Name: co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פונדציה ARC 2020, ליגה קונטרה לה סרטן (Comite de la Gironde), ARTC, תוכנית סרטן 2021, INCA PLBIO. Alveole נתמך על ידי סוכנות לאומית דה לה Recherche (גרנט Labex מוח ANR-10-LABX-43). ז'וריס גיאון הוא מקבל מלגת בית החולים האוניברסיטאי טולוז (CHU טולוז).

הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל החולים (מבית החולים האוקלאנד, ברגן, נורווגיה, על פי תקנות ועדת האתיקה המקומית). פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות ועדות האתיקה של מחקר בני אדם ובעלי חיים באוניברסיטת בורדו. חולדות בהריון שוכנו וטופלו במתקן החיות של אוניברסיטת בורדו. המתת חסד של חולדה בהריון ב-E18 בוצע?...

<ol>
	<li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma.">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li><li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance.">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li><li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1&#945;/CXCR4+expression+in+glioblastomas.">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1&#945;/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li><li>Boy&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CXCR3/LRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors.">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571 (2017).</li><li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development.">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146 (2019).</li><li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks.">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li><li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma.">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+Printing+by+Light?Induced+Molecular+Adsorption.">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li><li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells.">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li><li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems.">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li><li>Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates.">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).</li><li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+a+dish:+the+promise+of+iPSC-derived+neurons.">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li><li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt/&#946;-catenin+signalling.">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/&#946;-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li></ol>

Glioblastomas לפלוש בהרחבה parenchyma באמצעות מצבים שונים: אפשרות משותפת של כלי הדם שמסביב, פלישה ביניים, או פלישה על WMTs18. מצב זה אינו מאופיין היטב בספרות בגלל הקושי למצוא מתאים במבחנה או במודלים vivo הקשורים פלישת WMT. כאן, מודל פשוט הוצע שבו נוירונים מכרסמים מתורבתים היו בדוגמת על...

גליומות ממאירות ראשוניות, כולל GBMs, הן גידולים הרסניים, עם שיעור הישרדות בינוני של 12 עד 15 חודשים שדווחו לחולי GBM. הטיפול הנוכחי מסתמך על כריתה גדולה של מסת הגידול וכימותרפיה בשילוב עם הקרנות, אשר רק מאריך את שיעור ההישרדות בכמה חודשים. כשלים טיפוליים קשורים קשר הדוק לאספקת סמים לקויה על פני מחסום הדם - מוח (BBB) ולצמיחה פולשנית בחללים perivascular, קרום המוח, ולאורך WMTs1. פלישה Perivascular, המכונה גם שיתוף כלי דם אפשרות, הוא תהליך נחקר היטב, ואת המנגנונים המולקולריים מתחילים להיות ברורים; עם זאת, תהליך הפלישה לתא GBM לאורך WMTs אינו מובן היטב. תאים סרטניים נודדים למוח הבריא לאורך המבנים המשניים של שרר2. ואכן, לפני כמעט מאה שנה, הנס-יואכים שרר תיאר את הנתיבים הפולשניים של GBM, שכעת מכונים satellitosis פרינורונלי, satellitosis perivascular, התפשטות תת-צינורית, פלישה לאורך WMT (איור 1A).
כמה כימוקינים הקולטנים שלהם, כגון פקטור-1α (SDF1α) ו C-X-C מוטיב קולטן כימוקין 4 (CXCR4), אבל לא גורם גדילה אנדותל כלי הדם (VEGF), נראה מעורב פלישת WMT3. לאחרונה, ציר NOTCH1-SOX2 transcellular הוכח להיות מסלול חשוב בפלישה WMT של תאים GBM4. המחברים תיארו כיצד תאים דמויי גזע GBM לפלוש parenchyma המוח על נוירונים unmyelinated חלקית, מה שמרמז על הרס של נדן מיאלין על ידי תאים GBM. אבן דרך הושגה בשנת 2019 כאשר שלושה מאמרים פורסמו בכתב העת Nature, והדגישו את תפקידה של הפעילות החשמלית בפיתוח גליומה5,6. עבודה מכוננת של מונג'ה ומשתפי פעולה שופכת אור על התפקיד המרכזי של פעילות חשמלית בהפרשת נוירוליגין-3, המקדמת פיתוח גליומה.
וינקלר ומשתפי פעולה תיארו קשרים בין תאי GBM (microtubes) להיות חיוני בשלבים פולשניים, ולאחרונה, אינטראקציות בין תאים GBM ותאי עצב באמצעות סינפסות נוירוגליומה שתוארו לאחרונה. מבנים אלה מעדיפים גירוי גלוטמטרגי של קולטני α אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-isoxazolepropionic (אמפא) הממוקמים בקרום התא GBM, המקדם התפתחות גידולים ופלישה. פלישת תאים סרטניים היא תהליך מרכזי בהפצת גרורות או מוקדים משניים מרוחקים, כפי שנצפה בחולי GBM. מספר גורמים זוהו להיות חשובים פלישת GBM כגון תרומבוספונדין-1, בטא גורם גדילה טרנספורמציה (חלבון מטריקוולרי מוסדר TGFβ, או קולטן כימוקין CXCR3)7,8.
כאן, מודל ביומימטי פשוט תואר לחקר פלישת GBM, שבו נוירונים מעוצבים על עקבות של למין, ותאי GBM נזרעים עליו, כתאים בודדים או כספרוידים(איור 1B). שתי ההגדרות הניסיוניות נועדו לשחזר את הפלישה לנוירונים, אשר נצפתה ב GBM9,10,11. מודלים כאלה פותחו בעבר כמו ביו-חומרים nanofiber מיושר (electrospinning קליפת ליבה) המאפשרים ללמוד נדידת תאים על ידי אפנון תכונות מכניות או כימיות12. מודל התרבות המשותפת המתואר במאמר זה מאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו תאי GBM בורחים על נוירונים על ידי הגדרת מסלולים מולקולריים חדשים המעורבים בתהליך זה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round-bottom plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2582624</td>
			<td>Used to prepare spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C (long-term) or 4 &#176;C (short-term), sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>111580</td>
			<td>Cell culture substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator cartridges</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z363456-6EA</td>
			<td>Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software, MTrack2 macro</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm&#178;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td></td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Promotes neuronal adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>loading of envisioned micropatterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Software&#160;</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscopy automation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope equipped with a motorized stage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PLPPclassic_1ml</td>
			<td>Photoinitiator used to degrade the PEG brush</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>VA-PEG-VA-5000-5g</td>
			<td>Used as an anti-fouling coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PRIMO1</td>
			<td>Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions

Glioblastomas (GBMs), כיתה IV גליומות ממאירות, הם אחד הסוגים הקטלניים ביותר של סרטן אנושי בגלל המאפיינים האגרסיביים שלהם. למרות ההתקדמות המשמעותית בגנטיקה של גידולים אלה, איך תאי GBM לפלוש parenchyma המוח בריא אינו מובן היטב. יש לציין כי הוכח כי תאי GBM פולשים לחלל הצמיגים בדרכים שונות; העניין העיקרי של נייר זה הוא המסלול לאורך דרכי חומר לבן (WMTs). האינטראקציות של תאים סרטניים עם רכיבי תאי העצבים הציצוניים אינן מאופיינים היטב. להלן, שיטה תוארה המעריכה את ההשפעה של נוירונים על פלישת תאים GBM. מאמר זה מציג תרבות משותפת מתקדמת במבחנה המחקה פלישת WMT על ידי ניתוח הנדידה של תאים דמויי גזע GBM על נוירונים. ההתנהגות של תאי GBM בנוכחות נוירונים מנוטרת באמצעות הליך מעקב אוטומטי עם תוכנת קוד פתוח וגישה חופשית. שיטה זו שימושית עבור יישומים רבים, בפרט, עבור מחקרים פונקציונליים ומכניסטיים, כמו גם לניתוח ההשפעות של סוכנים תרופתיים שיכולים לחסום נדידת תאים GBM על נוירונים.

נוירונים בעלי תבנית משותפת עם תאי GBM פלואורסצנטיים הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקול, ובוצעו ניסויי מעקב. תאי GBM שינו במהירות את צורתם תוך כדי הגירה לנוירונים (איור 1B: לוח 6 ווידאו 1). תאים היגרו לאורך ההרחבות העצביות, בתנועה אקראית (וידאו 1). ניתן להבחין...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

כאן, אנו מציגים מבחני תרבות משותפת קלים לשימוש כדי לנתח נדידת גליובלסטומה (GBM) על נוירונים בדוגמת. פיתחנו מאקרו בתוכנת FiJi לכימות קל של נדידת תאי GBM על נוירונים, והבחנו כי נוירונים לשנות קיבולת פולשנית של תא GBM.

תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Glioblastomas הם גידולים הרסניים במוח עם פרופיל פולשני גבוה. מערכת תרבות משותפת זו מחקה נדידת תאי גליובלסטומה על נוירונים כדי לכבוש מחדש את אחד המסלולים הפולשניים שנצפו בחולים. הגיאומטריה וההרכב של מודל התרבות המשותפת שלנו נשלטים במדויק.זה מקל על רבייה טובה יותר וגם כימות פשוט של תהליכים ביולוגיים מורכבים. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לאבחון קליני על ידי שיתוף culturing תאים גליובלסטומה מנותקים טריים נוירונים. זה מגדיר מדד קליני, וזה מאוד חשוב כמו תוצאה קלינית.השיטה שלנו יכולה לשמש גם לכימות תאים נודדים אחרים, כגון פיברובלסטים או תאים חיסוניים. מי שתדגים את ההליך תהיה ג'וריס גיאון, דוקטורנטית מהצוות שלי. כדי להפוך את המצע עבור micropatterning, לטפל 18 מילימטר מעגלי זכוכית coverslips על ידי הפעלת אוויר או פלזמה במשך חמש דקות לפני הצבת coverslips ב יבוש עם 100 microliters של triethoxysilane במשך שעה אחת, ואז דגירה פתרון של PEG-SVA ב 100 מיליגרם למיליליטר במשך שעה אחת.לתצהיר ג'ל, בסוף הדגירה, מוסיפים שלושה מיקרוליטרים של PLPP ו -50 מיקרוליטרים של אתנול מוחלט למרכז המגלשה ומחכים עד שהוא מתייבש לחלוטין. עבור micropatterning שקופית זכוכית, הר את הכיסוי בתא לודין ומניחים את התא על הבמה של מיקרוסקופ מצויד במערכת מיקוד אוטומטי. לאחר ההדמיה, טען את תמונות המיקרופטרן לתוכנה.לאחר רצף תאורת UV אוטומטי, השתמש בפיפטה כדי לשטוף את ה- PLPP מהכיסוי בהרחבה עם PBS. לאחר מכן דגירה את הכיסוי עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של למינצין במשך 30 דקות, ואחריו לשטוף עוד עם PBS כפי שהוכח. כדי להקים תרבות נוירון היפוקמפוס עכברוש עוברי על coverslips micropattern, לאחר הכביסה האחרונה, rehydrate שקופיות זכוכית עם מדיום תרבות התא העצבי.זרע חמש פעמים 10 לנוירונים ההיפוקמפוסים החולדה הרביעי מושעה במדיום Neurobasal מועשר 3% סרום סוס לסנטימטר מרובע על כל כיסוי micropatterned עבור דגירה 24 שעות ביממה ב 5% פחמן דו חמצני חממה ב 37 מעלות צלזיוס. תאי גליובלסטומה מנותקים צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 1, 000 סל"ד ו resuspend גלולה במדיום תרבות תא גליובלסטומה, ולאחר מכן להפקיד פעם אחת 10 לתאי GBM השלישי על נוירונים micropatterned. להדמיית תאים חיים של התאים, הניחו את התרבות המשותפת על הבמה של מיקרוסקופ הפוך המצויד בתא תרמוסטט של 37 מעלות צלזיוס ובחרו את המטרה 20X.לאחר מכן השתמש בארגז הכלים רב מימדי רכישות בתוכנת מיקרוסקופ לרכוש תמונות עגבניות GFP ברייטפילד חי epifluorescence כל שתי דקות במשך 12 שעות ב 16 עמדות שונות המבוססות על מספר דפוסים עם נוירונים. לניתוח רשת עצבית, לאחר ההדמיה, בחר תמונה אחת מהערימה. לחצו לחיצה ימנית על כלי הרשת לפתיחת תיבת הדו-שיח המתאימה של האפשרויות ולהתאמת ההגדרות ליצירת פילוח מדויק של התמונות.לחץ על אישור. לחצו לחיצה שמאלית על כלי הרשת כדי לשכפל את התמונה שנבחרה ולפצל את התמונה לערוצי הצבעים האדומים, האפורים והירוקים. בחרו בערוץ האפור ובצעו שיפור מתיחת ניגודיות לשיפור ההפרדה בין האזורים השונים. השתמש בגלאי קצה Sobel כדי לבצע את התולעת של עיבוד אותות דו-מימדית כמקובץ תחת הפקודה find edge.לסינון כפול, החל טשטוש גאוסיאני ומסנן חציוני כדי להפחית את הרעש ולהחליק את אות האובייקט. להמרה למסיכה, בצעו אלגוריתמי סף מותאמים לקבלת תמונה בינארית עם פיקסלים בשחור-לבן. לאחר מכן, שלד אזור התא לרשת פשוטה ולהשתמש חלקיקי מסנן כדי להסיר חלקיקים קטנים שאינם מרושתים בתוצאות.חלקיקי מסנן רשת בתמונת רשת. לקבלת ערוצים אדומים וירוקים, בצעו סינון כפול והמירו למסיכה כפי שהוכח בשיטת הסף המותאמת. השתמש לנתח חלקיקים כדי לקבוע את מורפולוגיה התא בתמונה הירוקה הבינארית.השתמש או המפעיל כדי למזג את כל הערוצים באמצעות אזורי העניין שלהם להתאים מחדש את הצבע הראשוני שלהם לתוך תמונת RGB פשוטה. כדי לבצע ניתוח תנועתיות של תא יחיד, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כלי המעקב אחר תאים בודדים כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח המתאימה של האפשרויות ולהתאים את ההגדרות ליצירת פילוח מדויק של תמונות. לחץ על אישור ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מעקב אחר תא בודד כדי להסיר את הערוץ האפור.ליצירת תמונה המתאימה לערימת תמונות לפי השעה, החל הקרנת Z וסינון כפול והמרה כדי להסוות את השבילים שהשאירו התאים. הסר את החלקיקים הקטנים מהתמונה הבינארית האדומה והירוקה כפי שהוכח. השתמש בכלי אזור העניין כדי לבחור כל מיתאר של מעקב התא וסמן את התיבה זיהוי קצה דילוג בחלון תיבת הדו-שיח אפשרויות.בודדו את הערוץ האדום בערימה המקורית ובחרו אזור מעניין אחד. סנן פעמיים את כל התמונות והמר למסיכה כדי לקבוע את מיקום ה- XY הצנטרואיד של כל גרעין בינארי. ניתן להשתמש במיקומים XY כדי לחשב את התזוזה הריבועית הממוצעת, את יחס הכיווניות ואת המהירות הממוצעת עבור התא.לניתוח מעקב אחר תאים מרובים, לחצו לחיצה ימנית על כלי המעקב כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח המתאימה של האפשרויות ולהתאים את ההגדרות ליצירת פילוח מדויק של תמונות. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כלי המעקב כדי להסיר את הערוץ האפור. פצל את הערוצים האדומים והירוקים, סנן פעמיים והמר למסיכה.לאחר מכן השתמש בפקודה מחשבון התמונה עם האופרטור ו כדי למזג את הערוצים ולהשאיר רק את אות הגרעין הממוקם בתוך הקרומים ולחשב את התוויית המסלול, ממוצע תזוזה מרובעת, יחס כיווניות ומהירות ממוצעת עבור התאים כפי שהוכח. GBM פלואורסצנטי במשותף עם נוירונים בדוגמת לשנות במהירות את צורתם ולהראות הגירה לאורך הרחבות עצביות בתנועה אקראית. תאי GBM הנזרעים על גבי נוירונים מציגים צורה מוארכת עם בליטות מרובות העוקבות אחר מסלולי הנוירונים בעוד התאים שומרים על צורתם המעוגלת כאשר הם מתורבתים על למין.בשלבים מאוחרים יותר של התרבות, בליטות דקות המקשרות לתאים ניתן לראות בתרבויות משותפות עצביות GBM. תאי GBM הנזרעים על גבי נוירונים מדגימים יכולת נדידה גדולה יותר מאשר תאי GBM הנזרעים על למין כפי שנצפה בחלקות מסלול אלה. ניתוח המפגש הפלואורסצנטי של התאים מראה כי במשך 500 דקות תצפית, נדידת תאים יותר נצפתה כאשר spheroids הם במשותף עם נוירונים מאשר כאשר התאים מתורבתים על למינצין בלבד.ואכן עד סוף הניתוח, כמעט מחצית מהתבנית מכוסה בתאי GBM בעוד הכדורואידים המתורבתים על למינין נשארים לא מרוסנים לכיסוי. בהתאם לשאלות הביולוגיות שאתה רוצה לענות, יש לדאוג כי עיצוב הדפוס וגם את צפיפות התא מייצגים את התנאים in vivo. התאים יכולים להיות קבועים ודימוי על ידי מיקרוסקופיה confocal.הדמיה חיה אפשרית גם מכיוון שהשיטה שלנו אינה פוגעת ביכולות ההדמיה. טכניקה זו מתאימה היטב לחקר אינטראקציה מולקולרית, כגון חילופי מטבוליים בין תאי גליובלסטומה ותאי עצב. זה מאפשר לחקור תהליכים ביולוגיים פונקציה.ניסויים בעלי תפוקה גבוהה יכולים להיעשות גם למטרות קליניות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

סמים מבוססי Cytometry זרימה מערכת הסינון לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים התמיינות של תאי גזע גליובלסטומה

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

באמצעות וזמינותו נקודה כדי לנתח את ההעברה של גיליונות תא

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

שימוש במיקרו מערכים לחקור השפעה מיקרוסביבתית על פנוטיפים סלולריים בסרטן

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

בידוד של תאים כמו גזע מתרבויות תלת ממדיות ספרואיד

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...