Name: co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole er støttet af Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon er modtager af stipendium fra Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).

Informeret skriftligt samtykke blev indhentet fra alle patienter (fra Haukeland Hospital, Bergen, Norge, i henhold til lokale etiske komité regler). Denne protokol følger retningslinjerne fra Bordeaux University human and animal research etiske komitéer. Gravide rotter blev opstaldet og behandlet i dyrefaciliteten på Bordeaux University. Aktiv dødshjælp af en E18-timet gravid rotte blev udført ved hjælp af CO2. Alle dyreforsøg er udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og godk...

<ol>
	<li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma.">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li><li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance.">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li><li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1&#945;/CXCR4+expression+in+glioblastomas.">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1&#945;/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li><li>Boy&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CXCR3/LRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors.">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571 (2017).</li><li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development.">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146 (2019).</li><li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks.">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li><li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma.">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+Printing+by+Light?Induced+Molecular+Adsorption.">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li><li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells.">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li><li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems.">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li><li>Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates.">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).</li><li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+a+dish:+the+promise+of+iPSC-derived+neurons.">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li><li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt/&#946;-catenin+signalling.">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/&#946;-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li></ol>

Glioblastomas invaderer i vid udstrækning parenchyma ved hjælp af forskellige tilstande: co-option af omkringliggende blodkar, interstitiel invasion eller invasion på WMTs18. Sidstnævnte tilstand er ikke godt karakteriseret i litteraturen på grund af vanskelighederne med at finde egnede in vitro- eller in vivo-modeller relateret til WMT-invasion. Her er der foreslået en forenklet model, hvor dyrkede gnaverneuroner blev mønstret på lamininbelagte overflader, og fluorescere...

Primære ondartede gliomer, herunder GBMs, er ødelæggende tumorer, med en medium overlevelsesrate på 12 til 15 måneder rapporteret for GBM patienter. Nuværende terapi er afhængig af store tumor masse resektion og kemoterapi kombineret med strålebehandling, som kun udvider overlevelsesraten med få måneder. Terapeutiske fejl er tæt forbundet med dårlig levering af lægemidler på tværs af blod-hjerne barrieren (BBB) og til invasiv vækst i perivascular rum, meninges, og langs WMTs1. Perivascular invasion, også kaldet vaskulær co-option, er en godt studeret proces, og de molekylære mekanismer er begyndt at blive belyst; processen med GBM-celleinvasion langs WMT'er er imidlertid ikke godt forstået. Tumorceller migrere ind i den sunde hjerne langs Scherer sekundære strukturer2. For næsten et århundrede siden beskrev Hans-Joachim Scherer de invasive ruter for GBM, som nu omtales som perineuronal satellitose, perivascular satellitose, subpiel spredning og invasion langs WMT (Figur 1A).
Nogle kemokiner og deres receptorer, såsom stromal celle-afledt faktor-1α (SDF1α) og C-X-C motiv kemokin receptor 4 (CXCR4), men ikke vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), synes at være impliceret i WMT invasion3. For nylig har en transcellulær NOTCH1-SOX2-akse vist sig at være en vigtig vej i WMT-invasion af GBM-celler4. Forfatterne beskrev, hvordan GBM stamceller invadere hjernen parenchyma på delvist unmyelinated neuroner, hvilket tyder på ødelæggelse af myelin kapper af GBM celler. En milepæl blev nået i 2019, da tre artikler blev foreløbigt offentliggjort i Nature-tidsskriftet, der understreger den elektriske aktivitets rolle i gliomudvikling5,6. Skelsættende arbejde af Monje og samarbejdspartnere kaste lys over den centrale rolle elektrisk aktivitet i udskillelsen af neuroligin-3, som fremmer gliom udvikling.
Winkler og samarbejdspartnere beskrev forbindelser mellem GBM-celler (mikrorør) som afgørende i invasive trin, og på det seneste har interaktioner mellem GBM-celler og neuroner via nyligt beskrevne neurogliomasynapser. Disse strukturer favoriserer glutamatergisk stimulation af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) receptorer placeret på GBM cellemembranen, som fremmer tumor udvikling og invasion. Tumorcelleinvasion er en central proces i udbredelsen af metastaser eller fjerne sekundære foci, som observeret hos GBM-patienter. Flere faktorer er blevet identificeret som vigtige i GBM invasion såsom thrombospondin-1, en transformerende vækstfaktor beta (TGFβ-reguleret matricellulært protein, eller kemokin receptor CXCR3)7,8.
Her er en forenklet biomimetisk model blevet beskrevet for at studere GBM-invasion, hvor neuroner er mønstret på spor af laminin, og GBM-celler er seedet på det, som enkeltceller eller som sfæroider (Figur 1B). De to eksperimentelle indstillinger har til formål at opsummere invasion på neuroner, som observeres i GBM9,10,11. Sådanne modeller er tidligere blevet udviklet som justerede nanofiberbiomaterialer (core-shell elektrospinning), der gør det muligt at studere cellemigration ved at modulere mekaniske eller kemiske egenskaber12. Den co-kulturmodel, der er beskrevet i denne artikel, giver en bedre forståelse af, hvordan GBM-celler undslipper på neuroner ved at definere nye molekylære veje, der er involveret i denne proces.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round-bottom plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2582624</td>
			<td>Used to prepare spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C (long-term) or 4 &#176;C (short-term), sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>111580</td>
			<td>Cell culture substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator cartridges</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z363456-6EA</td>
			<td>Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software, MTrack2 macro</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm&#178;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td></td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Promotes neuronal adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>loading of envisioned micropatterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Software&#160;</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscopy automation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope equipped with a motorized stage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PLPPclassic_1ml</td>
			<td>Photoinitiator used to degrade the PEG brush</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>VA-PEG-VA-5000-5g</td>
			<td>Used as an anti-fouling coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PRIMO1</td>
			<td>Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions

Glioblastomas (GBMs), grade IV ondartede gliomer, er en af de dødeligste typer af kræft hos mennesker på grund af deres aggressive egenskaber. På trods af betydelige fremskridt i genetik af disse tumorer, hvordan GBM celler invadere den sunde hjerne parenchyma er ikke godt forstået. Især har det vist sig, at GBM-celler invaderer det peritumorale rum via forskellige ruter; hovedinteressen i dette papir er ruten langs hvide stof skrifter (WMTs). Samspillet mellem tumorceller med peritumoralnervecellekomponenterne er ikke godt karakteriseret. Heri er der beskrevet en metode, der evaluerer neuronernes indvirkning på GBM-celleinvasion. Dette papir præsenterer en avanceret co-kultur in vitro assay, der efterligner WMT invasion ved at analysere migration af GBM stamceller på neuroner. GBM-cellers opførsel i nærværelse af neuroner overvåges ved hjælp af en automatiseret sporingsprocedure med open source- og friadgangssoftware. Denne metode er nyttig til mange applikationer, især til funktionelle og mekanistiske undersøgelser samt til analyse af virkningerne af farmakologiske midler, der kan blokere GBM-cellemigration på neuroner.

Mønstrede neuroner, der var medkulturerede med fluorescerende GBM-celler, blev udarbejdet som beskrevet i protokolafsnittet, og sporingseksperimenter blev udført. GBM-celler ændrede hurtigt deres form, mens de migrerede på neuronerne (Figur 1B: panel 6 og Video 1). Celler migreret langs neuronale udvidelser, i en tilfældig bevægelse (Video 1). Fluorescerende GBM-celler og ikke-fluorescerende neuroner kan let skelnes, og dette gjorde de...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Her præsenterer vi en brugervenlig co-kulturanalyse til at analysere glioblastoma (GBM) migration på mønstrede neuroner. Vi udviklede en makro i FiJi-software for nem kvantificering af GBM-cellemigration på neuroner og observerede, at neuroner ændrer GBM-celle invasiv kapacitet.

Co-kultur af Glioblastoma Stamceller på mønstrede neuroner til at studere migration og cellulære interaktioner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Glioblastomas er ødelæggende hjernetumorer med en høj invasiv profil. Dette co-kultur system efterligner glioblastoma celler migration på neuroner til at opsummere en af de invasive ruter observeret hos patienter. Geometrien og sammensætningen af vores co-culture model styres præcist.Det gør det lettere at reproducere og også en simpel kvantificering af komplekse biologiske processer. Denne metode kan tilpasses klinisk diagnose ved at co-dyrkning frisk dissociated glioblastoma celler og neuroner. Det definerer et klinisk indeks, hvilket er meget vigtigt som klinisk resultat.Vores metode kan også bruges til at kvantificere andre migrerende celler, såsom fibroblaster eller immunceller. Demonstration af proceduren vil være Joris Guyon, en ph.d.-studerende fra mit team. For at lave et substrat til mikromaling skal du behandle 18 millimeter cirkulære glasovertrækslips med luft- eller plasmaaktivering i fem minutter, før dækslet placeres i en desiccator med 100 mikroliter triethoxysilane i en time, og derefter inkuberes en opløsning af PEG-SVA ved 100 milligram pr. Milliliter i en time.Til gelaflejring, i slutningen af inkubationen, tilsæt tre mikroliter PLPP og 50 mikroliter absolut ethanol på midten af diaset og vent, indtil det tørrer helt. Til glasrutsjebanemikrering monteres coverlip'en i et Ludin-kammer, og kammeret placeres på scenen i et mikroskop, der er udstyret med et autofokussystem. Efter billedbehandling skal du indlæse mikropatternbillederne i softwaren.Efter automatisk UV-belysning sekventering, skal du bruge en pipette til at vaske PLPP fra coverslip omfattende med PBS. Derefter inkuberes coverlip med 50 mikrogram per milliliter laminin i 30 minutter, efterfulgt af en anden vask med PBS som påvist. At oprette en embryonal rotte hippocampal neuron kultur på mikropattern coverslips, efter den sidste vask, rehydrere glasset glider med neuronal cellekultur medium.Frø fem gange 10 til den fjerde rotte hippocampal neuroner suspenderet i Neurobasal medium beriget med 3% hest serum per kvadratcentimeter på hver mikropatterned coverslip for en 24-timers inkubation i en 5% kuldioxid inkubator ved 37 grader Celsius. Centrifuge dissociated glioblastoma celler i fem minutter ved 1.000 RPM og genbruge pellet i glioblastoma cellekultur medium, derefter deponere en gange 10 til den tredje GBM celler over mikropatterned neuroner. For levende celle billeddannelse af cellerne, placere co-kultur på scenen af en omvendt mikroskop udstyret med en 37 grader Celsius termostat kammer og vælg 20X mål.Brug derefter den flerdimensionale erhvervelser værktøjskasse i mikroskop software til at erhverve levende Brightfield og epifluorescens GFP tomat billeder hvert andet minut i 12 timer i 16 forskellige positioner baseret på antallet af mønstre med neuroner. For neuronal netværksanalyse, efter billeddannelse, skal du vælge et billede fra stakken. Højreklik på netværksværktøjet for at åbne den tilsvarende indstillingsdialogboks og justere indstillingerne for at producere en præcis segmentering af billederne.Klik på OK. Venstreklik på netværksværktøjet for at duplikere det markerede billede og opdele billedet i de røde, grå og grønne farvekanaler. Vælg den grå kanal, og udfør en forbedring af kontraststræk for at forbedre adskillelsen mellem de forskellige områder. Brug Sobel-kantdetektoren til at udføre 2D-signalbehandlingskonvolutionen som grupperet under kommandoen Find kant.For dobbelt filtrering skal du anvende gaussisk sløring og et medianfilter for at reducere støjen og for at udjævne objektsignalet. Hvis du vil konvertere til maske, skal du udføre tilpassede tærskelalgoritmer for at få et binært billede med sorte og hvide pixel. Derefter skeletter celleområdet til et simpelt netværk og brug filterpartikler til at fjerne små ikke-netværkspartikler i resultaterne.Netværksfilterpartikler i et netværksbillede. For at opnå røde og grønne kanaler skal du udføre dobbeltfiltrering og konvertere til maske som demonstreret ved hjælp af den tilpassede tærskelmetode. Brug analyser partikler til at bestemme cellemorfologien i det binære grønne billede.Brug operatoren eller operatoren til at flette alle kanalerne ved hjælp af deres interesseområder og justere deres oprindelige farve til et simpelt RGB-billede. Hvis du vil udføre en enkeltcellet motilitetsanalyse, skal du højreklikke på enkeltcellesporingsværktøjet for at åbne den tilsvarende indstillingsdialogboks og justere indstillingerne for at producere en præcis segmentering af billeder. Klik på OK, og venstreklik på enkeltcellesporing for at fjerne den grå kanal.Hvis du vil generere et billede, der svarer til en billedstak i henhold til klokkeslættet, skal du anvende Z-projektion og dobbeltfilter og konvertere til at maskere de stier, der er tilbage af cellerne. Fjern de små partikler fra det binære røde og grønne billede som demonstreret. Brug værktøjet område af interesse til at markere hver kontur af cellesporingen, og kontroller boksen til registrering af springkant i indstillingsdialogboksen.Isoler den røde kanal på den oprindelige stak, og vælg ét område af interesse. Dobbelt filtrere alle billederne og konvertere til maske, så centroid XY position af hver binarized kerne, der skal bestemmes. XY-positionerne kan bruges til at beregne den gennemsnitlige kvadratiske forskydning, retningsforholdet og den gennemsnitlige hastighed for cellen.I forbindelse med analyse af registrering af flere celler skal du højreklikke på sporingsværktøjet for at åbne den tilsvarende indstillingsdialogboks og justere indstillingerne for at producere en præcis segmentering af billeder. Venstreklik på sporingsværktøjet for at fjerne den grå kanal. Opdel de røde og grønne kanaler, dobbeltfilter, og konverter til maske.Brug derefter billedberegnerkommandoen med og operatøren til at flette kanalerne, så kun kernen signalerer placeret i membranerne og beregner baneplottet, gennemsnitlig firkantet forskydning, retningsforhold og gennemsnitshastighed for cellerne som vist. Fluorescerende GBM co-dyrket med mønstrede neuroner hurtigt ændre deres form og vise migration langs neuronale udvidelser i en tilfældig bevægelse. GBM-celler seedet på neuroner viser en langstrakt form med flere fremspring, der følger neuronsporene, mens cellerne bevarer deres afrundede form, når de dyrkes på laminin.På senere stadier af kulturen kan tynde fremspring, der linker til celler, observeres i GBM neuronale co-kulturer. GBM-celler, der er seedet på neuroner, viser en større migrationskapacitet end GBM-celler, der er seedet på laminin som observeret i disse baneplotter. Analyse af cellernes fluorescerende sammenløb viser, at der over en 500-minutters observationsperiode observeres mere cellemigration, når sfæroiderne er co-dyrket med neuroner, end når cellerne dyrkes på laminin alene.Faktisk ved udgangen af analysen, næsten halvdelen af mønsteret er dækket med GBM-celler, mens spheroids dyrket på laminin forbliver ubelyst til coverlip. Afhængigt af de biologiske spørgsmål, du vil besvare, skal man passe på, at mønsterdesignet og også celletætheden er repræsentative for in vivo-betingelserne. Cellerne kan rettes og afbildes ved konfokal mikroskopi.Live imaging er også muligt, da vores metode ikke forringer billedbehandlingsfunktionerne. Denne teknik er velegnet til at studere molekylær interaktion, såsom metaboliske udvekslinger mellem glioblastoma celler og neuroner. Det gør det muligt at udforske funktion biologiske processer.Eksperimenter med høj gennemstrømning kan også udføres til kliniske formål.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Analyser til Undersøgelse makrofag og Mikroglia Stimulering af glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow flowcytometri-baserede stof Screening System til identifikation af små molekyler, der fremmer Celledifferentiering glioblastom stamceller

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Ved hjælp af Dot analyse til at analysere Migration af celle ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulær og cellulære Lung Model til at studere Tumor metastaser

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Brug af Mikroarrays til at afhøre mikromiljø påvirkning af cellulære Phenotyper i Cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering af Stem-lignende celler fra 3-dimensionelle sfæriske kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Undersøgelse af virkningerne af tumor-Udskillede paracrine Ligands på makrofag aktivering ved hjælp af co-kultur med permeable membran støtter

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...