Name: in vivo measurement of knee extensor muscle function in mice
Uploaded: 2021-03-04T14:30:00
Duration: 8 min 29 s
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Gostaríamos de agradecer a Rosario Maroto pela assistência técnica. A pesquisa relatada nesta publicação contou com o apoio do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticos e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R01 AR072061 (CSF). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Kentucky.
1. Configuração do equipamento
<ol><li>Confirme se as máquinas estão conectadas de acordo com as especificações do fabricante.</li>
	<li>Se ainda não estiver no local, conecte o motor 300D-305C-FP com aparelho de extensão do joelho à plataforma animal 809C.</li>
	<li>Ligue a bomba de água a 37 °C para começar a aquecer a plataforma.</li>
	<li>Se o computador ainda não estiver ligado, ligue o computador, seguido pelo Estimulador bi-fase de alta potência e pelo sistema de alavanca de modo dual de 2 canais.</li>
	<li>Despeje isoflurane em vaporizador para a linha máxima de enchimento.</li>
</ol>2. Configuração do software
<ol><li>Abra o software (detalhes fornecidos na Tabela de Materiais).</li>
	<li>Para usar o recurso de estimulação instantânea em conjunto com o Live Data Monitor para otimizar a colocação do teste (etapa 4), selecione Preparar experimento seguido de Configurar Instant Stim (Figura 1). Defina a Frequência de Pulso (Hz) como 125, Largura de Pulso (ms) como 0,2, Número de Pulsos como 1, Frequência de Trem (Hz) como 0,5 e Tempo de Execução (s) como 120.</li>
	<li>Selecione arquivo e abra o Live Data Monitor.</li>
	<li>Para realizar experimentos de contração (passo 5) e frequência de torque (Passo 6), selecione um estudo previamente programado que inclui experimentos apropriados de duração de torque de contração e extensão do joelho (detalhados abaixo na etapa 5 e na etapa 6).<ol>
<li>Selecione o mouse experimental apropriado ou Adicione o Novo Animal e as informações correspondentes de entrada do mouse a serem armazenadas com dados de torque.</li>
		<li>Selecione Next Experiment ou Previous Experiment para transição do protocolo de contração para a sequência de frequência de torque.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Configuração do mouse
<ol><li>Coloque o rato individual na câmara anestésico.</li>
	<li>Solte a válvula do tanque de oxigênio e ajuste a vazão de oxigênio em 1 L/min com isoflurane de 2,5%.</li>
	<li>Certifique-se de que o mouse permaneça na câmara com a tampa bem fechada até ficar completamente inconsciente. Confirme a perda completa da consciência por falta de reflexo do pé com beliscão do dedo do pé.</li>
	<li>Coloque o rato anestesiado em uma posição supina com a cabeça no nariz na plataforma aquecida com taxa de fluxo de oxigênio a 1 L/min com isoflurane de 2,5%.</li>
	<li>Raspe o cabelo do membro traseiro direito usando cortadores elétricos. Remova o cabelo da área raspada com um lenço de álcool e um pequeno vácuo. Limpe o cabelo removido do membro traseiro e da plataforma.</li>
	<li>Fixar firmemente o membro traseiro superior, posterior ao joelho(Figura 2). NOTA: Certifique-se de que a amplitude de movimento do joelho não está impedida.</li>
	<li>Coloque o membro inferior traseiro no aparelho de extensão do joelho com a tíbia anterior tocando levemente a peça de plástico ajustável (a leitura do canal Força no canal deve ser lida entre 0 e -1,0 mN*m). Dependendo do tamanho do membro traseiro inferior do mouse, a fita cirúrgica pode ser enrolada na parte inferior da peça de plástico ajustável para permitir que a perna descanse com segurança. NOTA: Imagens detalhadas e dimensões da peça de plástico fabricada sob medida são mostradas na Figura Suplementar 1.</li>
	<li>Ajuste os botões na plataforma para garantir que o joelho esteja dobrado a 60°.</li>
	<li>Coloque levemente um pedaço de fita sobre o tronco do mouse sobre a plataforma para evitar movimento compensatório com extensão máxima do joelho.</li>
</ol>4. Colocação de eletrodos
<ol><li>Coloque eletrodos subcutâneamente 2-4 mm proximal ao joelho diretamente acima dos músculos extensores quadríceps/joelho(Figura 2). Os eletrodos devem ter aproximadamente 1-2 mm de distância.</li>
	<li>Para determinar a colocação ideal de eletrodos, utilize a função de Estimulação Instantânea com monitor de dados ao vivo. Ajuste amperagem/corrente a 50 mA para repetidas contrações para confirmar a extensão do joelho (os extensores do joelho produzirão uma curva de contração negativa). Ajuste as sondas durante a estimulação instantânea para obter o torque máximo de extensão do joelho, medido na janela Live Data Monitor. NOTA: A Figura 3 mostra uma saída de estimulação instantânea representativa, confirmando a extensão do joelho. Vídeo suplementar 1 e Vídeo Suplementar 2 mostram em tempo real e em câmera lenta as contrações extensoras do joelho sem o braço do motor no lugar, permitindo a confirmação visual da extensão do joelho.</li>
	<li>Durante as repetidas mudanças com estimulação instantânea,palpate os músculos flexores do joelho com o dedo indicador para confirmar nenhuma ativação dos músculos antagonistas. Para estimular ao máximo os extensores do joelho, o reposicionamento da sonda pode ser necessário dependendo da composição corporal do camundongo e pequenas diferenças anatômicas na localização exata do ponto motor do nervo femoral e dos músculos extensores do joelho. NOTA: Um ponto motor muscular é o local onde o ramo motor de um nervo entra na barriga muscular e é o ponto com menor resistência à condutividade elétrica e, posteriormente, a maior resposta à estimulação elétrica14,15. Em aplicações clínicas utilizando estimulação elétrica, este ponto é identificado pela varredura com um eletrodo de caneta para encontrar a localização acima do músculo em que ocorre uma contração muscular com a menor corrente injetada14,15. A identificação do ponto motor muscular é essencial para facilitar a estimulação elétrica neuromuscular ideal15. Em ensaios clínicos em humanos, foram identificados pontos motores musculares para músculos quadríceps na metade distal do músculo14. Para alcançar a estimulação ideal do extensor do joelho em camundongos, esta técnica foi recapitulada usando colocação de eletrodo com Estimulação Instantânea para locais de ponto motor muscular mais próximos normalmente encontrados na metade distal dos extensores do joelho. Existe alguma variabilidade na colocação de eletrodos (de relativamente superficial a profundo) que resulta em torque máximo, e a função de Estimulação Instantânea facilita a colocação ideal do eletrodo.</li>
</ol>5. Determinação da corrente ideal
<ol><li>Uma vez determinada a colocação ideal da sonda, realize uma série de contrações progressivas para determinar a amperagem/corrente ideal a ser usada para o experimento de frequência de torque, com o objetivo de determinar a corrente mais baixa para alcançar a saída máxima de torque do contração. Comece com o conjunto atual em 50 mA e selecione Executar experimento para produzir uma única contração. Selecione Analisar resultados para exibir a saída de torque. Registre o torque de contração exibido sob Max Force com a linha de base subtraída. NOTA: Selecione a opção de inverter o canal Force para converter medidas de torque negativo para positivo.</li>
	<li>Aumente a corrente para 60-70 mA e repita o experimento do twitch. Registre o torque de contração exibido sob Max Force com a linha de base subtraída.</li>
	<li>Continue com uma série de experimentos de contração desta maneira (aumentando aproximadamente 10-20 mA a cada progressão) até que o torque de contração não aumente mais (ou planaltos ou comece a diminuir). Exemplo da série twitch é mostrado na Tabela 1.</li>
	<li>Registre a menor corrente em que o maior torque de contração foi alcançado. Esta corrente será usada e permanecerá constante durante o próximo experimento de frequência de força. A Figura 4 mostra um pico representativo de contração.</li>
</ol>6. Experimento de frequência de torque para determinar o pico de torque tetanico isométrico
<ol><li>No software (ver Tabela de Materiais),selecione o experimento pré-programado de frequência de torque para extensão do joelho, garantindo a seguinte configuração. Duração do estímulo: 0,35 s, Sequência de frequência: 10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz, Período de descanso entre pulsos/contrações: 120 s NOTA: A taxa de amostragem é de 10.000 Hz (configuração padrão).</li>
	<li>
Executar experimento, Analisar resultadose registrar manualmente o torque exibido sob Max Force com linha de base subtraída (certifique-se de que o canal de força está invertido, pois a contração extensor do joelho produzirá torque negativo) em cada frequência. Note o maior valor Max Force como o pico de torque tetanico isométrico. Exemplo de dados de frequência de torque é mostrado na Tabela 2 e Figura 5 mostra uma curva de tétano representativa para o pico de potência de torque tetanic de pico alcançado a 120 Hz.</li>
</ol>7. Término do experimento
<ol><li>Após a conclusão do experimento de frequência de torque, realize um seguimento e compare com o pico inicial de contração na mesma corrente para avaliar danos/fadiga. NOTA: Em alguns modelos de lesão e doença, é esperado aumento da gordoidade do músculo esquelético e não constitui um problema com a configuração experimental ou o camundongo.</li>
	<li>Quando todas as medidas de torque estiverem concluídas, remova suavemente as sondas de eletrodos e despresece o joelho.</li>
	<li>Desligue isoflurane e remova o mouse do cone do nariz.</li>
	<li>Coloque o mouse de volta em uma gaiola apropriada colocada em cima de uma almofada de aquecimento. Monitore enquanto o rato se recupera e recupera a consciência. NOTA: O mouse deve estar consciente e se movendo dentro de 2-3 min.</li>
</ol>8. Análise de dados
<ol><li>Extrair dados após o experimento a partir de software de análise (ver Tabela de Materiais).<ol>
<li>Software de análise aberta.</li>
		<li>Selecione Obter dados do software.</li>
		<li>Selecione Data em qual experimento foi realizado e código de mouse apropriado.</li>
		<li>Selecione a frequência de interesse (todos os experimentos de contração e cada frequência do experimento de frequência de torque será listado).</li>
		<li>Selecione Análise muscular.</li>
		<li>Confirme se a correção da linha de base de uso está verificada. NOTA: O torque da linha de base é calculado pelo software como a média dos primeiros 100 pontos amostrados e subtraídos do valor máximo absoluto de torque.</li>
		<li>Registo o valor do torque listado no Máximo. NOTA: Os dados aqui apresentados não são filtrados; no entanto, um filtro pode ser selecionado no software, se desejar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativamente, conforme descrito acima na etapa 6.2, registe a saída de torque exibida sob Max Force em tempo real em cada ponto/contração de frequência de torque através da janela Analisar resultados.<ol>
<li>Confirme se a linha de base está subtraída, e o canal de força está invertido.</li>
		<li>Dados de entrada em uma planilha para cálculos de normalização do peso corporal (torque/peso corporal em gramas) e gráficos e análises estatísticas de interesse. O software estatístico foi utilizado para fins de gráfico de curvas de frequência de torque e área de cálculo sob a curva. NOTA: Os dados de torque são medidos em mN.m (milliNewton.meters).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para gerar curvas de tétano, exporte dados completos de cada frequência a partir do software de análise.<ol>
<li>Repetição de passos 8.1.1-8.1.4 acima.</li>
		<li>Selecione dados de exportação.</li>
		<li>Selecione Dados Filtrados brutos e salve no local de escolha. O MATLAB pode ser usado para gerar curvas de tétano a partir do arquivo de texto exportado e/ou para análise posterior. NOTA: O código MATLAB para gerar curva de tétano a partir do arquivo de texto está disponível mediante solicitação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Calibração do sistema de alavanca de modo duplo
<ol><li>Calibrar o sistema antes do uso inicial para garantir dados precisos e confiáveis e repetir a calibração periodicamente usando o software de coleta de dados e pesos conhecidos.<ol>
<li>Software de coleta de dados aberto.</li>
		<li>Clique na guia Configuração e selecione Configuração do canal.</li>
		<li>Selecione 305C-FP listado em Meus Instrumentos.</li>
		<li>Clique em Calibrar selecionado para abrir a janela Editor de Calibração.</li>
		<li>Para calibrar o comprimento, insira uma série de tensões de teste, incluindo tensões negativas e positivas (por exemplo, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 V).<ol>
<li>Clique em Definir para a primeira linha.</li>
			<li>Clique em Ler.</li>
			<li>Meça o comprimento exato do braço da alavanca em milímetros e insira na caixa correspondente.</li>
			<li>Repita para a próxima tensão.</li>
			<li>Após o registro de todas as tensões, clique em Calcular Fatores cal (gravado em mm/volt).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para calibrar a força, utilize um conjunto de pesos conhecidos aumentando em uma progressão linear.<ol>
<li>Ajuste o motor para que ele esteja descansando na borda do banco ou na mesa com o braço da alavanca paralelo ao banco e pendurado sobre a borda para permitir que o peso fique pendurado.</li>
			<li>Pendure o primeiro peso do braço da alavanca usando um elástico. Sob Força Aplicada,digite o peso conhecido em gramas contabilizando a massa do elástico.</li>
			<li>Selecione Ler.</li>
			<li>Repita por pelo menos 3 pesos conhecidos.</li>
			<li>Selecione Calcular fator cal.</li>
			<li>Para verificar o cálculo, os dados de calibração do plot e o ajuste da curva se encaixam selecionando Plot Cal.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para calibrar a força, digite tensões de calibração (até 10 volts)<ol>
<li>Clique em Definir diretamente ao lado da tensão de calibração.</li>
			<li>Repita para cada linha de tensão.</li>
			<li>Aplique suavemente pressão no braço da alavanca usando um dedo até que a Saída de Força pare de mudar e o braço do motor comece a se mover.</li>
			<li>Mantenha essa posição. Selecione Ler.</li>
			<li>Repita para cada linha de tensão.</li>
			<li>Selecione Calcular fator cal.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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E., Romaniello, W. T., Soscia, S. M., Arrigo, C. A., Andrews, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+subjective+knee+scores,+isokinetic+testing,+and+functional+testing+in+the+ACL-reconstructed+knee.">The relationship between subjective knee scores, isokinetic testing, and functional testing in the ACL-reconstructed knee.</a> Journal of Orthopedic Sports and Physical Therapy. 20 (2), 60-73 (1994).</li><li>Bobowik, P., Wiszomirska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+dependence+of+muscle+strength+measurements+and+the+risk+of+falls+in+the+elderly.">Diagnostic dependence of muscle strength measurements and the risk of falls in the elderly.</a> Internation Journal of Rehabilitation Research. 43 (4), 330-336 (2020).</li></ol>

Matthew Borkowski é empregado da Aurora Scientific Inc., uma empresa que pode potencialmente se beneficiar dos resultados da pesquisa e também é um executivo da empresa.

A medição e análise da função muscular em modelos de roedores é imprescindível para fazer inferências translacionais e significativas em relação às adaptações musculares esqueléticas histológicas e moleculares observadas com exercício, lesão, doença e tratamento terapêutico. Demonstramos um método para avaliar a força máxima do extensor do joelho de forma confiável e repetida em camundongos usando equipamentos disponíveis comercialmente, com a peça de plástico ajustável para segurar o membro traseiro inferior na tíbia anterior sendo a única parte fabricada sob medida que pode ser replicada.
Ferramentas de avaliação funcional comuns têm sido amplamente utilizadas para avaliar repetidamente o desempenho físico dentro do mesmo mouse, como esteira correndo para fadiga volicional, teste de desempenho rotarod, teste de aderência invertido e teste de força de aderência. No entanto, embora informativas, essas avaliações envolvem componentes cardiopulmonares e comportamentais, que podem ofuscar o interrogatório da função neuromuscular associada a essas medidas de desempenho físico. Além disso, elementos de resistência, coordenação e equilíbrio estão presentes em muitas dessas avaliações funcionais a níveis variados, limitando a interpretação clara em relação à força muscular. A capacidade de produção de força dos músculos roedores pode ser medida in vitro, in situ ou in vivo. Cada abordagem tem vantagens e limitações relativas. Especificamente, com avaliação in vitro, o músculo é completamente isolado e removido do corpo do animal para que não haja influência da perfusão ou inervação19. Isso produz um ambiente bem controlado para verificar a capacidade contratil, mas limita o tamanho do músculo que está sendo estudado através da dependência da difusão passiva de oxigênio e nutrientes durante os testes. O teste in situ mantém a inervação e o suprimento sanguíneo do músculo, mas limita-se a uma avaliação terminal singular, como no teste in vitro20. Finalmente, o teste in vivo é o menos invasivo com o músculo permanecendo em seu ambiente nativo com eletrodos percutâneos inseridos perto do nervo motor para estimular eletricamente o músculo. Uma força da abordagem in vivo é o potencial para testes longitudinais ao longo do tempo21,22,23.
A avaliação in vivo da contratude muscular de pico mede a força máxima, pois a anatomia normal e a fisiologia do camundongo permanecem intactas e o método pode ser repetido no mesmo camundongo antes e depois de uma intervenção ou ao longo da vida útil. Especificamente, a medição in vivo da força extensora do joelho em camundongos é a avaliação de força murina com maior relevância translacional para estudos humanos, uma vez que o torque máximo de extensão do joelho é comumente medido e considerado o teste de força padrão-ouro em humanos com correlação com vários desfechos funcionais e de saúde24,25,26,27 . Além disso, a patologia extensora do joelho é observada com o envelhecimento, bem como uma miríade de lesões e doenças1,2,4,5,6, mas avaliar o impacto dessas condições na força extensor do joelho longitudinalmente em camundongos não tem sido facilmente alcançável.
Embora este método ofereça utilidade para determinar o torque máximo do extensor de joelho de forma longitudinal, certas limitações do protocolo devem ser consideradas. Frequências mais baixas entre 40 Hz e 120 Hz foram omitidas do protocolo de frequência de torque, o que pode limitar a capacidade de detectar mudanças esquerda ou para a direita na curva de frequência de torque com lesão ou doença. No entanto, utilizando este protocolo de frequência de torque, conseguimos detectar alterações no pico do torque tetanic em um modelo de lesão da LCA e entre camundongos do tipo selvagem C56BL/6 e um modelo de rato transgênico de massa muscular suprafisiológica(Figura 8). Notamos que pode ser benéfico fixar os eletrodos com mãos auxiliares ou aparelhos similares, pois contrações musculares podem mover eletrodos ligeiramente. Não notamos nenhum deslocamento óbvio de eletrodos com contrações progressivas; no entanto, a possibilidade de um leve movimento dos eletrodos não pode ser descartada, o que pode impactar a estimulação muscular. Além disso, a eletromistografia intramuscular (EMG) não foi realizada em conjunto com o protocolo de estímulo; no entanto, a inclusão das medidas emg pode ser viável, se desejar e adequada para o modelo experimental de interesse.
A avaliação da força extensora do joelho em modelos murinos de lesão ortopédica e doença facilitará a pesquisa pré-clínica com relevância translacional significativa para medidas de força clínica. Nosso protocolo permite uma avaliação precisa e repetida da força máxima do extensor de joelho em camundongos com equipamentos comercialmente disponíveis acessíveis a qualquer laboratório.

O músculo esquelético é um tecido altamente adaptável com alterações compensatórias na massa e estrutura em resposta a uma miríade de estímulos, como exercício, nutrição, lesão, doença, envelhecimento e desuso. Muitos estudos que investigam a adaptação muscular esquelética em humanos empregam métodos para medir tanto o tamanho do músculo esquelético quanto o impacto na função, já que avaliações de força padrão-ouro são facilmente repetíveis em indivíduos humanos.
Especificamente, extensor de joelho e força flexora são mais avaliados em pesquisas clínicas. Alterações na força extensora do joelho têm sido amplamente relatadas em estudos humanos de envelhecimento, exercício, lesão ortopédica, osteoartrite do joelho, doença crônica e desuso1,2,3,4,5,6,7. No entanto, os métodos para analisar repetida e não invasivamente a força do músculo extensor do joelho (quadríceps) em estudos de roedores mecanicistas têm sido relativamente limitados. Foi desenvolvido anteriormente um método para determinar a contração muscular do quadríceps in vivo emratos; no entanto, é necessária uma construção extensiva de equipamentos não disponíveis comercialmente. Dada a amplitude dos modelos de roedores desenvolvidos para estudar os desfechos musculoesqueléticos após lesão do joelho/osteoartrite9,10,11,12,13 existe a necessidade de avaliação não invasiva da força do quadríceps.
Além disso, estudos de roedores que investigam mecanismos moleculares que sustentam a adaptação muscular esquelética muitas vezes utilizam modelos de camundongos devido à simplicidade da modificação genética, assim como muitos estudos de intervenção farmacológica devido à diminuição das despesas financeiras associadas à menor dosagem de uma droga em camundongos em comparação com ratos. Relatamos um método não invasivo para medir repetidamente a função extensor de joelho in vivo no mesmo mouse ao longo do tempo usando equipamentos disponíveis comercialmente com pequenas modificações, facilitando a reprodutibilidade entre diferentes laboratórios e fornecendo comparação mais direta com os resultados da força humana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1300A: 3-in-1 Whole Animal System- Mouse</td>
			<td>Aurora Scientific Incorporated</td>
			<td>300D-305C-FP: dual-mode motor with custom knee extension apparatus, 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System, 701C: Electrical Stimulator, 809C: in-situ Mouse Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6100 Dynamic Muscle Control LabBook software</td>
			<td>Aurora Scientific Incorporated</td>
			<td>DMC v6.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>611A Dynamic Muscle Analysis</td>
			<td>Aurora Scientific Incorporated</td>
			<td>DMA v5.501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BravMini hair clippers</td>
			<td>Wahl Clipper Corporation</td>
			<td>ASIN: B00IN24ILE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Lube</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td>Item Number: 142422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>NDC: 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System</td>
			<td>VetEquip Inhalation Anesthesia Systems</td>
			<td>Item Number: 901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad Software, LLC</td>
			<td>Version 8.3.0 (328)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo measurement of knee extensor muscle function in mice

A plasticidade muscular esquelética em resposta a inúmeras condições e estímulos media a adaptação funcional simultânea, tanto negativa quanto positiva. Na clínica e no laboratório de pesquisa, a força muscular máxima é amplamente medida longitudinalmente em humanos, com musculatura extensora do joelho o resultado funcional mais relatado. A patologia do complexo muscular extensor do joelho está bem documentada no envelhecimento, lesão ortopédica, doença e desuso; a força extensor do joelho está intimamente relacionada à capacidade funcional e ao risco de lesão, ressaltando a importância de uma medição confiável da força extensora do joelho. Avaliação repetível e in vivo da força extensora do joelho em estudos pré-clínicos de roedores oferece pontos finais funcionais valiosos para estudos que exploram osteoartrite ou lesão no joelho. Relatamos um protocolo in vivo e não invasivo para medir repetidamente o torque tetanico de pico isométrico dos extensores do joelho em camundongos ao longo do tempo. Demonstramos consistência usando este novo método para medir a força extensor do joelho com avaliação repetida em vários camundongos produzindo resultados semelhantes.

A curva de frequência de torque utiliza frequências mais baixas para produzir múltiplas contrações isométricas isoladas de torque relativamente baixo e progride através de frequências cada vez mais altas, resultando em fusão de interruptores para uma contração de tétano isométrico na qual o torque tetanic de pico é obtido. O protocolo apresentado para o torque tetanic de extensão do joelho a curva de frequência de força inicia a 10 Hz, o que provoca 3 interruptores isolados. A fusão parcial dos interruptores ocorre a 40 Hz, e o torque tetanic máximo é atingido entre 120-180 Hz(Figura 5).
A Figura 6 ilustra curvas representativas de extensão do joelho de comprimento de torque-frequência de camundongos C57BL/6. Três camundongos separados foram testados na linha de base, e o experimento foi repetido em cada rato 2 semanas depois para comparação para avaliar a reprodutibilidade. As curvas de frequência de torque são mostradas com valores de torque bruto(Figura 6A),bem como valores de torque bruto normalizados para o peso corporal do mouse(Figura 6B). Observações repetidas demonstram resultados comparáveis em todos os 3 camundongos com um período de descanso de 2 semanas entre experimentos. Os dados de torque normalizado do peso corporal devem ser considerados além do torque bruto, pois a menor flutuação de peso pode impactar a saída funcional e não é considerada apenas com torque bruto. Além disso, os dados de torque normalizados do peso corporal facilitam a comparação de ratos de tamanhos variados. O torque também pode ser normalizado para o peso úmido muscular ou a área transversal de miofibra, como já mostramos anteriormente16.
A Figura 7A mostra a área sob a curva usando dados de torque isométrico normalizados do peso corporal a partir de experimentos completos de frequência de torque (10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz) para 4 camundongos C57BL/6 separados, destacando saída total de torque semelhante e coeficientes de variação entre 5,6% e 8,8% com experimentos repetidos dentro dos mesmos camundongos. Os dados são mais simplesmente relatados como torque tetanic de pico(Figura 7B), que é o valor máximo do torque das repetidas contrações isométricas de tétano de 120-200 Hz. O pico de potência de torque tetanic é comparável em camundongos C57BL/6 fêmeas de 6-8 meses de idade(Figura 7B) com coeficientes de variação entre 4,8% e 8,7% com avaliação longitudinal dentro dos mesmos camundongos. O torque tetanic de pico é mais comparável à avaliação de força padrão-ouro em estudos humanos: toque toquemétrico máximo.
Além disso, o protocolo de torque tetanic de pico extensor de joelho é uma ferramenta útil para detectar diferenças de resistência em vários modelos de mouse. A Figura 8 demonstra o contraste acentuado entre a força extensora do joelho em um camundongo fêmea C57BL/6 de 6 meses de idade (linha preta) e um modelo transgênico de hipertrofia suprafisiológica em que a miostatina/GDF8 é eliminada (linha azul). Também mostramos uma curva de tétano de pico de um rato C57BL/6 7 dias após a transeção cirúrgica do ligamento cruzado anterior (ACL-T) (linha vermelha), demonstrando um declínio de quase 50% no torque máximo após lesão que está bem fora dos coeficientes de variação observados com testes repetidos de camundongos não feridos. Simultâneo com os dados humanos17,18, a força é marcadamente diminuída com a ACL-T. Todos os camundongos são do sexo feminino e de idade semelhante (6-8 meses).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Experimento twitch</td>
			<td>Amperagem/Corrente (mA)</td>
			<td>Torque (mN•m)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>1.279</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>70</td>
			<td>1.341</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>90</td>
			<td>1.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>110</td>
			<td>1.362</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>*130</td>
			<td>1.449</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>150</td>
			<td>1.436</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>140</td>
			<td>1.333</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Exemplo da série Twitch. * denota a amperagem/corrente ideal.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Frequência (Hz)</td>
			<td>Torque(mN•m)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>1.385</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>1.869</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>*18.765</td>
		</tr>
<tr>
<td>150</td>
			<td>18.375</td>
		</tr>
<tr>
<td>180</td>
			<td>17.97</td>
		</tr>
<tr>
<td>200</td>
			<td>17.548</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Exemplo de dados de curva de frequência de torque. * denota o pico de torque tetanic.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig01.jpg"> Figura 1: Configuração do software de coleta de dados. Ilustração da configuração para software de coleta de dados com o Live Data Monitor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig2v2.jpg"> Figura 2: Configuração do mouse e colocação de eletrodos. (A-B) Posição supina do mouse recebendo anestesia através de um cone de nariz na plataforma aquecida. O membro traseiro superior é fixado com segurança, posterior ao joelho para permitir um movimento irrestrito na articulação do joelho. O braço do motor é ajustado para que o joelho seja dobrado em aproximadamente 60°. O ponto motor do nervo femoral é estimulado por eletrodos de agulha para ativar a contração de extensores do joelho. A configuração do mouse é mostrada a partir de uma vista lateral (A) e vista aérea(B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig03.jpg"> Figura 3: Determinação da colocação ideal do eletrodo para alcançar extensão isométrica do joelho. Representação de repetidas contrações negativas estimuladas com 50 mA usando a função estimulação instantânea e visualizadas no Monitor de Dados Ao Vivo. As setas vermelhas indicam as três primeiras mudanças de extensão do joelho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig04.jpg"> Figura 4: Twitch representativa para determinar a amperagem ideal. A menor amperagem para obter o maior torque isométrico de contração deve ser determinada para o experimento de frequência de força por repetidos experimentos de contração com amperagem progressivamente aumentada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig05.jpg"> Figura 5: Curvas representativas de torque tetanic ao longo de um experimento de frequência de torque para o mesmo mouse. (A) Torque tetamétrico submaximal produzido a 10 Hz. (B) Torque tetanic isométrico submaximal a 40 Hz. (C) Pico de torque tetanic a 120 Hz. (D) Torque tetanic isométrico a 150 Hz. (E) Torque tetanic isométrico a 180 Hz.(F) Torque tetanic isométrico a 200 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig05large.jpg" target="_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig06.jpg"> Figura 6: Dados de curva de frequência de torque representativo. (A-B). Curva de frequência de torque em 2 pontos de tempo diferentes (semana 1 e 3) em 3 camundongos separados, apresentados como torque de pico bruto(A) e torque de pico bruto normalizado para peso corporal(B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig07.jpg"> Figura 7: Área representativa sob a curva (AUC) e dados de torque tetanic de pico. (A) AUC para 4 camundongos separados, apresentado como torque bruto normalizado ao peso corporal. (B) Pico de torque tetanic para os mesmos 4 camundongos, apresentado como torque tetanic de pico bruto normalizado ao peso corporal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62211/62211fig08.jpg"> Figura 8: Torque tetanic pico de extensores de joelho em vários modelos de mouse. Curvas representativas de tétano de torque máximo para um modelo de rato transgênico hipertrofia acionada (GDF8 KO), um rato C57BL/6 saudável sem ferimentos (mouse 2) e um mouse C57BL/6 7 dias após a transecção do ligamento cruzado anterior (ACL-T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/62211fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Dimensões do plástico fabricado sob medida. Inset em vermelho mostra dimensão de profundidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Vídeo suplementar 1: O extensor do joelho em tempo real se contraiu sem braço do motor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/Supplementary%20video%201.mov" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a> 
Vídeo suplementar 2: O extensor do joelho em câmera lenta se contrai sem braço motor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62211/Supplementary%20video%202.mov" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

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In vivo Measurement of Knee Extensor Muscle Function in Mice

A quantificação da força máxima do extensor do joelho é imprescindível para entender adaptações funcionais ao envelhecimento, doença, lesão e reabilitação. Apresentamos um novo método para medir repetidamente o torque isométrico de extensão do joelho in vivo.

Medição in vivo da função muscular extensor do joelho em camundongos

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the ...

A força extensora do joelho é um desfecho funcional comum avaliado em pesquisas clínicas. No entanto, os métodos para avaliar repetidamente o músculo extensor do joelho, particularmente a força do quadríceps, em estudos de roedores têm sido relativamente limitados. Este protocolo não invasivo pode ser usado para medir o pico isométrico de torque tetanic de extensores de joelho em camundongos, e pode ser repetido longitudinalmente.Nossos métodos apoiam o desenvolvimento de modelos pré-clínicos para melhorar a recuperação após as lesões ou em pacientes com osteoartrite. Dada a amplitude dos modelos de roedores desenvolvidos para estudar desfechos musculoesqueléticos após lesão no joelho ou osteoartrite, existe a necessidade da avaliação não invasiva da força do quadríceps. A demonstração visual é fundamental para a integridade dos dados, pois demonstraremos como colocar os eletrodos de forma ideal para estimular ao máximo os extensores do joelho.Antes de iniciar o experimento, verifique se todas as máquinas estão conectadas de acordo com as especificações do fabricante. Conecte o motor da alavanca muscular de dupla carga com o aparelho de extensão do joelho à plataforma animal e ligue a bomba de água a 37 graus Celsius, depois ligue o computador, o Estimulador bi-fase de alta potência e o sistema de alavanca de modo dual de 2 canais, e adicione isoflurane ao vaporizador à linha de enchimento máxima. Para otimizar a colocação da sonda, no software de instrumento, selecione Preparar experimento e configurar o Instant Stim, e definir a Frequência de Pulso para 125 Hertz, a Largura de Pulso para 0,2 metros por segundo, o Número de Pulsos para um, a Frequência de Trem para 0,5 Hertz e o Tempo de Execução para 120 segundos.Em seguida, selecione Arquivo e abra o Live Data Monitor. Para realizar experimentos de frequência de contração e torque, selecione um estudo previamente programa que inclui os experimentos apropriados de frequência de torque de contração e extensão do joelho. Selecione o mouse experimental apropriado ou Add New Animal e forneça as informações correspondentes do mouse a serem armazenadas com os dados de torque.Em seguida, selecione Next Experiment ou Previous Experiment para transição do protocolo de contração para a sequência de frequência de força. Após a anestesia, confirme a sedação por falta de resposta ao reflexo do pedal e coloque o mouse na posição supina em uma plataforma aquecida com a cabeça e um cone de nariz. Use cortadores elétricos para raspar o cabelo do membro traseiro direito.Depois de limpar o cabelo do mouse e da plataforma, aperte firmemente o membro traseiro superior posterior ao joelho. Após a fixação, coloque o membro inferior traseiro no aparelho de extensão do joelho com a tíbia anterior tocando levemente a peça de plástico ajustável e enrole a fita cirúrgica ao redor da parte inferior da peça de plástico ajustável para fixar a perna ao aparelho, em seguida, ajuste os botões na plataforma até que o joelho esteja dobrado em um ângulo de 60 graus, e coloque um pedaço de fita sobre o torso do mouse para evitar movimento compensatório com extensão máxima do joelho. Coloque o eletrodo subcutâneamente de dois a quatro milímetros proximal ao joelho diretamente acima dos músculos quadríceps e extensores do joelho aproximadamente de um a dois milímetros de distância.Para determinar a colocação ideal do eletrodo, no software, selecione O Monitor de Estimulação Instantânea e Dados Ao Vivo e defina a corrente para 50 miliamperes para repetidas contrações para confirmar a extensão conforme indicado por uma curva de contração negativa. Para obter o torque máximo de proteção da extensão do joelho, ajuste as sondas enquanto revisa a resposta na janela Live Data Monitor. Ao mesmo tempo em que oferece repetidas contrações com estimulação instantânea, palpa os músculos flexores do joelho do rato com o dedo indicador para confirmar que não há ativação dos músculos antagonistas.Para a estimulação máxima do extensor do joelho, reposicione as sondas conforme necessário. Quando a colocação ideal da sonda tiver sido determinada, defina a corrente em 50 miliamperes e selecione Executar experimento para produzir um único contração. Selecione Analisar resultados para exibir a saída de torque e registrar o torque de contração exibido em Max Force com a linha de base subtraída.Repita o experimento até que o torque do contração seja em patamares ou comece a diminuir. Aumentando a corrente para 10 a 20 miliamperes e registrando o torque de contração para cada experimento. Registre a menor corrente em que o maior torque de contração é alcançado.Esta corrente será usada para o experimento de frequência de força. Para determinar o efeito de torque isométrico máximo, selecione o experimento de frequência de torque pré-programa para extensão do joelho e defina a duração do estímulo para 0,35 segundos, as sequências de frequência para 10, 40, 120, 150, 180 e 200 Hertz e o período de descanso entre os pulsos e contrações para 120 segundos. Em seguida, clique em Executar experimentos e analisar resultados, e registrar manualmente o torque em cada frequência, certificando-se de que o canal Force seja invertido, pois a contração do extensor do joelho produzirá um torque negativo.Observe o maior valor máximo de força como o pico de torque tetanico isométrico. No final do experimento de frequência de torque, realize uma contração de seguimento e compare o movimento de seguimento com o pico inicial de contração na mesma corrente para avaliar danos ou fadiga. Quando todas as medidas de torque tiverem sido adquiridas, remova suavemente as sondas de eletrodo e o grampo do joelho e coloque o mouse em uma gaiola de recuperação em uma almofada de calor com monitoramento até a recumbência total.Nesta análise representativa, três interruptores isolados foram introduzidos em uma estimulação inicial de corrente de 10 Hertz. A fusão parcial do contração foi observada em 40 Hertz e a potência máxima do torque tetanic foi alcançada em 120 a 180 Hertz. Neste experimento, foram obtidas curvas de frequência de torque de extensão do joelho para três camundongos no momento zero e duas semanas após a avaliação inicial.Como observado, os valores de torque bruto e os valores de torque bruto normalizados ao peso corporal do rato foram estatisticamente semelhantes em ambos os pontos de tempo confirmando a reprodutibilidade da análise. Conforme ilustrado nesta área sob a análise da curva utilizando dados de torque isométrico normalizados para experimentos completos de frequência de torque para quatro camundongos separados, um torque total semelhante foi obtido após análises repetidas com os mesmos animais. O pico de potência de torque tetanic também demonstrou variabilidade mínima dentro de cada animal.O protocolo de torque tetanic de pico do extensor do joelho é uma ferramenta útil para detectar diferenças de resistência em vários modelos de mouse. Por exemplo, nesta análise, pode-se observar um forte contraste entre a força extensora do joelho e um rato selvagem não ferido e um modelo de rato transgênico de hipertrofia suprafisiológica. Além disso, observou-se queda de quase 50% no torque máximo em animais do tipo selvagem sete dias após a transeção cirúrgica do ligamento cruzado anterior.A colocação ideal do eletrodo é essencial para alcançar resultados significativos e repetíveis. A fadiga muscular extensora do joelho é um importante indicador da função física, incluindo repetidas contrações submaximais e avaliações futuras adicionariam mais relevância translacional a este método em modelos pré-clínicos. Estudos que investigam os mecanismos de adaptação muscular, muitas vezes utilizam modelos de camundongos devido à simplicidade da modificação genética.Esta técnica oferece um método não invasivo para medir repetidamente a função extensor do joelho in vivo nesses modelos pré-clínicos.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Biologia

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Avaliação da função muscular do músculo extensor longo dos dedos<em&gt; Ex vivo</em&gt; E músculo tibial anterior<em&gt; Em situ</em&gt; Em Ratos

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Lesão por esmagamento aórtico murino: um eficiente<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de proliferação de células musculares lisas e função endotelial

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Um modelo ex vivo da cultura do tecido da cartilagem que remodela em explants bovinos do joelho

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...