Name: co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00
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इस काम को प्रियतम एआरसी 2020, लिग कॉन्ट्रे ले कैंसर (कॉमिट डे ला गिरोंडे), एआरटीसी, प्लान कैंसर 2021, इंका पीएलबीआईओ द्वारा समर्थित किया गया था। अल्वेल को एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे (ग्रांट लैबेक्स ब्रेन एएनआर-10-लैबएक्स-43) द्वारा समर्थित किया गया है। जोरिस गुयॉन टूलूज़ यूनिवर्सिटी अस्पताल (चू टूलूज़) से फैलोशिप के प्राप्तकर्ता हैं।

सूचित लिखित सहमति सभी रोगियों से प्राप्त किया गया था (Haukeland अस्पताल, Bergen, नॉर्वे से, स्थानीय नैतिकता समिति के नियमों के अनुसार) । यह प्रोटोकॉल बोर्डो विश्वविद्यालय मानव और पशु अनुसंधान नैतिकता समितियों क?...

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	<li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma.">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li><li>Scherer, H. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks.">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li><li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma.">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+Printing+by+Light?Induced+Molecular+Adsorption.">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li><li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells.">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li><li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems.">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li><li>Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates.">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).</li><li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li><li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt/&#946;-catenin+signalling.">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/&#946;-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li></ol>

ग्लियोब्लास्टोमा बड़े पैमाने पर विभिन्न तरीकों का उपयोग करके परेन्चिमा पर आक्रमण करते हैं: आसपास की रक्त वाहिकाओं का सह-विकल्प, मध्यवर्ती आक्रमण, या WMTs18पर आक्रमण। इस उत्तरार्द्ध मोड को साहित?...

GBMs सहित प्राथमिक घातक ग्लियोमास, विनाशकारी ट्यूमर हैं, 12 से 15 महीने की एक मध्यम जीवित रहने की दर के साथ GBM रोगियों के लिए रिपोर्ट । वर्तमान चिकित्सा बड़े ट्यूमर मास रीसेक्शन और रेडियोथेरेपी के साथ मिलकर कीमोथेरेपी पर निर्भर करता है, जो केवल कुछ महीनों तक जीवित रहने की दर का विस्तार करता है। चिकित्सीय विफलताओं का संबंध रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) में खराब दवा वितरण और पेरिवास्कुलर रिक्त स्थान, मेनिंग्स और डब्ल्यूएमटी1के साथ आक्रामक विकास से है। पेरिवैस्कुलर आक्रमण, जिसे संवहनी सह-विकल्प भी कहा जाता है, एक अच्छी तरह से अध्ययन की प्रक्रिया है, और आणविक तंत्र स्पष्ट होने लगे हैं; हालांकि, WMTs के साथ जीबीएम सेल आक्रमण की प्रक्रिया अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है। ट्यूमर कोशिकाओं को Scherer माध्यमिकसंरचनाओं 2के साथ स्वस्थ मस्तिष्क में स्थानांतरित करते हैं । दरअसल, लगभग एक सदी पहले, हंस-जोआचिम शेरर ने जीबीएम के आक्रामक मार्गों का वर्णन किया था, जिन्हें अब पेरिनेरोनल सैटेलिटोसिस, पेरिवासुलर सैटेलिटोसिस, उपपिअल प्रसार और डब्ल्यूएमटी(चित्रा 1 ए)के साथ आक्रमण के रूप में जाना जाता है।
कुछ केमोकिन और उनके रिसेप्टर्स, जैसे स्ट्रोमल सेल-व्युत्पन्न कारक-1α (SDF1α) और सी-एक्स-सी आकृति केमोकिन रिसेप्टर 4 (CXCR4), लेकिन वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) में नहीं, डब्ल्यूएमटी आक्रमण3में फंसाया जा रहा है। हाल ही में, एक ट्रांससेलुलर पायदान1-SOX2 धुरी को जीबीएम कोशिकाओं4के WMT आक्रमण में एक महत्वपूर्ण मार्ग दिखाया गया है। लेखकों ने बताया कि कैसे GBM स्टेम की तरह कोशिकाओं आंशिक रूप से बेहिषक न्यूरॉन्स पर मस्तिष्क परनामिष्कार पर आक्रमण, GBM कोशिकाओं द्वारा myelin म्यान के विनाश का सुझाव । 2019 में एक मील का पत्थर तब पहुंचा जब तीन लेख प्रकृति पत्रिका में प्रकाशित हुए, जो ग्लियोमा विकास5, 6में विद्युत गतिविधि की भूमिका को रेखांकित करतेथे। मोनजे और सहयोगियों द्वारा मौलिक काम ने न्यूरोलिजिन-3 के स्राव में इलेक्ट्रिक गतिविधि की केंद्रीय भूमिका पर प्रकाश डाला, जो ग्लियोमा विकास को बढ़ावा देता है।
विंकलर और सहयोगियों ने जीबीएम कोशिकाओं (माइक्रोट्यूब) के बीच कनेक्शन को आक्रामक कदमों में महत्वपूर्ण बताया, और हाल ही में, नए वर्णित न्यूरोग्लिओमा सिनेप्स के माध्यम से जीबीएम कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच बातचीत। वे संरचनाएं α-अमीनो-3-हाइड्रोक्सी-5-मिथाइल-4-आइसोक्साजोलप्रोपियोनिक एसिड (एम्पा) रिसेप्टर्स की ग्लूटाएत्सेर्गिक उत्तेजना का पक्ष लेती हैं, जो ट्यूमर के विकास और आक्रमण को बढ़ावा देती है। ट्यूमर सेल आक्रमण मेटास्टेस या दूर के माध्यमिक फोसी के प्रसार में एक केंद्रीय प्रक्रिया है, जैसा कि जीबीएम रोगियों में मनाया जाता है। कई कारकों की पहचान की गई है जैसे कि थ्रोम्बोस्पॉन्डिन-1, एक ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर बीटा (टीजीएफए-रेगुलेटेड मैट्रिसेलर प्रोटीन, या केमोकिन रिसेप्टर CXCR3)7,8जैसे जीबीएम आक्रमण में महत्वपूर्ण होने के लिए।
यहां, जीबीएम आक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक सरलीकृत बायोमिमेटिक मॉडल का वर्णन किया गया है, जिसमें न्यूरॉन्स लेमिनिन के पटरियों पर पैटर्न किए जाते हैं, और जीबीएम कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं के रूप में या गोलाकार(चित्रा 1B)के रूप में वरीयता दी जाती है। दो प्रायोगिक सेटिंग्स का उद्देश्य न्यूरॉन्स पर आक्रमण को फिर सेकाटना है, जो जीबीएम9,10, 11में मनायाजाताहै। इस तरह के मॉडलों को अतीत में गठबंधन नैनोफाइबर बायोमैटेरियल्स (कोर-शेल इलेक्ट्रोस्पिनिंग) के रूप में विकसित किया गया है जो यांत्रिक या रासायनिक गुणों को मॉडुलेट करके सेल माइग्रेशन का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं12। सह संस्कृति मॉडल इस लेख में वर्णित कैसे GBM कोशिकाओं को इस प्रक्रिया में शामिल नए आणविक रास्ते को परिभाषित करके न्यूरॉन्स पर बच की एक बेहतर समझ की अनुमति देता है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round-bottom plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2582624</td>
			<td>Used to prepare spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C (long-term) or 4 &#176;C (short-term), sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>111580</td>
			<td>Cell culture substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator cartridges</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z363456-6EA</td>
			<td>Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software, MTrack2 macro</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm&#178;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td></td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Promotes neuronal adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>loading of envisioned micropatterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Software&#160;</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscopy automation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope equipped with a motorized stage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PLPPclassic_1ml</td>
			<td>Photoinitiator used to degrade the PEG brush</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>VA-PEG-VA-5000-5g</td>
			<td>Used as an anti-fouling coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PRIMO1</td>
			<td>Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions

ग्लियोब्लास्टोम (जीबीएम), ग्रेड चतुर्थ घातक ग्लियोमास, उनकी आक्रामक विशेषताओं के कारण मानव कैंसर के सबसे घातक प्रकारों में से एक हैं। इन ट्यूमर की आनुवंशिकी में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, कैसे GBM कोशिकाओं स्वस्थ मस्तिष्क parenchyma पर आक्रमण अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है । विशेष रूप से, यह दिखाया गया है कि जीबीएम कोशिकाएं विभिन्न मार्गों के माध्यम से पेरिटुमोरल स्पेस पर आक्रमण करती हैं; इस पेपर का मुख्य हित सफेद पदार्थ के इलाकों (डब्ल्यूएमटी) के साथ मार्ग है। पेरिटुमोरल तंत्रिका कोशिका घटकों के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत अच्छी तरह से विशेषता नहीं है। इसके साथ, एक विधि का वर्णन किया गया है जो जीबीएम सेल आक्रमण पर न्यूरॉन्स के प्रभाव का मूल्यांकन करता है। यह पेपर विट्रो परख में एक उन्नत सह-संस्कृति प्रस्तुत करता है जो न्यूरॉन्स पर जीबीएम स्टेम जैसी कोशिकाओं के प्रवास का विश्लेषण करके डब्ल्यूएमटी आक्रमण की नकल करता है। न्यूरॉन्स की उपस्थिति में जीबीएम कोशिकाओं के व्यवहार को ओपन-सोर्स और फ्री-एक्सेस सॉफ्टवेयर के साथ एक स्वचालित ट्रैकिंग प्रक्रिया का उपयोग करके निगरानी की जाती है। यह विधि कई अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी है, विशेष रूप से, कार्यात्मक और मशीनी अध्ययन के लिए और साथ ही औषधीय एजेंटों के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए जो न्यूरॉन्स पर जीबीएम सेल माइग्रेशन को अवरुद्ध कर सकते हैं।

फ्लोरोसेंट जीबीएम कोशिकाओं के साथ पैटर्न वाले न्यूरॉन्स को प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में तैयार किया गया था, और ट्रैकिंग प्रयोग किए गए थे। जीबीएम कोशिकाओं को जल्दी से उनके आकार संशोधित करते ह?...

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Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

यहां, हम पैटर्न वाले न्यूरॉन्स पर ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए एक आसान-से-उपयोग सह-संस्कृति परख पेश करते हैं। हमने न्यूरॉन्स पर जीबीएम सेल माइग्रेशन के आसान मात्राकरण के लिए फिजी सॉफ्टवेयर में एक मैक्रो विकसित किया, और देखा कि न्यूरॉन्स जीबीएम सेल इनवेसिव क्षमता को संशोधित करते हैं।

प्रवासन और सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पैटर्न वाले न्यूरॉन्स पर ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम जैसी कोशिकाओं की सह-संस्कृति

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

ग्लियोब्लास्टोमा एक उच्च आक्रामक प्रोफ़ाइल के साथ विनाशकारी ब्रेन ट्यूमर हैं। यह सह-संस्कृति प्रणाली रोगियों में देखे गए आक्रामक मार्गों में से एक को फिर से काटना करने के लिए न्यूरॉन्स पर ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के प्रवास की नकल करती है। हमारे सह-संस्कृति मॉडल की ज्यामिति और संरचना ठीक नियंत्रित है।यह एक बेहतर प्रजनन क्षमता और जटिल जैविक प्रक्रियाओं का सीधा मात्राकरण भी प्रदान करता है। इस विधि को ताजा अलग ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं और न्यूरॉन्स को सह-संस्कृति द्वारा नैदानिक निदान के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह एक नैदानिक सूचकांक को परिभाषित करता है, जो नैदानिक परिणाम के रूप में बहुत महत्वपूर्ण है।हमारी विधि का उपयोग फाइब्रोब्लास्ट या प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे अन्य माइग्रेट कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन Joris गुयान, मेरी टीम से एक पीएचडी के छात्र होगा । माइक्रोपैटर्निंग के लिए सब्सट्रेट बनाने के लिए, एक घंटे के लिए ट्राइथॉक्सीलेन के 100 माइक्रोलीटर के साथ एक डेसीकेटर में कवरस्लिप रखने से पहले पांच मिनट के लिए हवा या प्लाज्मा सक्रियण द्वारा 18 मिलीमीटर परिपत्र ग्लास कवरस्लिप का इलाज करें, फिर एक घंटे के लिए 100 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पर खूंटी-स्वे के समाधान को इनक्यूबेट करें।जेल जमाव के लिए, इनक्यूबेशन के अंत में, स्लाइड के केंद्र पर पीएलपीपी के तीन माइक्रोलीटर और पूर्ण इथेनॉल के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि यह पूरी तरह से सूख न जाए। ग्लास स्लाइड माइक्रोपैटर्निंग के लिए, लुडिन कक्ष में कवरस्लिप को माउंट करें और ऑटो-फोकस सिस्टम से लैस माइक्रोस्कोप के चरण पर कक्ष रखें। इमेजिंग के बाद, माइक्रोपैटर्न छवियों को सॉफ्टवेयर में लोड करें।स्वचालित यूवी रोशनी अनुक्रमण के बाद, पीबीएस के साथ बड़े पैमाने पर कवरस्लिप से पीएलएपीपी को धोने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। फिर 30 मिनट के लिए लेमिनिन के मिलीलीटर प्रति 50 माइक्रोग्राम के साथ कवरस्लिप को इनक्यूबेट करें, इसके बाद प्रदर्शन के रूप में पीबीएस के साथ एक और धोने के बाद। पिछले धोने के बाद, माइक्रोपैटर्न कवरस्लिप पर एक भ्रूण चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन संस्कृति स्थापित करने के लिए, न्यूरोनल सेल संस्कृति माध्यम के साथ ग्लास स्लाइड को फिर से हाइड्रेट करें।बीज पांच बार 10 चौथे चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स न्यूरोबेसल माध्यम में निलंबित प्रत्येक माइक्रोपैटर्न्ड कवरलिप पर 3% घोड़े सीरम प्रति वर्ग सेंटीमीटर के साथ समृद्ध एक 24 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में इनक्यूबेशन । सेंट्रलाइज ने ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को 1, 000 आरपीएम पर पांच मिनट के लिए अलग किया और ग्लियोब्लास्टोमा सेल कल्चर मीडियम में गोली को फिर से खर्च करें, फिर माइक्रोपैटर्न न्यूरॉन्स पर तीसरे जीबीएम कोशिकाओं को एक गुना 10 जमा करें। कोशिकाओं के लाइव सेल इमेजिंग के लिए, सह-संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस थर्मोस्टेट कक्ष से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें और 20X उद्देश्य का चयन करें।फिर न्यूरॉन्स के साथ पैटर्न की संख्या के आधार पर 16 विभिन्न पदों में 12 घंटे के लिए हर दो मिनट में लाइव ब्राइटफील्ड और epifluorescence GFP टमाटर छवियों को प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में बहुआयामी अधिग्रहण टूलबॉक्स का उपयोग करें। न्यूरोनल नेटवर्क विश्लेषण के लिए, इमेजिंग के बाद, स्टैक से एक छवि का चयन करें। संबंधित विकल्प संवाद बॉक्स खोलने और छवियों का एक सटीक विभाजन का उत्पादन करने के लिए सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए नेटवर्क टूल पर राइट-क्लिक करें।ओके पर क्लिक करें। चयनित छवि को डुप्लिकेट करने और छवि को लाल, भूरे और हरे रंग के चैनलों में विभाजित करने के लिए नेटवर्क टूल पर लेफ्ट-क्लिक करें। ग्रे चैनल का चयन करें और विभिन्न क्षेत्रों के बीच अलगाव को बेहतर बनाने के लिए विपरीत खिंचाव वृद्धि करें। खोज किनारे आदेश के तहत समूह के रूप में 2D सिग्नल प्रोसेसिंग कन्वोल्यूशन करने के लिए सोबेल एज डिटेक्टर का उपयोग करें।डबल फ़िल्टरिंग के लिए, शोर को कम करने और ऑब्जेक्ट सिग्नल को चिकना करने के लिए गॉसियन धुंधला और एक औसत फ़िल्टर लागू करें। मुखौटा में परिवर्तित करने के लिए, काले और सफेद पिक्सेल के साथ बाइनरी चित्र प्राप्त करने के लिए अनुकूलित सीमा एल्गोरिदम निष्पादित करें। इसके बाद, कोशिका क्षेत्र को एक साधारण नेटवर्क में कंकालित करें और परिणामों में छोटे गैर-नेटवर्क वाले कणों को हटाने के लिए फिल्टर कणों का उपयोग करें।नेटवर्क छवि में नेटवर्क फ़िल्टर कण। लाल और हरे रंग के चैनल प्राप्त करने के लिए, डबल फ़िल्टरिंग करें और अनुकूलित थ्रेसिंग विधि का उपयोग करके प्रदर्शित मुखौटा में परिवर्तित करें। बाइनरी ग्रीन इमेज में सेल आकृति विज्ञान निर्धारित करने के लिए कणों का विश्लेषण करें।अपने सभी चैनलों को रुचि के क्षेत्रों का उपयोग करके मर्ज करने और अपने प्रारंभिक रंग को एक साधारण आरजीबी छवि में समायोजित करने के लिए ऑपरेटर का उपयोग करें। एकल-सेल मोटिविटी विश्लेषण करने के लिए, संबंधित विकल्प संवाद बॉक्स खोलने और छवियों के सटीक विभाजन का उत्पादन करने के लिए सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए एकल सेल ट्रैकिंग टूल पर सही क्लिक करें। ग्रे चैनल को हटाने के लिए सिंगल-सेल ट्रैकिंग पर ओके और लेफ्ट-क्लिक पर क्लिक करें।समय के अनुसार एक छवि ढेर के अनुरूप छवि उत्पन्न करने के लिए, जेड प्रक्षेपण और डबल फ़िल्टर लागू करें और कोशिकाओं द्वारा छोड़े गए ट्रेल्स को मुखौटा में परिवर्तित करें। प्रदर्शन के रूप में बाइनरी लाल और हरे रंग की छवि से छोटे कणों को हटा दें। सेल ट्रेस के प्रत्येक समोच्च का चयन करने के लिए ब्याज उपकरण के क्षेत्र का उपयोग करें और विकल्प संवाद खिड़की में स्किप एज डिटेक्शन बॉक्स की जांच करें।मूल ढेर पर लाल चैनल को अलग करें और ब्याज के एक क्षेत्र का चयन करें। सभी छवियों को डबल फ़िल्टर करें और प्रत्येक बिनारीज़्ड नाभिक की सेंट्रोइड XY स्थिति को निर्धारित करने की अनुमति देने के लिए मुखौटा में परिवर्तित करें। XY पदों का उपयोग सेल के लिए औसत वर्ग विस्थापन, दिशात्मक अनुपात और औसत गति की गणना करने के लिए किया जा सकता है।कई कोशिकाओं ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए, संबंधित विकल्प संवाद बॉक्स खोलने के लिए ट्रैकिंग टूल पर सही क्लिक करें और छवियों का एक सटीक विभाजन का उत्पादन करने के लिए सेटिंग्स को समायोजित करें। ग्रे चैनल को हटाने के लिए ट्रैकिंग टूल पर लेफ्ट-क्लिक करें। लाल और हरे रंग के चैनलों, डबल फिल्टर को विभाजित करें, और मुखौटा में परिवर्तित करें।फिर झिल्ली के भीतर स्थित केवल नाभिक संकेत छोड़ने वाले चैनलों को मर्ज करने के लिए और ऑपरेटर के साथ छवि कैलकुलेटर कमांड का उपयोग करें और प्रक्षेपवक्र भूखंड, मतलब वर्ग विस्थापन, दिशात्मक अनुपात और कोशिकाओं के लिए औसत गति की गणना करें जैसा कि प्रदर्शन किया गया है। फ्लोरोसेंट जीबीएम पैटर्न वाले न्यूरॉन्स के साथ सह-सुसंस्कृत जल्दी से अपने आकार को संशोधित करता है और यादृच्छिक गति में न्यूरोनल एक्सटेंशन के साथ माइग्रेशन दिखाता है। जीबीएम कोशिकाओं न्यूरॉन्स पर वरीयता प्राप्त कई फलाव है कि न्यूरॉन पटरियों का पालन करें, जबकि कोशिकाओं को अपने गोल आकार बनाए रखने जब laminin पर सुसंस्कृत के साथ एक विस्तारित आकार प्रदर्शित करते हैं ।संस्कृति के बाद के चरणों में, कोशिकाओं को जोड़ने वाले पतले फलाव को जीबीएम न्यूरोनल सह-संस्कृतियों में देखा जा सकता है। जीबीएम कोशिकाओं न्यूरॉन्स पर वरीयता प्राप्त जीबीएम कोशिकाओं की तुलना में अधिक प्रवासी क्षमता का प्रदर्शन लेमिनिन पर वरीयता प्राप्त के रूप में इन प्रक्षेपवक्र भूखंडों में मनाया । कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट संगम का विश्लेषण दर्शाता है कि 500 मिनट की अवलोकन अवधि में, अधिक सेल माइग्रेशन तब देखा जाता है जब स्पेरोइड्स न्यूरॉन्स के साथ सह-सुसंस्कृत होते हैं जब कोशिकाएं अकेले लेमिनिन पर सुसंस्कृत होती हैं।वास्तव में विश्लेषण के अंत तक, लगभग आधे पैटर्न को जीबीएम कोशिकाओं से ढका जाता है जबकि लैमिनिन पर सुसंस्कृत स्फेरॉइड कवरस्लिप के लिए असाध्य रहते हैं। जैविक सवालों के आधार पर आप जवाब देना चाहते हैं, एक ध्यान रखना चाहिए कि पैटर्न डिजाइन और भी सेल घनत्व वीवो स्थितियों में के प्रतिनिधि हैं । कोशिकाओं को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा तय और इमेज किया जा सकता है।लाइव इमेजिंग भी संभव है क्योंकि हमारी विधि इमेजिंग क्षमताओं को ख़राब नहीं करती है। यह तकनीक आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जैसे ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच मेटाबोलिक एक्सचेंज। यह कार्य जैविक प्रक्रियाओं की खोज की अनुमति देता है।नैदानिक उद्देश्यों के लिए उच्च-थ्रूपुट प्रयोग भी किए जा सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Assays अध्ययन करने के लिए ग्लयोब्लास्टोमा आक्रमण की बृहतभक्षककोशिका और Microglia उत्तेजना

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Imaginal डिस्क ट्यूमर आदर्श: दृश्य और जीन अभिव्यक्ति और ट्यूमर invasiveness की मात्रा जेनेटिक मोज़ाइक का प्रयोग

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं के सेलुलर भेदभाव को बढ़ावा देने कि छोटे अणुओं की पहचान के लिए प्रवाह Cytometry आधारित दवा स्क्रीनिंग प्रणाली

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

कक्ष पत्रकों के माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए डॉट परख का उपयोग करना

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellular और सेलुलर फेफड़े मॉडल ट्यूमर मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

लाइव सेल इमेजिंग परख ग्लियोब्लास्टोमा ब्रेन ट्यूमर स्टेम सेल प्रवासन और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal लुगदी ऊतक और सह कैंसर कोशिकाओं के साथ संस्कृति से कोशिका अलगाव स्टेम उनके बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

कैंसर में सेलुलर Phenotypes पर Microenvironmental प्रभाव पूछताछ करने के लिए Microarrays का उपयोग

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

3-आयामी स्फेरॉइड संस्कृतियों से स्टेम जैसी कोशिकाओं का अलगाव

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

पारगम्य झिल्ली समर्थन के साथ सह संस्कृति का उपयोग कर मैक्रोफेज सक्रियण पर ट्यूमर स्रावित पैराक्रिन लिगांड्स के प्रभाव का अध्ययन

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...