Name: co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole wordt ondersteund door Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon is een ontvanger van fellowship van het Universitair Ziekenhuis Toulouse (CHU Toulouse).

Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten (van het Haukeland Hospital, Bergen, Noorwegen, volgens de voorschriften van de lokale ethische commissie). Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissies voor menselijke en dierlijke onderzoeksethiek van de Universiteit van Bordeaux. Zwangere ratten werden gehuisvest en behandeld in de dierenfaciliteit van de universiteit van Bordeaux. Euthanasie van een E18-getijde drachtige rat werd uitgevoerd met behulp van CO2. Alle ...

<ol>
	<li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma.">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li><li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance.">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li><li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1&#945;/CXCR4+expression+in+glioblastomas.">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1&#945;/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li><li>Boy&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CXCR3/LRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors.">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571 (2017).</li><li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development.">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146 (2019).</li><li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks.">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li><li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma.">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+Printing+by+Light?Induced+Molecular+Adsorption.">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li><li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells.">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li><li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems.">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li><li>Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates.">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).</li><li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+a+dish:+the+promise+of+iPSC-derived+neurons.">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li><li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt/&#946;-catenin+signalling.">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/&#946;-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li></ol>

Glioblastomen dringen het parenchym uitgebreid binnen door verschillende modi te gebruiken: co-optie van omliggende bloedvaten, interstitiële invasie of invasie op WMTs18. Deze laatste modus wordt niet goed gekarakteriseerd in de literatuur vanwege de moeilijkheid om geschikte in vitro of in vivo modellen te vinden met betrekking tot WMT-invasie. Hier is een vereenvoudigd model voorgesteld waarin gekweekte knaagdierneuronen werden gevormd op met lag bedekte oppervlakken en fluor...

Primaire kwaadaardige gliomen, waaronder GBM's, zijn verwoestende tumoren, met een gemiddelde overlevingskans van 12 tot 15 maanden gerapporteerd voor GBM-patiënten. De huidige therapie is gebaseerd op grote tumormassaresectie en chemotherapie in combinatie met radiotherapie, die de overlevingskans slechts met enkele maanden verlengt. Therapeutische mislukkingen zijn nauw verbonden met slechte medicijnafgifte over de bloed - hersenbarrière (BBB) en met invasieve groei in perivasculaire ruimten, hersenvliezen en langsMGT's 1. Perivasculaire invasie, ook wel vasculaire co-optie genoemd, is een goed bestudeerd proces en de moleculaire mechanismen beginnen te worden opgehelderd; het proces van GBM-celinvasie langs MVW's is echter niet goed begrepen. Tumorcellen migreren naar de gezonde hersenen langs de secundaire structuren van Scherer2. Bijna een eeuw geleden beschreef Hans-Joachim Scherer de invasieve routes van GBM, die nu worden aangeduid als perineuronale satellitose, perivasculaire satellitose, subpiale verspreiding en invasie langs de WMT (figuur 1A).
Sommige chemokinen en hun receptoren, zoals stromale cel-afgeleide factor-1α (SDF1α) en C-X-C motief chemokine receptor 4 (CXCR4), maar niet vasculaire endotheel groeifactor (VEGF), lijken betrokken te zijn bij WMT invasie3. Meer recentelijk is aangetoond dat een transcellulaire NOTCH1-SOX2-as een belangrijke route is in WMT-invasie van GBM-cellen4. De auteurs beschreven hoe GBM-stamachtige cellen het hersenparenchym binnendringen op gedeeltelijk ongemyelineeerde neuronen, wat wijst op de vernietiging van myelinescheden door GBM-cellen. Een mijlpaal werd bereikt in 2019 toen drie artikelenconsecutief werden gepubliceerd in het tijdschrift Nature , waarin de rol van elektrische activiteit in de ontwikkeling van glioom werd onderstreept5,6. Baanbrekend werk van Monje en medewerkers werpt licht op de centrale rol van elektrische activiteit in de afscheiding van neuroligine-3, die de ontwikkeling van glioom bevordert.
Winkler en medewerkers beschreven dat verbindingen tussen GBM-cellen (microtubes) cruciaal zijn in invasieve stappen, en de laatste tijd interacties tussen GBM-cellen en neuronen via nieuw beschreven neuroglioomsynapsen. Die structuren bevorderen glutamatergische stimulatie van α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropioninezuur (AMPA) receptoren gelegen op het GBM celmembraan, die tumorontwikkeling en invasie bevordert. Tumorcelinvasie is een centraal proces in de verspreiding van uitzaaiingen of verre secundaire foci, zoals waargenomen bij GBM-patiënten. Verschillende factoren zijn geïdentificeerd om belangrijk te zijn in GBM invasie zoals trombospondin-1, een transformerende groeifactor bèta (TGFβ-gereguleerd matricellulair eiwit, of de chemokine receptor CXCR3)7,8.
Hier is een vereenvoudigd biomimetisch model beschreven voor het bestuderen van GBM-invasie, waarbij neuronen worden gevormd op sporen van lagmijn en GBM-cellen erop worden gezaaid, als enkele cellen of als sferoïden (Figuur 1B). De twee experimentele instellingen zijn gericht op het samenvatten van invasie op neuronen, die wordt waargenomen in GBM9,10,11. Dergelijke modellen zijn in het verleden ontwikkeld als uitgelijnde nanovezelbiomaterialen (core-shell electrospinning) die het bestuderen van celmigratie mogelijk maken door mechanische of chemische eigenschappen te moduleren12. Het co-cultuurmodel dat in dit artikel wordt beschreven, maakt een beter begrip mogelijk van hoe GBM-cellen ontsnappen op neuronen door nieuwe moleculaire paden te definiëren die bij dit proces betrokken zijn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round-bottom plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2582624</td>
			<td>Used to prepare spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C (long-term) or 4 &#176;C (short-term), sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>111580</td>
			<td>Cell culture substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator cartridges</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z363456-6EA</td>
			<td>Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software, MTrack2 macro</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm&#178;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td></td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Promotes neuronal adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>loading of envisioned micropatterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Software&#160;</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscopy automation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope equipped with a motorized stage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PLPPclassic_1ml</td>
			<td>Photoinitiator used to degrade the PEG brush</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>VA-PEG-VA-5000-5g</td>
			<td>Used as an anti-fouling coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PRIMO1</td>
			<td>Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions

Glioblastomen (GBM's), graad IV kwaadaardige gliomen, zijn een van de dodelijkste soorten menselijke kanker vanwege hun agressieve kenmerken. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de genetica van deze tumoren, is hoe GBM-cellen het gezonde hersenparenchym binnendringen niet goed begrepen. Met name is aangetoond dat GBM-cellen via verschillende routes de peritumorale ruimte binnendringen; het belangrijkste belang van dit document is de route langs witte stof traktaten (WMT's). De interacties van tumorcellen met de peritumorale zenuwcelcomponenten worden niet goed gekarakteriseerd. Hierin is een methode beschreven die de impact van neuronen op GBM-celinvasie evalueert. Dit artikel presenteert een geavanceerde co-cultuur in vitro assay die WMT invasie nabootst door de migratie van GBM stam-achtige cellen op neuronen te analyseren. Het gedrag van GBM-cellen in aanwezigheid van neuronen wordt gemonitord met behulp van een geautomatiseerde trackingprocedure met open-source en free-access software. Deze methode is nuttig voor veel toepassingen, met name voor functionele en mechanistische studies en voor het analyseren van de effecten van farmacologische middelen die GBM-celmigratie op neuronen kunnen blokkeren.

Neuronen met patronen die samen met fluorescerende GBM-cellen werden gekweekt, werden voorbereid zoals beschreven in de protocolsectie en er werden trackingexperimenten uitgevoerd. GBM-cellen veranderden snel hun vorm tijdens het migreren op de neuronen (Figuur 1B: paneel 6 en Video 1). Cellen migreerden langs de neuronale extensies, in een willekeurige beweging (Video 1). Fluorescerende GBM-cellen en niet-fluorescerende neuronen kunnen gema...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Hier presenteren we een eenvoudig te gebruiken co-cultuurtest om glioblastoom (GBM) migratie op neuronen met patronen te analyseren. We ontwikkelden een macro in FiJi-software voor eenvoudige kwantificering van GBM-celmigratie op neuronen en merkten op dat neuronen GBM-celinvasieve capaciteit wijzigen.

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Glioblastomen zijn verwoestende hersentumoren met een hoog invasief profiel. Dit co-kweeksysteem bootst de migratie van glioblastoomcellen op neuronen na om een van de invasieve routes die bij patiënten worden waargenomen, samen te vatten. De geometrie en samenstelling van ons co-cultuurmodel wordt nauwkeurig gecontroleerd.Het vergemakkelijkt een betere reproduceerbaarheid en ook een eenvoudige kwantificering van complexe biologische processen. Deze methode kan worden aangepast aan de klinische diagnose door vers gedissocieerde glioblastoomcellen en neuronen te co-cultiveren. Het definieert een klinische index, die erg belangrijk is als klinische uitkomst.Onze methode kan ook worden gebruikt om andere migrerende cellen te kwantificeren, zoals fibroblasten of immuuncellen. Joris Guyon, een promovendus uit mijn team, demonstreert de procedure. Om een substraat voor de micropatterning te maken, behandelt u 18 millimeter ronde glasafdekkingslips gedurende vijf minuten door de lucht of plasmaactivering voordat u de afdeklips gedurende een uur in een desiccator met 100 microliter triethoxysilane plaatst en vervolgens een oplossing van PEG-SVA incubeert met 100 milligram per milliliter gedurende een uur.Voeg voor geldepositie aan het einde van de incubatie drie microliters PLPP en 50 microliter absolute ethanol toe aan het midden van de glijbaan en wacht tot deze volledig droogt. Voor micropatterning van glazen dia's monteert u de afdeklip in een Ludin-kamer en plaatst u de kamer op het podium van een microscoop die is uitgerust met een automatisch scherpstelsysteem. Laad na het weergeven de micropattern-afbeeldingen in de software.Gebruik na automatische UV-verlichtingssequencing een pipet om de PLPP uitgebreid met PBS van de afdeklip te wassen. Incubeer vervolgens de deklip met 50 microgram per milliliter lag gedurende 30 minuten, gevolgd door een andere wasbeurt met PBS zoals aangetoond. Om een embryonale rat hippocampale neuroncultuur op de micropattern coverslips op te zetten, rehydrateer je na de laatste wasbeurt de glazen dia's met neuronaal celkweekmedium.Zaad vijf keer 10 tot de vierde rat hippocampale neuronen opgehangen in Neurobasal medium verrijkt met 3% paardenserum per vierkante centimeter op elke micropatterned coverslip voor een incubatie van 24 uur in een incubator van 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius. Centrifugeer gedissocieerde glioblastoomcellen gedurende vijf minuten bij 1.000 rpm en resuspendeer de pellet in glioblastoomcelkweekmedium en deponeer vervolgens een keer 10 naar de derde GBM-cellen over de micropatterned neuronen. Voor live celbeeldvorming van de cellen plaatst u de co-cultuur op het podium van een omgekeerde microscoop uitgerust met een thermostaatkamer van 37 graden Celsius en selecteert u de 20X-doelstelling.Gebruik vervolgens de multidimensionale acquisitietoolbox in de microscoopsoftware om elke twee minuten gedurende 12 uur live Brightfield- en epifluorescentie GFP-tomatenbeelden te verkrijgen in 16 verschillende posities op basis van het aantal patronen met neuronen. Voor neuronale netwerkanalyse selecteert u na beeldvorming één afbeelding uit de stapel. Klik met de rechtermuisknop op het netwerkgereedschap om het bijbehorende dialoogvenster met opties te openen en de instellingen aan te passen om een nauwkeurige segmentatie van de afbeeldingen te produceren.Klik op OK. Klik met de linkermuisknop op het netwerkgereedschap om de geselecteerde afbeelding te dupliceren en de afbeelding op te splitsen in de rode, grijze en groene kleurkanalen. Selecteer het grijze kanaal en voer contrastrekken uit om de scheiding tussen de verschillende gebieden te verbeteren. Gebruik de Sobel-randdetector om de 2D-signaalverwerkingsconvolutie uit te voeren zoals gegroepeerd onder het commando zoekrand.Voor dubbele filtering past u Gaussiaanse vervaging en een mediaanfilter toe om de ruis te verminderen en het objectsignaal vloeiend te maken. Als u wilt converteren naar masker, voert u aangepaste drempelalgoritmen uit om een binaire afbeelding met zwart-witpixels te verkrijgen. Skeletteer vervolgens het celgebied in een eenvoudig netwerk en gebruik filterdeeltjes om kleine niet-genetwerkte deeltjes in de resultaten te verwijderen.Netwerkfilterdeeltjes in een netwerkafbeelding. Om rode en groene kanalen te verkrijgen, voert u dubbele filtering uit en converteert u naar masker zoals aangetoond met behulp van de aangepaste drempelmethode. Gebruik analysedeeltjes om de celmorfologie in de binaire groene afbeelding te bepalen.Gebruik de operator of om alle kanalen samen te voegen met behulp van hun interessegebieden en pas hun oorspronkelijke kleur aan in een eenvoudige RGB-afbeelding. Als u een motiliteitsanalyse met één cel wilt uitvoeren, klikt u met de rechtermuisknop op het hulpprogramma voor het volgen van één cel om het dialoogvenster met bijbehorende opties te openen en de instellingen aan te passen om een nauwkeurige segmentatie van afbeeldingen te produceren. Klik op OK en klik met de linkermuisknop op tracking met één cel om het grijze kanaal te verwijderen.Als u een afbeelding wilt genereren die overeenkomt met een afbeeldingsstapel op basis van de tijd, past u Z-projectie en dubbelfilter toe en converteert u deze om de paden te maskeren die door de cellen zijn achtergelaten. Verwijder de kleine deeltjes uit de binaire rode en groene afbeelding zoals aangetoond. Gebruik het gereedschap Interessegebied om elke contour van de celtracering te selecteren en schakel het selectievakje Randdetectie overslaan in het dialoogvenster Opties in.Isoleer het rode kanaal op de oorspronkelijke stapel en selecteer één interessegebied. Filter alle afbeeldingen dubbel en converteer naar masker zodat de centroide XY-positie van elke binarized nucleus kan worden bepaald. De XY-posities kunnen worden gebruikt om de gemiddelde vierkante verplaatsing, directionaliteitsverhouding en gemiddelde snelheid voor de cel te berekenen.Voor analyse van het bijhouden van meerdere cellen klikt u met de rechtermuisknop op het trackingprogramma om het dialoogvenster met bijbehorende opties te openen en de instellingen aan te passen om een nauwkeurige segmentatie van afbeeldingen te produceren. Klik met de linkermuisknop op de trackingtool om het grijze kanaal te verwijderen. Splits de rode en groene kanalen, verdubbel het filter en converteer naar masker.Gebruik vervolgens de opdracht beeldcalculator met de operator en om de kanalen samen te voegen, waardoor alleen het kernsignaal in de membranen achterblijft en de baanplot, gemiddelde vierkante verplaatsing, directionaliteitsverhouding en gemiddelde snelheid voor de cellen worden berekend, zoals aangetoond. Fluorescerende GBM samen met neuronen met patronen wijzigen snel hun vorm en tonen migratie langs neuronale extensies in een willekeurige beweging. GBM-cellen die op neuronen zijn gezaaid, vertonen een langwerpige vorm met meerdere uitsteeksels die de neuronsporen volgen, terwijl de cellen hun afgeronde vorm behouden wanneer ze op lag.In latere stadia van de cultuur kunnen dunne uitsteeksels die aan cellen linken, worden waargenomen in GBM neuronale coculturen. GBM-cellen die op neuronen worden gezaaid, vertonen een grotere migratiecapaciteit dan GBM-cellen die op lagmijn zijn gezaaid, zoals waargenomen in deze baanpercelen. Analyse van de fluorescerende samenvloeiing van de cellen toont aan dat gedurende een observatieperiode van 500 minuten meer celmigratie wordt waargenomen wanneer de sferoïden samen met neuronen worden gekweekt dan wanneer de cellen alleen op lagmijn worden gekweekt.Aan het einde van de analyse is bijna de helft van het patroon bedekt met GBM-cellen, terwijl de sferoïden die op lag blijven gekweekt, niet aan de coverslip worden toegeschreven. Afhankelijk van de biologische vragen die u wilt beantwoorden, moet men ervoor zorgen dat het patroonontwerp en ook de celdichtheid representatief zijn voor de in vivo omstandigheden. De cellen kunnen worden gefixeerd en afgebeeld door confocale microscopie.Live beeldvorming is ook mogelijk omdat onze methode de beeldvormingsmogelijkheden niet aantast. Deze techniek is zeer geschikt voor het bestuderen van moleculaire interactie, zoals metabole uitwisselingen tussen glioblastoomcellen en neuronen. Het maakt het mogelijk om functie biologische processen te verkennen.Experimenten met hoge doorvoer kunnen ook voor klinische doeleinden worden uitgevoerd.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Met behulp van de Dot-Assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulair en cellulaire Lung Model studie Tumor uitzaaiingen

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Micro arrays gebruiken om micro-milieueffecten te ondervragen op cellulaire fenotypes bij kanker

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolatie van stam-achtige cellen uit 3-dimensionale Spheroid-culturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...