Name: co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ARC 2020 ، Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde) ، ARTC ، خطة السرطان 2021 ، INCA PLBIO. ويدعم Alveole من قبل وكالة الوطنية دي لا ريشرش (غرانت لابيكس الدماغ ANR-10-LABX-43). جوريس غيون هو حاصل على زمالة من مستشفى جامعة تولوز (CHU تولوز).

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى (من مستشفى هاوكيلاند، بيرغن، النرويج، وفقا للوائح لجنة الأخلاقيات المحلية). يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجان أخلاقيات البحوث البشرية والحيوانية في جامعة بوردو. تم إيواء الفئران الحامل وعلاجها في منشأة الحيوانات في جامعة بوردو. ...

<ol>
	<li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma.">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li><li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance.">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li><li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1&#945;/CXCR4+expression+in+glioblastomas.">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1&#945;/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li><li>Boy&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CXCR3/LRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors.">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571 (2017).</li><li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development.">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146 (2019).</li><li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks.">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li><li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma.">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+Printing+by+Light?Induced+Molecular+Adsorption.">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li><li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells.">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li><li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems.">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li><li>Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates.">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).</li><li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+a+dish:+the+promise+of+iPSC-derived+neurons.">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li><li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt/&#946;-catenin+signalling.">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/&#946;-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li></ol>

جليوبلاستوماس غزو واسع النطاق parenchyma باستخدام وسائط مختلفة: الخيار المشترك للأوعية الدموية المحيطة بها, غزو الخلالي, أو الغزو على WMTs18. هذا الوضع الأخير لا يتميز بشكل جيد في الأدب بسبب صعوبة في العثور على نماذج مناسبة في المختبر أو في الجسم الحي المتعلقة بغزو WMT. هنا ، ?...

الأورام الدبقية الخبيثة الأولية، بما في ذلك GBMs، هي أورام مدمرة، مع معدل بقاء متوسط من 12 إلى 15 شهرا لمرضى GBM. يعتمد العلاج الحالي على استئصال كتلة الورم الكبيرة والعلاج الكيميائي إلى جانب العلاج الإشعاعي ، والذي يمدد معدل البقاء على قيد الحياة لبضعة أشهر فقط. ترتبط الإخفاقات العلاجية ارتباطا وثيقا بضعف تسليم الأدوية عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) والنمو الغازي في المساحات المحيطة بالأوعية الدموية ، السحايا ، وعلى طول WMTs1. غزو الأوعية الدموية، وتسمى أيضا الأوعية الدموية الخيار المشترك، هو عملية مدروسة جيدا، والآليات الجزيئية بدأت في توضيح؛ ومع ذلك، فإن عملية غزو خلايا GBM على طول WMTs غير مفهومة جيدا. الخلايا السرطانية تهاجر إلى الدماغ السليم على طول الهياكل الثانوية شيرر2. في الواقع ، منذ ما يقرب من قرن واحد ، وصف هانز يواكيم شيرر الطرق الغازية ل GBM ، والتي يشار إليها الآن باسم الساتيليات البينوروانية ، وداء الشبع المحيطي والأوعية الدموية ، وانتشار تحت الحيوية ، والغزو على طول WMT (الشكل 1A).
بعض chemokines ومستقبلاتها، مثل الخلايا النجمية المستمدة من عامل-1α (SDF1α) وC-X-C عزر مستقبلات chemokine 4 (CXCR4)، ولكن ليس عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF)، ويبدو أن متورطة في غزو WMT3. في الآونة الأخيرة ، وقد تبين أن محور NOTCH1-SOX2 عبر الخلايا ليكون مسارا هاما في غزو WMT من خلايا GBM4. وصف المؤلفون كيف تغزو الخلايا الشبيهة بالجذع GBM الدماغ parenchyma على الخلايا العصبية غير الميالينية جزئيا ، مما يشير إلى تدمير أغماد المايلين بواسطة خلايا GBM. تم الوصول إلى علامة فارقة في عام 2019 عندما تم نشر ثلاث مقالات بشكل قاطع في مجلة نيتشر ، مما يؤكد على دور النشاط الكهربائي في تطوير الورم الدبقي5،6. يلقي العمل الجوهري الذي يقوم به Monje والمتعاونون الضوء على الدور المركزي للنشاط الكهربائي في إفراز neuroligin-3 ، والذي يعزز تطور الورم الدبقي.
وصف وينكلر والمتعاونون الاتصالات بين خلايا GBM (microtubes) بأنها حاسمة في الخطوات الغازية ، وفي الآونة الأخيرة ، التفاعلات بين خلايا GBM والخلايا العصبية عبر نقاط الاشتباك العصبي الموصوفة حديثا. هذه الهياكل تفضل التحفيز الجلوتاماترجية لمستقبلات حمض α الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-إيزوكسيزولبروبينيويك (AMPA) الموجودة في غشاء الخلية GBM، الذي يعزز تطور الورم والغزو. غزو الخلايا السرطانية هو عملية مركزية في نشر الانبثاث أو البؤر الثانوية البعيدة ، كما لوحظ في مرضى GBM. وقد تم تحديد عدة عوامل لتكون مهمة في غزو GBM مثل thrombospondin-1, بيتا عامل النمو تحويل (البروتين المصفوفي TGFа المنظمة, أو مستقبلات كيموكيني CXCR3)7,8.
هنا ، تم وصف نموذج المحاكاة الحيوية المبسطة لدراسة غزو GBM ، حيث يتم نقش الخلايا العصبية على مسارات صفمين ، ويتم بذر خلايا GBM عليه ، كخلايا واحدة أو كرويدات(الشكل 1B). وتهدف الإعدادات التجريبية اثنين في إعادة رسملة الغزو على الخلايا العصبية, الذي لوحظ في GBM9,10,11. وقد وضعت هذه النماذج في الماضي كما محاذاة المواد الحيوية nanofiber (core-shell electrospinning) التي تسمح لدراسة هجرة الخلايا عن طريق تحوير الخصائص الميكانيكية أو الكيميائية12. يسمح نموذج الثقافة المشتركة الموصوف في هذه المقالة بفهم أفضل لكيفية هروب خلايا GBM على الخلايا العصبية من خلال تحديد مسارات جزيئية جديدة تشارك في هذه العملية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round-bottom plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2582624</td>
			<td>Used to prepare spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C (long-term) or 4 &#176;C (short-term), sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>111580</td>
			<td>Cell culture substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator cartridges</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z363456-6EA</td>
			<td>Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software, MTrack2 macro</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm&#178;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td></td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Promotes neuronal adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>loading of envisioned micropatterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Software&#160;</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscopy automation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope equipped with a motorized stage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PLPPclassic_1ml</td>
			<td>Photoinitiator used to degrade the PEG brush</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>VA-PEG-VA-5000-5g</td>
			<td>Used as an anti-fouling coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PRIMO1</td>
			<td>Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions

الأورام الأرومية الدبقية (GBMs)، الأورام الدبقية الخبيثة من الدرجة الرابعة، هي واحدة من أكثر أنواع السرطان البشري فتكا بسبب خصائصها العدوانية. على الرغم من التقدم الكبير في علم الوراثة من هذه الأورام، كيف تغزو خلايا GBM بارنشيما الدماغ السليمة ليست مفهومة جيدا. وتجدر الإشارة إلى أنه تبين أن خلايا GBM تغزو الفضاء المحيطي عبر طرق مختلفة؛ المصلحة الرئيسية لهذه الورقة هو الطريق على طول مساحات المادة البيضاء (WMTs). لا تتميز تفاعلات الخلايا السرطانية مع مكونات الخلايا العصبية المحيطة بالورم بشكل جيد. هنا، وقد وصفت طريقة تقيم تأثير الخلايا العصبية على غزو الخلايا GBM. تقدم هذه الورقة ثقافة مشتركة متقدمة في الفحص المختبري الذي يحاكي غزو WMT من خلال تحليل هجرة الخلايا الجذعية الشبيهة ب GBM على الخلايا العصبية. يتم مراقبة سلوك خلايا GBM في وجود الخلايا العصبية باستخدام إجراء تتبع تلقائي مع برامج مفتوحة المصدر والوصول الحر. هذه الطريقة مفيدة للعديد من التطبيقات، على وجه الخصوص، للدراسات الوظيفية والميكانية وكذلك لتحليل آثار العوامل الدوائية التي يمكن أن تمنع هجرة خلايا GBM على الخلايا العصبية.

تم إعداد الخلايا العصبية المنقوشة المشاركة في استزراع خلايا GBM الفلورية كما هو موضح في قسم البروتوكول ، وأجريت تجارب التتبع. الخلايا GBM تعديل شكلها بسرعة أثناء الهجرة على الخلايا العصبية (الشكل 1B: لوحة 6 والفيديو 1). هاجرت الخلايا على طول امتدادات الخلايا ا...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

هنا، نقدم اختبار الثقافة المشتركة سهلة الاستخدام لتحليل الورم الأرومي الدبقي (GBM) الهجرة على الخلايا العصبية المنقوشة. قمنا بتطوير ماكرو في برنامج FiJi لسهولة تحديد كمي لهجرة خلايا GBM على الخلايا العصبية ، ولاحظنا أن الخلايا العصبية تعدل قدرة الخلايا الغازية GBM.

الثقافة المشتركة للخلايا الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

الأورام الأرومية الدبقية هي أورام الدماغ المدمرة مع صورة الغازية عالية. هذا النظام الثقافة المشتركة يحاكي هجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية لتلخيص واحدة من الطرق الغازية التي لوحظت في المرضى. يتم التحكم بدقة في هندسة وتكوين نموذج الثقافة المشتركة لدينا.وهو ييسر إعادة إنتاج أفضل وأيضا تحديد كمي مباشر للعمليات البيولوجية المعقدة. يمكن تكييف هذه الطريقة مع التشخيص السريري من خلال المشاركة في زراعة خلايا الورم الأرومي الدبقي والخلايا العصبية المفككة حديثا. وهو يحدد مؤشر السريرية، وهو أمر مهم جدا كنتيجة سريرية.يمكن استخدام طريقتنا أيضا لتحديد الخلايا المهاجرة الأخرى، مثل الخلايا الليفية أو الخلايا المناعية. إثبات الإجراء سيكون (جوريس غايون)، طالب دكتوراه من فريقي. لجعل الركيزة لmicropatterning، علاج 18 ملليمتر يغطي الزجاج الدائري عن طريق الهواء أو تنشيط البلازما لمدة خمس دقائق قبل وضع الأغطية في مجفف مع 100 ميكرولتر من triethoxysilane لمدة ساعة واحدة، ثم احتضان حل PEG-SVA في 100 ملليغرام لكل ملليلتر لمدة ساعة واحدة.لترسب هلام، في نهاية الحضانة، إضافة ثلاثة ميكرولترات من PLPP و 50 ميكرولتر من الإيثانول المطلق على وسط الشريحة والانتظار حتى يجف تماما. بالنسبة للشرائح الزجاجية الصغيرة ، قم بتركيب الغطاء في غرفة Ludin ووضع الغرفة على خشبة مسرح المجهر المجهز بنظام التركيز التلقائي. بعد التصوير، قم بتحميل صور الميكروباترن في البرنامج.بعد تسلسل الإضاءة التلقائي للأشعة فوق البنفسجية ، استخدم ماصة لغسل PLPP من الغطاء على نطاق واسع مع PBS. ثم احتضان غطاء مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من اللامينين لمدة 30 دقيقة، تليها غسل آخر مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح. لإعداد ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر الفئران الجنينية على الأغطية micropattern، بعد غسل الماضي، ترطيب الشرائح الزجاجية مع الخلايا العصبية ثقافة المتوسطة.البذور خمس مرات 10 إلى الخلايا العصبية فرس النهر الفئران الرابعة علقت في المتوسط العصبي المخصب مع 3٪ مصل الحصان لكل سنتيمتر مربع على كل غطاء micropatterned لاحتضان 24 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ في 37 درجة مئوية. فصل الطرد المركزي خلايا الورم الأرومي الدبقي لمدة خمس دقائق في 1000 دورة في الدقيقة وإعادة إنفاق بيليه في المتوسطة ثقافة الخلايا الأرومية، ثم إيداع مرة واحدة 10 إلى خلايا GBM الثالثة على الخلايا العصبية micropatterned. لتصوير الخلايا الحية للخلايا، ضع الثقافة المشتركة على خشبة مسرح المجهر المقلوب المجهز بغرفة الحرارة 37 درجة مئوية وحدد هدف 20X.ثم استخدم صندوق أدوات الاستحواذ متعدد الأبعاد في برنامج المجهر للحصول على صور الطماطم الحية Brightfield و epifluorescence GFP كل دقيقتين لمدة 12 ساعة في 16 موقعا مختلفا استنادا إلى عدد الأنماط مع الخلايا العصبية. لتحليل شبكة الخلايا العصبية، بعد التصوير، حدد صورة واحدة من المكدس. انقر بزر الماوس الأيمن على أداة الشبكة لفتح مربع الحوار الخيارات المقابلة وضبط الإعدادات لإنتاج تجزئة دقيقة للصور.انقر فوق موافق. انقر بزر الماوس الأيسر على أداة الشبكة لتكرار الصورة المحددة وتقسيم الصورة إلى قنوات اللون الأحمر والرمادي والأخضر. حدد القناة الرمادية، وتنفيذ تحسين امتداد التباين لتحسين الفصل بين المناطق المختلفة. استخدم كاشف حافة سوبيل لتنفيذ التواء معالجة الإشارات 2D كما هو مجمع تحت أمر حافة البحث.للتصفية المزدوجة، قم بتطبيق ضبابية غاوسية ومرشح متوسط لتقليل الضوضاء وتجانس إشارة الكائن. لتحويل إلى قناع تنفيذ خوارزميات عتبة adapted للحصول على صورة ثنائية مع بكسل أبيض وأسود. بعد ذلك ، هيكل عظمي لمنطقة الخلية في شبكة بسيطة واستخدام جزيئات التصفية لإزالة الجسيمات الصغيرة غير الشبكية في النتائج.جزيئات تصفية الشبكة في صورة شبكة. للحصول على قنوات حمراء وخضراء، قم بإجراء التصفية المزدوجة وتحويلها إلى قناع كما هو موضح باستخدام أسلوب العتبة المكيفة. استخدام تحليل الجسيمات لتحديد مورفولوجيا الخلية في الصورة الخضراء ثنائي.استخدم أو المشغل لدمج جميع القنوات باستخدام مناطق الاهتمام الخاصة بها وإعادة ضبط لونها الأولي في صورة RGB بسيطة. لإجراء تحليل الحركة أحادي الخلية، انقر بزر الماوس الأيمن على أداة تتبع الخلية الواحدة لفتح مربع الحوار الخيارات المقابلة وضبط الإعدادات لإنتاج تجزئة دقيقة للصور. انقر فوق موافق وانقر بزر الماوس الأيمن على تعقب خلية واحدة لإزالة القناة الرمادية.لإنشاء صورة مطابقة لمكدس الصور وفقا للوقت، قم بتطبيق إسقاط Z وفلتر مزدوج وتحويل لإخفاء المسارات التي خلفتها الخلايا. إزالة جزيئات صغيرة من الصورة ثنائي الأحمر والأخضر كما هو موضح. استخدم أداة منطقة الاهتمام لتحديد كل محيط من تتبع الخلية والتحقق من مربع الكشف عن حافة التخطي في إطار الحوار خيارات.عزل القناة الحمراء على المكدس الأصلي وحدد منطقة واحدة من الاهتمام. تصفية مزدوجة كل من الصور وتحويلها إلى قناع للسماح موقف XY سنترويد من كل نواة ثنائية الحجم ليتم تحديدها. يمكن استخدام مواضع XY لحساب متوسط الإزاحة المربعة ونسبة الاتجاه ومتوسط السرعة للخلية.لتحليل تتبع خلايا متعددة، انقر بزر الماوس الأيمن على أداة التتبع لفتح مربع الحوار الخيارات المقابلة وضبط الإعدادات لإنتاج تجزئة دقيقة للصور. انقر بزر الماوس الأيسر على أداة التتبع لإزالة القناة الرمادية. تقسيم القنوات الحمراء والخضراء، فلتر مزدوج، وتحويل إلى قناع.ثم استخدم الأمر calculator صورة مع ومشغل لدمج القنوات ترك فقط إشارة النواة الموجودة داخل الأغشية وحساب مؤامرة مسار، يعني الإزاحة مربع، نسبة الاتجاه، ومتوسط سرعة للخلايا كما هو موضح. الفلورسنت GBM شارك مثقف مع الخلايا العصبية منقوشة تعديل شكلها بسرعة وتظهر الهجرة على طول ملحقات الخلايا العصبية في حركة عشوائية. خلايا GBM المصنفة على الخلايا العصبية عرض شكل ممدود مع نتوءات متعددة التي تتبع مسارات الخلايا العصبية في حين أن الخلايا تحتفظ شكلها مدورة عندما مثقف على صفح.في المراحل اللاحقة من الثقافة ، يمكن ملاحظة نتوءات رقيقة ترتبط بالخلايا في الثقافات المشتركة العصبية GBM. خلايا GBM المصنفة على الخلايا العصبية تثبت قدرة هجرة أكبر من خلايا GBM المصنفة على صفح كما لوحظ في هذه المؤامرات مسار. تحليل التقاء الفلورسنت للخلايا يدل على أنه على مدى فترة مراقبة 500 دقيقة، لوحظ المزيد من هجرة الخلايا عندما يتم زراعة كرويدات مع الخلايا العصبية مما كانت عليه عندما يتم استزراع الخلايا على صفمين وحدها.في الواقع بحلول نهاية التحليل ، يتم تغطية ما يقرب من نصف النمط بخلايا GBM في حين أن الكرويات المستزرعة على النعناع لا تزال غير مبشرة بالأغطية. اعتمادا على الأسئلة البيولوجية التي تريد الإجابة عليها ، يجب على المرء أن يعتني بأن تصميم النمط وكذلك كثافة الخلية تمثل ظروف الجسم الحي. يمكن إصلاح الخلايا وتصويرها عن طريق المجهر الكونفوجكال.التصوير الحي ممكن أيضا لأن طريقتنا لا تضعف قدرات التصوير. هذه التقنية مناسبة تماما لدراسة التفاعل الجزيئي، مثل التبادلات الأيضية بين خلايا الورم الأرومي الدبقي والخلايا العصبية. يسمح باستكشاف العمليات البيولوجية وظيفة.ويمكن أيضا إجراء تجارب عالية الإنتاجية لأغراض سريرية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

باستخدام المقايسة دوت لتحليل هجرة أوراق الخلية

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

نموذج الرئة اللاخلوي والخلوية لدراسة ورم خبيث

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

استخدام المصفوفات الدقيقة لاستجواب الأثر البيئي الدقيق على الأنماط الظاهرية الخلوية في السرطان

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

عزل خلايا شبيهه بالجذعية من ثقافات كروي ثلاثية الابعاد

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

دراسة اثار الورم الذي يفرز الأورام الليفية علي تنشيط الضامة باستخدام الثقافة المشتركة مع غشاء نفاذيه يدعم

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...