawn+of+MXCuBE+collaboration.">MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).</li><li>Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+fine+&#966;-slicing+for+single-photon-counting+pixel+detectors.">Optimal fine &#966;-slicing for single-photon-counting pixel detectors.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).</li><li>Lima, G. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FragMAX:+The+fragment-screening+platform+at+the+MAX+IV+Laboratory.">FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).</li><li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDSAPP2.0.">XDSAPP2.0.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).</li><li>Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+ligand+fitting+by+core-fragment+fitting+and+extension+into+density.">Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).</li><li>Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+modelling+of+ligand+binding+requires+an+ensemble+of+bound+and+unbound+states.">Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).</li><li>Collins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Eleven+-+Achieving+a+Good+Crystal+System+for+Crystallographic+X-Ray+Fragment+Screening.">Chapter Eleven - Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening.</a> Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASSIF-1:+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li><li>Cuttitta, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+transfer+of+protein+crystals+from+agarose+pedestals+to+micromeshes+for+high-throughput+screening.">Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).</li><li>Moreno-Chicano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+structures+of+protein-ligand+complexes+at+room+temperature+using+serial+femtosecond+crystallography.">High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).</li></ol>

Патентная заявка на рамку EasyAccess была подана Helmholtz-Zentrum Berlin в Немецкое ведомство по патентам и товарным знакам с регистрационным номером DE 10 2018 111 478.8. Кроме того, была подана международная патентная заявка по маршруту РСТ с использованием приоритета немецкого патента.

Для успешной кампании CFS жизненно важно придерживаться описанных предварительных условий (см. Введение). Надежная система кристаллизации необходима для воспроизводимого роста многих хорошо дифракционных кристаллов, а в качестве входной апо-модели для автоматизированной очистки необходима хорошо доработанная структура. Также важно проверить, что целевой сайт на белке (активный сайт или область интерфейса) доступен для фрагментов в кристаллической решетке. Крайне важно заранее оптимизировать условия замачивания, чтобы гарантировать, что замачивание не ухудшит качество кристаллов. Пренебрежение этими аспектами, скорее всего, приведет к неоптимальному эксперименту, который будет ограниченно использоваться и в худшем случае потребует повторения всего эксперимента.
Протокол, описанный выше, описывает процедуры, которые соблюдаются во время стандартной кампании CFS. Если все предпосылки выполнены, по крайней мере, 90% всех пропитанных кристаллов должны проявлять дифракцию с высоким разрешением в дифракционном эксперименте. Если это не так, время замачивания может быть сокращено до нескольких часов или даже минут. Из-за хорошей растворимости большинства фрагментов этого должно хватить для получения приличных значений заполняемости. Кроме того, типичная кампания CFS приведет к снижению уровня попаданий примерно на 10% или выше. Для кампаний по проверке F2X-Entry Screen11 и текущих пользовательских кампаний с одной и той же библиотекой наблюдались еще более высокие показатели попадания (20% и выше, данные не показаны).
Общим предостережием скрининга кристаллографических фрагментов является наличие кристаллографических контактных участков. Они могут либо закрывать априори известные активные участки (которые должны быть проверены перед скринингом, см. Выше), либо эти контактные сайты также часто предоставляют карманы и горячие точки, где фрагменты могут связываться. Такие попадания в фрагменты будут артефактами кристаллизации решетки и, скорее всего, не будут связываться с белком в растворе. Эти события, как правило, происходят чаще в экспериментах по замачиванию, чем в экспериментах по кокристаллизации (вероятно, из-за более высоких концентраций фрагментов, используемых в экспериментах по замачиванию). Однако, согласно предыдущему опыту, они, как правило, составляют лишь незначительную часть полученных хитов. Например, в кампании по проверке F2X-Entry Screen с использованием эндотиапепсина (EP) и сплайсеосомального белково-белкового комплекса Prp8RNaseH и Aar2 (AR) большинство попаданий произошло на перспективных участках11. Для ЭП 27 из 37 наблюдаемых событий связывания были расположены в активном центре (т.е. пептидной расщелине этой протеазы). 10 событий дистанционного связывания включают два события связывания, подверженные воздействию растворителя, и восемь событий связывания контакта кристалла (соответствующих пяти уникальным ударам). Исключение этих кристаллических контактных хитов по-прежнему будет отражать общий показатель 24% уникальных хитов для кампании EP. Также важно отметить, что события связывания, удаленные от известного активного сайта (за исключением кристаллических контактных связующих), также могут быть потенциально интересными (например, выявление новых горячих точек или аллостерических участков белка). Для кампании AR (в той же публикации) из 23 наблюдаемых событий связывания семь были расположены в кристаллических контактах, один был расположен на прямой границе раздела двух белков, семь были расположены в известных местах белково-белковых взаимодействий с другими партнерами по связыванию в более широком биологическом контексте (следовательно, различные стадии сборки сплайсеосомы), восемь событий связывания выявили две горячие точки на AR с еще неизвестной функцией и одна, находящаяся на поверхности Prp8RnaseH,открытой растворителем. Таким образом, исключая события в кристаллических контактах и синглтоне Prp8RnaseH, число потенциально полезных событий связывания составляет 15 (что соответствует 14 уникальным ударам), таким образом, коэффициент попадания составляет 15,6%. Эти хиты могут быть отправными точками для разработки модуляторов белково-белкового взаимодействия или для инструментальных соединений, направленных на изучение двух обнаруженных горячих точек Aar2. Взятые вместе, также в соответствии с проводимыми пользовательскими кампаниями, часто только незначительная часть попаданий в скрининг кристаллографических фрагментов должна быть проигнорирована как артефакты. Однако это также будет в значительной степени зависеть от цели.
Если частота попадания значительно ниже, это может указывать на одну из следующих проблем, связанных с целевым белком. Например, в кампании СХУ против вирусной цистеинепротеазы наблюдалась частота попадания только 3% (данные не показаны). Оказалось, что используемый белок, вероятно, был химически модифицирован в своем активном центре. В таком случае другой белковый препарат может решить проблему. Если кристаллы очень непереносимы DMSO, F2X-Entry Screen также может использоваться без DMSO, хотя результаты могут отличаться в некоторой степени. Большинство хитов, полученных в присутствии DMSO, также будут отображаться в его отсутствие. Также будут некоторые попадания, которые нельзя наблюдать в отсутствие ДМСО, хотя их можно наблюдать в его присутствии. И, наконец, будут некоторые, которые появятся только в отсутствие DMSO.
Наиболее серьезная трудность возникает, если белок подвергается индуцированной подгонке при связывании вещества. Скорее всего, кристаллическая решетка не потерпит движения белка и кристаллы распадутся. В таком случае единственным выбором является прибегнуть к кокристаллизации белка и фрагментов. Это, однако, может привести к новым кристаллическим формам. Поэтому большая часть автоматизации всего процесса больше не будет работать эффективно. К счастью, в большинстве кампаний CFS, проводимых в HZB до сих пор, такого рода проблемы не встречались. Может случиться так, что слабое связывание фрагмента, не обеспечивает достаточно энергии, чтобы вызвать движение белка, в частности, если кристаллизована конформация стабилизируется кристаллическими упаковочными силами.
Еще одно серьезное ограничение метода, с которым авторы столкнулись до сих пор, заключается в том, что кристаллизующий коктейль (и, следовательно, раствор для замачивания) содержит летучие соединения. Тогда становится почти невозможным выполнить всю обработку кристаллов осмысленным образом.
Различные белки могут содержать лекарственные участки в большей или меньшей степени. Например, белково-белковые взаимодействия обычно опосредованы расширенными плоскими поверхностями, которые труднее нацеливать. Поэтому скорость связывания фрагментов, вероятно, будет зависеть от структуры молекулярной поверхности белка. В крайнем случае белок может не содержать подходящих поверхностных горячих точек, которые служат целевыми сайтами для связывания фрагментов. Таким образом, несмотря на тщательно проведенный эксперимент, никаких попаданий фрагментов в результате скрининга не будет. Однако авторы до сих пор не сталкивались с такой ситуацией.
В принципе, используя протокол, описанный выше, часть кампании CFS по замачиваю и сбору кристаллов может быть выполнена в любой лаборатории, оборудованной для обработки кристаллов. Это отличает методологию на HZB от других объектов CFS и может быть преимуществом в некоторых случаях. Например, если кристаллы не могут быть легко восстановлены на другом объекте или если путешествие экспериментаторов ограничено (например, в условиях пандемии во всем мире), пользователям HZB предоставляется все оборудование (шайбы, инструменты, рамка EasyAccess, держатели образцов и т. Д.)
Тем не менее, требования к большому количеству держателей образцов и криогенным емкостям хранения по-прежнему более удобно удовлетворяются на специализированных объектах CFS. Кроме того, необходимость сбора многих наборов дифракционных данных решительно выступает за локализацию этих объектов вблизи линий луча, которые ориентированы на высокую пропускную способность выборки. Примерами для этого являются линии пучка I04-1 на Diamond Light Source и связанный с ним объект XChem в Великобритании8,25,линии пучка MASSIF на ESRF во Франции26 или установка FragMAX на лучевой линии BioMAX в MAX IV в Швеции18.
В будущем можно было бы предусмотреть разработку экспериментов с CFS без необходимости обработки кристаллов вообще. Сообщалось о первых достижениях в этом направлении. Например, путем акустического переноса жидкости, позволяющего смешивать как кристаллосодержащие растворы, так и фрагментарные растворы непосредственно на держателях образцов сетчатого типа27. Другой подход был использован для лиганд-скрининга на основе XFEL. В эксперименте с доказательством принципа кристаллическую суспензию готовили в пакетном режиме, а замачивание и сбор дифракционных данных выполняли на кремниевом чипе28с фиксированной мишенью. Однако эти подходы все еще находятся в стадии разработки и далеко не применимы к широкому кругу белковых целей или осуществимы для установок СХУ в качестве рутины.
С протоколом в этой работе были изложены подробные инструкции по успешному проведению кампаний CFS прямо в HZB (и в других местах), а также были даны общие рекомендации и полезные практические советы по подготовке и проведению таких экспериментов с более высокими шансами на успех. В конечном счете, лучшие шансы и показатели успеха при скрининге СХУ в значительной степени способствуют эффективному обеспечению отправных точек для последующей разработки инструментальных соединений или кандидатов на лекарства.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#181;L pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipet, 100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP4861000791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blow dryer</td>
			<td>TH-Geyer</td>
			<td>9.106 788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal containing crystallization plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Contains crystals to be soaked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>various, e.g. 
			M5-L18SP-75LD</td>
			<td>250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyAccess Frame</td>
			<td>HZB</td>
			<td></td>
			<td>The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2X-Entry Screen plate</td>
			<td>HZB</td>
			<td></td>
			<td>Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glas spot plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MARI1406506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>At least a filled up 5 L can</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage can</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magentic crystal wand</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-R-1013198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate</td>
			<td>SwissCI</td>
			<td>3W96TLP-UVP</td>
			<td>For mock-soaked crystals (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EKT6.1</td>
			<td>25 ml volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample tracking template</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. 
			xlsx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>BA825SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil for microtiter plates</td>
			<td>GreinerBioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shelved puck shipping canes (for Unipucks)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-065</td>
			<td>2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soaking solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>At least 5 ml are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soaking solution including cryo-protectant, 150&#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissues&#160;</td>
			<td>Roth (Kimberly Clark Professional)</td>
			<td>AA64.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transport dewar (Whartington dry shipper)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>TW-CX100</td>
			<td>2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck foam dewars with lid</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-022</td>
			<td>two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol 
			if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck starter set</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-UPSK001</td>
			<td>Can be provided by the HZB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipucks</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-021</td>
			<td>14 unipucks; can be provided by the HZB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow and tools for crystallographic fragment screening at the helmholtz-zentrum berlin

Скрининг фрагментов — это метод, который помогает определить перспективные отправные точки для проектирования лигандов. Учитывая, что кристаллы целевого белка доступны и демонстрируют воспроизводимо дифракционные свойства рентгеновского излучения высокого разрешения, кристаллография является одним из наиболее предпочтительных методов скрининга фрагментов из-за его чувствительности. Кроме того, это единственный метод, обеспечивающий подробную 3D-информацию о режиме связывания фрагмента, который жизненно важен для последующей рациональной эволюции соединения. Рутинное использование метода зависит от наличия подходящих библиотек фрагментов, специализированных средств для обработки большого количества образцов, современных синхротронных лучевых линий для быстрых дифракционных измерений и в значительной степени автоматизированных решений для анализа результатов.
Здесь представлен полный практический рабочий процесс и включенные инструменты по проведению скрининга кристаллографических фрагментов (CFS) в Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Предшествуя этому рабочему процессу, условия замачивания кристаллов, а также стратегии сбора данных оптимизируются для воспроизводимых кристаллографических экспериментов. Затем, как правило, в течение одной-двухдневной процедуры, библиотека, ориентированная на CFS, из 96 членов, предоставляемая в виде высушенных готовых к использованию пластин, используется для замачивать 192 кристалла, которые затем индивидуально охлаждаются во флэш-памяти. Окончательные дифракционные эксперименты могут быть выполнены в течение одного дня на роботомонтируемых опорных лучевых линиях BL14.1 и BL14.2 на электронном накопительном кольце BESSY II, управляемом HZB в Берлине-Адлерсхофе (Германия). Обработка кристаллографических данных, уточнение белковых структур и идентификация попаданий происходит быстро и в значительной степени автоматизировано с использованием специализированных программных конвейеров на выделенных серверах, требующих небольшого пользовательского ввода.
Использование рабочего процесса CFS в HZB позволяет проводить рутинные скрининговые эксперименты. Это увеличивает шансы на успешную идентификацию попаданий фрагментов в качестве отправных точек для разработки более мощных связующих веществ, полезных для фармакологических или биохимических применений.

В рамках ранее сообщенных кампаний по валидации F2X-Entry Screen11было проведено три кампании на лучевой линии BioMAX в MAX IV и одна кампания была проведена на лучевой линии BL14.1 в HZB. В последней кампании определенный набор условий F2X-Entry Screen с использованием условия замачивания, который не содержал DMSO, был проверен на белково-белковый комплекс дрожжей Aar2 и RNaseH-подобный домен дрожжей Prp8 (AR). Выбранный набор условий включает в себя хиты, которые были обнаружены в более ранней кампании F2X-Entry Screen против AR в состоянии впитывания, содержащего DMSO11(т.е. в кампании, выполненной на HZB, эти хиты были повторно проверены в отсутствие DMSO). На рисунке 7 показан обзор обращений, полученных после анализа данных с помощью комбинации FragMAXapp XDSAPP для обработки, fspipeline для автоматического уточнения и последующего поиска хитов с помощью PanDDA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig01.jpg"> Рисунок 1:Схематическое представление рабочего процесса эксперимента по скринингу кристаллографических фрагментов (CFS) с акцентом на специальную среду в Helmholtz-Zentrum Berlin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig02.jpg"> Рисунок 2:Рецептура и упаковка экрана F2X-Entry. Экран из 96 составов доступен на 3-линзовой 96-скважинной низкопрофильной пластине MRC, герметичной фольгой и вакуумной упаковкой. 96 соединений экрана сушат из растворов ДМСО в двух из трех линз каждой скважины. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig03.jpg"> Рисунок 3:Фотосъемка верстака CFS в лаборатории подготовки HZB. Показаны сборки необходимых инструментов для замачивания А)и для В)заготовки кристаллов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig04.jpg"> Рисунок 4:Конечные станции сбора данных и управляю программное обеспечение. A) Фотография экспериментального хутча лучевых линий HZB-MX BL14.1 (слева) и BL14.2(справа) 15. B) Снимок экрана интерфейса управления экспериментом MXCuBE216, используемого в BL14.1 для сбора дифракционных данных. В BL14.2 используется очень похожий интерфейс. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>  
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig05.jpg"> Рисунок 5:Фотографические снимки некоторых кристаллических образцов в криогенной среде перед сбором данных. Это иллюстрирует изменчивость морфологии кристаллов после выполнения замачивания фрагментов и сбора кристаллов. Фотографии были сделаны на лучевой линии BioMAX (синхротрон MAX IV, Лунд, Швеция) для образцов AR, собранных там в рамках проверки F2X-Entry Screen11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig06.jpg"> Рисунок 6:Скриншот FragMaxApp18, установленного на HZB для удобного анализа данных. Более подробная информация в Lima et al., FragMAXapp, неопубликованные данные. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62208/62208fig07.jpg"> Рисунок 7:Обзор результатов кампании CFS F2X-Entry vs. AR (без DMSO). Белковый комплекс AR показан в мультяшном виде, с Aar2, окрашенным в серый цвет, и RNaseH-подобным доменом Prp8, окрашенным в синий. Фрагмент хитов кампании окрашен в цвета элементов (C - желтый, O - красный, N - синий, S - оранжевый, Cl - светло-голубой). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/62208fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительная информация. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin at JoVE.com

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Скрининг кристаллографических фрагментов в Helmholtz-Zentrum Berlin выполняется с использованием рабочего процесса с выделенными библиотеками соединений, инструментами обработки кристаллов, быстрыми средствами сбора данных и в значительной степени автоматизированным анализом данных. Представленный протокол направлен на максимизацию результатов таких экспериментов, чтобы обеспечить многообещающие отправные точки для проектирования лигандов на основе структуры.

Рабочий процесс и инструменты для скрининга кристаллографических фрагментов в Берлинском центре Гельмгольца

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

Скрининг более мелких органических соединений, называемых фрагментами, с использованием рентгеновской кристаллографии является эффективным методом идентификации молекул, которые являются отправными точками для открытия лекарств или разработки биохимических соединений. Скрининг кристаллографических фрагментов выявил не только идентичность, но и где и как фрагменты связываются на поверхности исследуемого белка. Этот метод может быть использован на каждой биохимической или медицинской значимой белковой мишени, для которой могут быть выращены подходящие кристаллы белка.Качество результатов тесно связано с качеством обработки образцов. Мы считаем, что следующая визуальная демонстрация поможет исследователям провести высококачественные эксперименты. Продемонстрировать процедуру будет Татьяна Бартель, докторант и аспирант в моей лаборатории.Для начала отрежьте мешок просеиваемой пластины, предварительно нагретой до комнатной температуры, затем снимите крышку и фольгу с просеиваемой пластины. Замачить пятимиллилитровой раствор для замачивания в резервуар реагента. Затем заполните каждый из 96 резервуаров пластины 40 микролитрами раствора для замачивания с помощью 12-канальной пипетки.Поместите рамку легкого доступа поверх экранной пластины и закрепите ее прилагаемыми зажимами, сдвинув их на левую и правую стороны устройства. Поместите просеивательную пластину и рамку с легким доступом под микроскоп и скольжьте первый колодец, переместив соответствующую плитку из акрилового стекла рамы. Добавьте 0,4 микролитра раствора для замачивания из резервуара к фрагменту, содержащему хорошо, используя свежий наконечник пипетки.Убедитесь, что капля покрывает высохший фрагмент. Поместите кристаллизационную пластину, содержащую самые крупные кристаллы, под второй микроскоп и разрежьте уплотнительную фольгу в одной из скважин. Используя петлю соответствующего размера, перенесите кристалл в колодец просеивающего листа под первым микроскопом.Вымойте петлю в подготовленной стеклянной точечной пластине, затем высушите ее, осторожно прикоснувшись к ткани. Делайте это после каждой переноски, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Используйте микроскоп, чтобы убедиться, что кристалл был правильно размещен.Повторите процедуру для второго кристалла. Переходите к следующей скважине и повторяйте процедуру для всех оставшихся скважин. После того, как кристаллы были перенесены во все 96 скважин в просеивающей пластине, снимите просеиваемую пластину вместе с рамкой легкодоступного доступа из-под микроскопа и поместите ее на скамейку или стол.Затем снимите рамку легкого доступа с просеивающей пластины, запечатайте просеивающую пластину уплотнительной пленкой и поместите ее в кристаллизационный инкубатор или шкаф для инкубации для ранее оптимизированного времени замачивания. Достаточно двух часов инкубации, но ночь может быть удобнее. Приготовьте пену Unipuck Dewar с тремя крышками Unipuck и наполовину заполните ее жидким азотом, держа на земле.Переместите наполовину заполненного Дьюара на скамейку запасных, и заполните ее полностью до самого края. Держите его заполненным до верхнего края в течение всего эксперимента и часто заменяйте жидкий азот. Извлеките просеивательную пластину из инкубатора и снимите фольгу.Поместите рамку легкого доступа сверху. Сдвиньте первый колодец. Извлеките один кристалл из капли и охладите его в жидком азоте, погружаясь быстрым вертикальным движением.Вставьте образец в правильное положение шайбы и сделайте соответствующие заметки на листе отслеживания образца. Повторите процедуру для второго кристалла. Подойдите к следующему колодец и повторяйте позиционирование других кристаллов до тех пор, пока все три шайбы не будут заполнены.Предварительно охладите основания Unipuck жидким азотом и добавьте их поверх крышек. Храните Унипуков в стеллаже для хранения в транспорте Дьюара или хранилище Дьюара. Храните их в жидком азоте при криогенных температурах до измерения.Повторите ту же процедуру сбора и хранения кристаллов в Unipucks для оставшихся образцов в просеивающей пластине. Здесь показана изменчивость кристаллической морфологии после выполнения замачивания фрагментов и сбора кристаллов. Были включены даже кристаллы, которые выглядят несколько испорченными, поскольку они все еще приводят к полезным данным.Данные были собраны на линиях луча 14.1 и 14.2 на синхротроне BESSY II. Для каждого образца осуществлялся сбор дифракционных данных. Данные были проанализированы с использованием FragMAXapp, сосредоточив внимание на комбинации XDSAPP для обработки, fspipeline для уточнения структуры и PenDA для поиска попаданий.Это привело к 15 ударам по белковым комплексу AR с использованием условия свободного замачивания DMSO. В предыдущей кампании экрана входа F2X против той же цели, включая DMSO в состоянии впитывания, было обнаружено 20 попаданий. Это означает, что 75% обращений могут быть идентифицированы, если DMSO опущен.Для успеха эксперимента крайне важно, чтобы кристаллы обрабатывались правильно и осторожно на каждом этапе процедуры. Скрининг кристаллографических фрагментов превратился в широко используемый метод, который часто применяется в академических кругах и в фармацевтической промышленности.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

В режиме реального времени отслеживание разделения фрагментов ДНК с помощью смартфона

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Скрининг фрагментов на основе ЯМР в режиме минимальной выборки, но максимальной автоматизации

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Нанодиафродная сканирующая флуориметрия для скрининга при обнаружении свинца на основе фрагментов

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Оптический пинцет для изучения РНК-белковых взаимодействий в регуляции трансляции

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Использование флуоресценции с временным разрешением, вызванного белком, для идентификации стабильных локальных конформаций по одному мономеру синуклеина α за раз

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...