Name: co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00
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この研究はフォンダシオンARC 2020、リーグ・コントル・ル・ガン(コミテ・ド・ラ・ジロンド)、ARTC、プランガン2021、INCA PLBIOによって支えられていました。アルベオールはアジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ(グラント・ラベックス・ブレインANR-10-LABX-43)によってサポートされています。ジョリス・ギヨンはトゥールーズ大学病院(CHUトゥールーズ)からフェローシップを受けています。

インフォームド・コンセントは、すべての患者(地元の倫理委員会の規則に従って、ノルウェーのベルゲンのハウケランド病院から)から得られました。このプロトコルはボルドー大学の人間と動物の研究倫理委員会のガイドラインに従います.妊娠中のラットは、ボルドー大学の動物施設に収容され、治療されました.E18タイミングの妊娠ラットの安楽死は、CO2を用いて行った。すべて?...

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	<li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma.">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li><li>Scherer, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li><li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt/&#946;-catenin+signalling.">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/&#946;-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li></ol>

神経膠芽腫は、周囲の血管のコオプション、間質の侵略、またはWMTs18への侵入など、さまざまなモードを使用して広くパレンチマに侵入する。この後者のモードは、WMTの侵略に関連するインビトロまたはインビボモデルで適切な発見に困難があるため、文献で十分に特徴付けられていない。ここでは、培養げっ歯類ニューロンをラミニンコーティングされた表?...

GBMを含む原発性悪性神経膠腫は壊滅的な腫瘍であり、GBM患者の中生存率は12〜15ヶ月である。現在の治療は、大規模な腫瘍大量切除術と化学療法に依存し、放射線療法と相まって、生存率を数ヶ月しか延長していない。治療障害は、血液脳関門(BBB)を横切る薬物送達不良と、血管内腔、髄液、およびWMTs1に沿った侵襲的な成長に密接に関連している。血管内侵入は血管の共同オプションとも呼ばれ、よく研究されたプロセスであり、分子機構が解明され始めています。しかし、WMTに沿ったGBM細胞浸潤のプロセスは十分に理解されていません。腫瘍細胞は、シェラーの二次構造に沿って健康な脳に移行する2.確かに、ほぼ1世紀前、ハンス・ヨアヒム・シェラーは、現在、脳血管内サテリトーシス、血管内サテリアトーシス、亜脈広がり、WMTに沿った侵略と呼ばれているGBMの侵襲的なルートを説明しました(図1A)。
一部のケモカインおよびその受容体は、例えば、間質細胞由来因子-1α(SDF1α)およびC-X-Cモチーフケモカイン受容体4(CXCR4)など、血管内皮増殖因子(VEGF4)には関与していないが、WMT浸潤因子3に関与しているようである。さらに最近では、細胞内NOTCH1-SOX2軸がGBM細胞4のWMT浸潤において重要な経路であることが示されている。著者らは、GBM幹細胞が部分的に非髄鞘のニューロン上で脳のパレンチマに侵入する方法を説明し、GBM細胞によるミエリン鞘の破壊を示唆した。2019年に3つの論文が連続してネイチャージャーナルに掲載され、グリオーマ開発における電気活動の役割を強調したマイルストーンに達しました5,6.Monjeと共同研究者による精細な研究は、神経膠腫の発達を促進するニューロリジン-3の分泌における電気活動の中心的な役割に光を当てた。
ウィンクラーと共同研究者は、侵襲的なステップにおいて重要であるGBM細胞(マイクロチューブ)間の接続、および最近、新たに記述された神経神経膠腫シナプスを介したGBM細胞とニューロン間の相互作用について説明した。これらの構造は、α-アミノ-3-ヒドロキシ-メチル-4-イソキサゾアプロピオン酸(AMPA)受容体のグルタミン酸刺激を好み、腫瘍の発生と浸潤を促進するGBM細胞膜に位置する。腫瘍細胞浸潤は、GBM患者において観察される転移または遠隔二次病巣の普及における中心的なプロセスである。トロンボシン−1のようなGBMの浸潤において重要であることがいくつかの要因が同定されている、変換成長因子β(TGFβ調節されたマトリセルタンパク質、またはケモカイン受容体CXCR3)7、8。
ここでは、ニューロンがラミニンの軌跡にパターン化され、GBM細胞が単一細胞またはスフェロイドとして播種されるGBMの浸潤を研究するための単純化されたバイオミメティックモデルが説明されている(図1B)。2つの実験設定は、GBM9、10、11で観察されるニューロンへの侵入を再現することを目的としています。このようなモデルは、機械的または化学的特性12を調節することによって細胞移動を研究することを可能にするアライメントナノファイバー生体材料(コアシェルエレクトロスピニング)として過去に開発されてきた。この記事で説明する共培養モデルは、このプロセスに関与する新しい分子経路を定義することによって、GBM細胞がニューロン上で脱出する方法をよりよく理解することを可能にする。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round-bottom plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2582624</td>
			<td>Used to prepare spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C (long-term) or 4 &#176;C (short-term), sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>111580</td>
			<td>Cell culture substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator cartridges</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z363456-6EA</td>
			<td>Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software, MTrack2 macro</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm&#178;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td></td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Promotes neuronal adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>loading of envisioned micropatterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Software&#160;</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscopy automation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope equipped with a motorized stage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PLPPclassic_1ml</td>
			<td>Photoinitiator used to degrade the PEG brush</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>VA-PEG-VA-5000-5g</td>
			<td>Used as an anti-fouling coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PRIMO1</td>
			<td>Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions

グレードIV悪性神経膠腫(GBM)は、その積極的な特性のためにヒト癌の最も致命的なタイプの一つです。これらの腫瘍の遺伝学の有意な進歩にもかかわらず、GBM細胞が健康な脳のパレンチマに侵入する方法はよく理解されていない。特に、GBM細胞が異なる経路を介して心房に侵入することが示されている。本稿の主な関心事は、白物庫(WMT)に沿った経路である。腫瘍細胞と腹分神経細胞成分との相互作用は十分に特徴付けられていない。本明細書において、GBM細胞浸潤に対するニューロンの影響を評価する方法が記載されている。本論文は、ニューロン上のGBM幹細胞様細胞の移動を解析することによってWMTの侵入を模倣する、高度な共培養イン・ニューロンを紹介する。ニューロンの存在下でのGBM細胞の挙動は、オープンソースおよびフリーアクセスソフトウェアを用いた自動追跡手順を使用して監視される。この方法は、多くの用途、特に機能的および機械学的研究、ならびにニューロンに対するGBM細胞の移動をブロックすることができる薬理学的薬剤の影響を分析するのに有用である。

蛍光GBM細胞と共培養したパターン化されたニューロンは、プロトコルセクションに記載されているように調製し、追跡実験を行った。GBM細胞は、ニューロン上で移行しながら、それらの形状を素早く変更しました(図1B:パネル6 と ビデオ1)。細胞は、ランダムな動きで、ニューロンの拡張に沿って移行しました (ビデオ 1).蛍光GBM細胞?...

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Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

ここでは、パターン化されたニューロン上で神経膠芽腫(GBM)の移行を分析するための使いやすい共培養アッセイを提示する。我々は、ニューロン上のGBM細胞移動を容易に定量化するためのFiJiソフトウェアでマクロを開発し、ニューロンがGBM細胞侵襲能力を変更することを観察した。

パターン化ニューロン上の神経膠芽腫幹細胞の共培養による移動と細胞相互作用の研究

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

神経膠芽腫は、高い侵襲性プロファイルを持つ壊滅的な脳腫瘍です。この共培養システムは、神経膠芽腫細胞の移動を模倣して、患者で観察された侵襲的経路の1つを再現する。共培養モデルの幾何学と組成は、精密に制御されています。それはよりよい再現性および複雑な生物学的プロセスの簡単な定量化を促進する。この方法は、解化したばかりの神経膠芽腫細胞およびニューロンを共培養することによって臨床診断に適応することができる。これは、臨床指標を定義します, 臨床結果として非常に重要です.この方法は、線維芽細胞や免疫細胞などの他の移動細胞を定量化するためにも使用できます。この手順をデモンストレーションするのは、私のチームの博士課程の学生、ジョリス・ギヨンです。マイクロパターニング用の基板を作るために、18ミリメートルの円形ガラスカバーリップを空気またはプラズマ活性化で5分間処理してから、100マイクロリットルのトリエトキシシランを付けたデシケーターにカバースリップを1時間置き、PEG-SVAの溶液を1ミリリットル当たり100ミリグラムで1時間インキュベートします。ゲル沈着の場合、インキュベーションの終わりに、PLPPの3マイクロリットルと50マイクロリットルの絶対エタノールをスライドの中央に加え、完全に乾燥するまで待ちます。ガラススライドのマイクロパターニングの場合、カバースリップをLudinチャンバーに取り付け、自動焦点システムを装備した顕微鏡のステージにチャンバーを配置します。イメージングの後、マイクロパターンイメージをソフトウェアにロードします。自動UV照明シーケンシングの後、ピペットを使用して、PBSで広範囲にカバースリップからPLPPを洗浄します。その後、ラミニン1ミリリットル当たり50マイクログラムでカバースリップを30分間インキュベートし、続いてPBSで別の洗浄を行います。マイクロパターンのカバーリップ上に胚性ラット海馬ニューロン培養をセットアップするには、最後の洗浄後、神経細胞培養培地でガラススライドを再水和する。種子50〜第4ラット海馬ニューロンは、摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターで24時間インキュベートのために各マイクロパターン化カバースリップに平方センチメートルあたり3%馬の血清で濃縮神経基底培地に懸濁した。遠心分離機は、1,000RPMで5分間神経膠芽腫細胞を解約し、グリオブトーマ細胞培地中のペレットを再懸濁し、次いでマイクロパターン化されたニューロン上に10回3番目のGBM細胞に沈着した。細胞の生きた細胞イメージングのために、37°Cのサーモスタットチャンバーを備えた逆顕微鏡のステージに共培養を置き、20X目的を選択します。次に、顕微鏡ソフトウェアの多次元取得ツールボックスを使用して、ニューロンを持つパターンの数に基づいて、16の異なる位置で12時間、ライブブライトフィールドと蛍光GFPトマト画像を2分ごとに取得します。神経ネットワーク解析では、イメージング後、スタックから画像を1つ選択します。ネットワーク ツールを右クリックして、対応するオプション ダイアログ ボックスを開き、設定を調整して、イメージの正確なセグメンテーションを作成します。[OK] をクリックします。ネットワークツールを左クリックして、選択した画像を複製し、画像を赤、灰色、緑のカラーチャンネルに分割します。グレーのチャンネルを選択し、コントラストストレッチの強調を行い、異なる領域間の分離を改善します。Sobel エッジディテクタを使用して、find edge コマンドの下にグループ化された 2D 信号処理畳み込み処理を実行します。二重フィルタリングの場合、ガウスブラーと中央値フィルタを適用してノイズを低減し、オブジェクト信号を滑らかにします。マスクに変換するには、調整されたしきい値アルゴリズムを実行して、黒と白のピクセルを持つバイナリー画像を取得します。次に、セル領域を単純なネットワークにスケルトン化し、フィルター パーティクルを使用して、結果内の小さな非ネットワーク化されたパーティクルを除去します。ネットワーク イメージ内のネットワーク フィルタ パーティクル。赤と緑のチャンネルを取得するには、二重フィルタリングを実行し、適合したしきい値法を使用して示すようにマスクに変換します。分析パーティクルを使用して、バイナリーグリーン画像の細胞形態を決定します。or 演算子を使用して、対象の領域を使用してすべてのチャネルを結合し、初期カラーを単純な RGB イメージに再結合します。単一セルの運動性解析を実行するには、単一セル追跡ツールを右クリックして対応するオプションダイアログボックスを開き、設定を調整して画像の正確なセグメンテーションを作成します。[OK] をクリックし、シングル セル トラッキングを左クリックしてグレーのチャンネルを削除します。時間に応じてイメージスタックに対応する画像を生成するには、Z投影とダブルフィルタを適用し、セルが残した軌跡をマスクするように変換します。図に示すように、バイナリの赤と緑のイメージから小さなパーティクルを削除します。対象領域ツールを使用して、セル トレースの各輪郭線を選択し、オプション ダイアログ ウィンドウで [エッジ検出をスキップ] チェックボックスをオンにします。元のスタック上の赤チャンネルを分離し、対象のリージョンを 1 つ選択します。すべての画像をダブルフィルターし、マスクに変換して、各二項核の重心XY位置を決定できるようにします。XY 位置を使用して、セルの平均平方変位、方向比、平均速度を計算できます。複数のセル追跡解析の場合は、トラッキング ツールを右クリックして対応するオプション ダイアログ ボックスを開き、設定を調整して画像の正確なセグメンテーションを作成します。トラッキングツールを左クリックしてグレーのチャンネルを削除します。赤と緑のチャンネルを分割し、ダブルフィルター、マスクに変換します。次に、画像計算コマンドと演算子を使用して、膜内に位置する核信号のみを残すチャネルをマージし、示されているように、軌道プロット、平均平方変位、方向比、および平均速度を計算します。パターン化されたニューロンと共培養された蛍光GBMは、その形状を素早く変更し、ランダムな動きでニューロンエクステンションに沿った移動を示します。ニューロンに播種されたGBM細胞は、ニューロントラックに従う複数の突起を有する細長い形状を示し、ラミニンで培養すると丸みを帯びた形状を保持する。培養の後期段階では、細胞にリンクする薄い突起がGBMニューロン共培養で観察され得る。ニューロンに播種されたGBM細胞は、これらの軌道プロットで観察されるようにラミニンに播種されたGBM細胞よりも大きな回遊能力を示す。細胞の蛍光合流の分析は、500分の観察期間にわたって、細胞がラミニン単独で培養される場合よりも、スフェロイドがニューロンと共培養されると、より多くの細胞移動が観察されることを示している。確かに分析の終わりまでに、パターンのほぼ半分はGBM細胞で覆われ、ラミニン上で培養されたスフェロイドはカバースリップに未接着のままである。答えたい生物学的な質問に応じて、パターンデザインと細胞密度が生体内条件を表すので注意する必要があります。細胞は共焦点顕微鏡によって固定され、イメージ化することができる。この方法ではイメージング機能が損なわれないので、ライブイメージングも可能です。この技術は、神経膠芽腫細胞とニューロンの代謝交換などの分子相互作用を研究するのに適しています。それは機能生物学的プロセスの探索を可能にする。高スループットの実験は、臨床目的のためにも行うことができます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

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ドットの試金を使用して細胞シートの移行を分析するには

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Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

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住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に

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Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

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Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

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Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

3次元スフェロイド培養からの幹様細胞の分離

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

透過性膜支持体との共培養を用いたマクロファージ活性化に及ぼす腫瘍分泌パラクリンリガンドの効果の研究

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...