Name: co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

이 작품은 Fondation ARC 2020, 리그 콘트르 르 암 (코미트 드 라 지롱드), ARTC, 계획 암 2021, INCA PLBIO에 의해 지원되었다. 알베올은 에이전시 내셔널 드 라 레체쉬 (그랜트 라벡스 브레인 ANR-10-LABX-43)에 의해 지원됩니다. 조리스 가이온은 툴루즈 대학 병원(추 툴루즈)의 펠로우십 수혜자입니다.

통보 된 서면 동의는 모든 환자로부터 얻어졌다 (지역 윤리위원회 규정에 따라, 노르웨이 베르겐, 하우켈랜드 병원에서). 이 프로토콜은 보르도 대학 인간 및 동물 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 임신 한 쥐는 보르도 대학의 동물 시설에서 보관및 치료되었다. E18 시간 임신 쥐의 안락사는 CO2를사용하여 수행되었다. 모든 동물 절차는 제도적 지침에 따라 수행되었으며 지역 윤리위원...

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	<li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma.">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li><li>Scherer, H. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks.">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li><li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma.">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+Printing+by+Light?Induced+Molecular+Adsorption.">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li><li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells.">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li><li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems.">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li><li>Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates.">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).</li><li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+a+dish:+the+promise+of+iPSC-derived+neurons.">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li><li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt/&#946;-catenin+signalling.">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/&#946;-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li></ol>

교모세포종은 주변 혈관의 공동 옵션, 간질 침입 또는 WMTs18에대한 침략 : 다양한 모드를 사용하여 parenchyma를 광범위하게 침공한다. 이 후자의 모드는 WMT 침공과 관련된 생체 외 또는 생체 내 모델에 적합한 것을 찾는 데 어려움이 있기 때문에 문학에서 잘 특징지 지않습니다. 여기서, 배양된 설치류 뉴런이 라미닌 코팅 표면에 패턴화되고 형광 GBM 줄기와 같은 세포가...

GBM을 포함하여 1 차적인 악성 gliomas는, GBM 환자를 위해 보고된 12 15 달의 중간 생존율로, 치명적인 종양입니다. 현재 치료는 방사선 요법과 결합된 큰 종양 질량 절제술 및 화학요법에 의존합니다, 이는 단지 몇 달까지 생존율을 연장합니다. 치료 실패는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통해 가난한 약물 전달과 밀접한 관련이 있으며, 경피 공간, 수막 및 WMTs1을따라 침습적인 성장과 관련이 있다. 혈관 공동 선택이라고도 불리는 혈관 침전은 잘 연구된 과정이며 분자 메커니즘이 해명되기 시작했습니다. 그러나, WM을 따라 GBM 세포 침공의 과정은 잘 이해되지 않습니다. 종양 세포는 Scherer의 이차 구조물2를따라 건강한 뇌로 이동합니다. 실제로, 거의 1세기 전, 한스-요아킴 셰러는 GBM의 침략적인 경로를 설명했는데, 이는 현재 복막 사텔리토시스, 각성 사텔리토증, 피증 확산 및 WMT(그림1A)를따라 침략하는 것으로 불린다.
기질 세포 유래 인자-1α(SDF1α) 및 C-X-C 모티프 케모키네 수용체 4(CXCR4)와 같은 일부 체모키네 및 그 수용체는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 아닌 WMT 침입3에연루된 것으로 보인다. 최근에는 세포간 NOTCH1-SOX2 축이 GBM 세포4의WMT 침입에 중요한 통로로 나타났다. 저자는 GBM 줄기 같이 세포가 GBM 세포에 의하여 myelinated 신경의 파괴를 건의하는 부분적으로 미켈린 신경에 두뇌 parenchyma를 침입하는 방법을 설명했습니다. 이정표는 3개의 기사가 자연 저널에 연속적으로 간행될 때 2019년에 도달했습니다, 신경교종 발달에 있는 전기 활동의 역할을밑줄5,6. Monje와 협력자들의 정액 작업은 신경교종 발달을 촉진하는 neuroligin-3의 분비에서 전기 활동의 중심 역할에 빛을 비추습니다.
윙클러와 협력자는 GBM 세포 사이의 연결을 설명 (마이크로 튜브) 침습적 인 단계에서 중요하고, 최근, 새로 설명 된 신경 교종 시냅스를 통해 GBM 세포와 뉴런 사이의 상호 작용. 이러한 구조는 종양 발달과 침입을 촉진하는 GBM 세포막에 위치한 α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이삭사졸프로피오닉산(AMPA) 수용체의 글루타마테게틱 자극을 선호합니다. 종양 세포 침전은 GBM 환자에서 관찰된 바와 같이 전이 또는 먼 이차 포시의 보급에 있는 중앙 과정입니다. 여러 가지 요인이 혈전폰딘-1, 변형성장인자 베타(TGFβ-조절된 수반성 단백질, 또는 체모키네 수용체 CXCR3)7,8과같은 GBM침공에서중요한 것으로 확인되었다.
여기서, 단순화된 생체 mimetic 모델은 GBM 침공을 연구하기 위해 설명되어 왔으며, 여기서 뉴런은 라미닌의 트랙에 패턴화되고, GBM 세포는 단일 세포 또는 스페로이드(도1B)로시드된다. 두 가지 실험 설정은 GBM9,10,11에서관찰되는 뉴런에 대한 침략을 재구성하는 것을 목표로합니다. 이러한 모델은 과거에 기계적 또는 화학적특성을조절하여 세포 이동을 연구할 수 있는 정렬된 나노섬유 생체 재료(코어 쉘 전기방사)로 개발되었다. 이 문서에서 설명 된 공동 배양 모델은 GBM 세포가이 과정에 관련된 새로운 분자 경로를 정의하여 뉴런에서 탈출하는 방법을 더 잘 이해할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round-bottom plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2582624</td>
			<td>Used to prepare spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C (long-term) or 4 &#176;C (short-term), sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>111580</td>
			<td>Cell culture substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator cartridges</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z363456-6EA</td>
			<td>Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software, MTrack2 macro</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm&#178;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td></td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Promotes neuronal adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>loading of envisioned micropatterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Software&#160;</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscopy automation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope equipped with a motorized stage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PLPPclassic_1ml</td>
			<td>Photoinitiator used to degrade the PEG brush</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>VA-PEG-VA-5000-5g</td>
			<td>Used as an anti-fouling coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PRIMO1</td>
			<td>Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions

교모세포종 (GBM), 학년 IV 악성 교모종, 때문에 그들의 공격적인 특성의 인간 암의 치명적인 유형 중 하나입니다. 이 종양의 유전학에 있는 중요한 어드밴스에 있는 중요한 어드밴스에 도 불구하고, GBM 세포가 건강한 두뇌 parenchyma를 침입하는 방법 잘 이해되지 않습니다. 특히, GBM 세포가 다른 경로를 통해 회고적 공간을 침범하는 것으로 나타났습니다. 이 논문의 주요 관심사는 백색 물질 지역(WMT)을 따라 가는 경로입니다. 회고신경세포 성분을 가진 종양 세포의 상호 작용은 잘 특징지 않다. 본명, GBM 세포 침략에 대한 뉴런의 영향을 평가하는 방법이 기재되어 있다. 이 논문은 뉴런에 GBM 줄기 와 같은 세포의 이동을 분석하여 WMT 침공을 모방 하는 체외 분석에서 고급 공동 배양 제시. 뉴런이 있는 GBM 셀의 동작은 오픈 소스 및 자유 액세스 소프트웨어와 함께 자동화된 추적 절차를 사용하여 모니터링됩니다. 이 방법은 많은 응용 프로그램에 유용하다, 특히, 기능 및 기계학 연구뿐만 아니라 뉴런에 GBM 세포 이동을 차단 할 수있는 약리학 에이전트의 효과를 분석하기위한.

형광 GBM 세포와 공동 배양패턴 뉴런은 프로토콜 섹션에 설명된 대로 제조되었고, 추적 실험이 수행되었다. GBM 세포는 뉴런에서 마이그레이션하는 동안 신속하게 모양을 수정(그림 1B: 패널 6 및 비디오 1). 세포는 무작위 운동(비디오 1)에서신경 확장을 따라 마이그레이션되었습니다. 형광GBM 세포 및 비형성 뉴런은 쉽게 구별될 수 있으며,...

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Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

여기서는 패턴 뉴런에서 교모세포종(GBM) 마이그레이션을 분석하기 위해 사용하기 쉬운 공동 배양 분석을 제시합니다. 우리는 뉴런에 GBM 세포 마이그레이션의 쉬운 정량화를 위한 FiJi 소프트웨어에 있는 매크로를 개발하고, 뉴런이 GBM 세포 침습 용량을 수정한다는 것을 관찰했습니다.

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

교모세포종은 높은 침습적 인 프로필을 가진 파괴적인 뇌종양입니다. 이 공동 배양 시스템은 환자에서 관찰된 침략적인 경로 의 한을 recapituure하는 신경에 교모 세포 이주를 모방합니다. 공동 배양 모델의 형상과 구성은 정확하게 제어됩니다.그것은 더 나은 재현성을 용이하게하고 또한 복잡한 생물학적 과정의 간단한 정량화. 이 방법은 새로 해리된 교모세포종 세포 및 뉴런을 공동 배양하여 임상 진단에 적응할 수 있다. 그것은 임상 결과로 매우 중요한 임상 지수를 정의합니다.우리의 방법은 또한 섬유아세포 또는 면역 세포와 같은 그밖 이주세포를 정량화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 팀의 박사 과정 학생인 조리스 가이온(Joris Guyon)이 될 것입니다. 마이크로패터닝용 기판을 만들기 위해 공기 또는 플라즈마 활성화로 18mm 원형 유리 커버립을 5분 동안 처리한 후 1시간 동안 트리에톡시실레인 100마이크로리터의 디시케이터에 커버립을 넣은 다음, 1시간 동안 페그-SVA 용액을 1밀리리터당 100밀리그램으로 배양합니다.겔 증착의 경우, 인큐베이션의 끝에 PLPP 3마이크로리터와 절대 에탄올 50 마이크로리터를 슬라이드 중앙에 넣고 완전히 건조될 때까지 기다립니다. 유리 슬라이드 마이크로패터닝의 경우, 루딘 챔버에 커버슬립을 장착하고 자동 초점 시스템이 장착된 현미경의 단계에 챔버를 놓습니다. 이미징 후 마이크로패턴 이미지를 소프트웨어에 로드합니다.자동 UV 조명 시퀀싱 후 파이펫을 사용하여 PBS로 커버슬립에서 PLPP를 광범위하게 세척합니다. 그런 다음 커버슬립을 라미닌 밀리리터당 50마이크로그램으로 30분 간 배양한 다음 PBS로 또 다른 세척을 시연합니다. 마이크로패턴 커버립에 배아 쥐 해마 뉴런 배양을 설정하려면, 마지막 세척 후, 신경 세포 배양 배지로 유리 슬라이드를 재수화한다.씨앗 5 회 10 신경 물질 배지에 매달린 네 번째 쥐 해마 뉴런은 37섭에서 5 %의 이산화탄소 인큐베이터에서 24 시간 배양에 각 마이크로 패턴 커버 슬립에 평방 센티미터 당 3 %의 말 세럼으로 농축. 원심분리기는 교모세포종 세포를 1, 000 RPM에서 5분 동안 해리시키고 교모세포종 세포 배양 배지에서 펠릿을 재중단한 다음, 마이크로패턴 뉴런을 통해 10번10을 제3GBM 세포에 증착한다. 세포의 살아있는 세포 화상 진찰을 위해, 37섭씨 온도 조절챔버를 갖춘 반전된 현미경의 단계에 공동 배양을 놓고 20X 목표를 선택하십시오.그런 다음 현미경 소프트웨어의 다차원 획득 툴박스를 사용하여 뉴런패턴 수에 따라 16개의 다른 위치에서 12시간 동안 2분마다 라이브 브라이트필드 및 피불화 GFP 토마토 이미지를 획득합니다. 신경 네트워크 분석을 위해 이미징 후 스택에서 하나의 이미지를 선택합니다. 네트워크 도구를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정을 조정하여 이미지의 정확한 세분화를 생성합니다.확인을 클릭합니다. 네트워크 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 선택한 이미지를 복제하고 이미지를 빨간색, 회색 및 녹색 채널로 분할합니다. 회색 채널을 선택하고 대비 스트레치 향상을 수행하여 서로 다른 영역 간의 분리를 개선합니다. Sobel 가장자리 검출기를 사용하여 찾기 가장자리 명령에서 그룹화된 대로 2D 신호 처리 컨볼루션을 수행합니다.이중 필터링의 경우 가우시안 블러와 중앙값 필터를 적용하여 노이즈를 줄이고 물체 신호를 부드럽게 합니다. 마스크로 변환하려면 적응된 임계값 알고리즘을 실행하여 흑백 픽셀이 있는 이진 그림을 가져옵니다. 다음으로 셀 영역을 간단한 네트워크로 골격화하고 필터 입자를 사용하여 결과에서 작은 비네트워크 입자를 제거합니다.네트워크 이미지의 네트워크 필터 파티클입니다. 빨간색 및 녹색 채널을 얻으려면 조정된 임계값 을 사용하여 입증된 대로 이중 필터링을 수행하고 마스크로 변환합니다. 분석 입자를 사용하여 이진 녹색 이미지의 세포 형태를 결정합니다.또는 연산자를 사용하여 관심 영역을 사용하여 모든 채널을 병합하고 초기 색상을 간단한 RGB 이미지로 재조정합니다. 단일 셀 운동성 분석을 수행하려면 단일 셀 추적 도구를 마우스오른쪽 단추로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정을 조정하여 이미지의 정확한 세분화를 생성합니다. 한 셀 추적을 확인하고 왼쪽 단추로 클릭하여 회색 채널을 제거합니다.시간에 따라 이미지 스택에 해당하는 이미지를 생성하려면 Z 프로젝션 및 이중 필터를 적용하고 셀에 의해 남겨진 흔적을 마스크하도록 변환합니다. 설명한 대로 이진 빨간색 및 녹색 이미지에서 작은 입자를 제거합니다. 관심 영역 도구를 사용하여 셀 추적의 각 윤곽을 선택하고 옵션 대화 상자 창에서 건너뛰기 가장자리 감지 상자를 확인합니다.원래 스택의 빨간색 채널을 분리하고 관심 영역 을 선택합니다. 모든 이미지를 이중 필터링하고 마스크로 변환하여 각 바이나드 핵의 중심 XY 위치가 결정되도록 합니다. XY 위치는 셀의 평균 제곱 변위, 방향성 비율 및 평균 속도를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.여러 셀 추적 분석을 보려면 추적 도구를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정을 조정하여 이미지의 정확한 세분화를 생성합니다. 추적 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 회색 채널을 제거합니다. 빨간색 과 녹색 채널을 분할, 이중 필터, 마스크로 변환합니다.그런 다음 영상 계산기 명령을 및 연산자와 사용하여 멤브레인 내에 위치한 핵 신호만 남기는 채널을 병합하고 궤적 플롯, 평균 제곱 변위, 방향성 비율 및 입증된 바와 같이 세포의 평균 속도를 계산한다. 패턴 뉴런과 공동 배양형형 형광GBM은 빠르게 모양을 수정하고 임의의 움직임으로 뉴런 확장을 따라 이주를 보여줍니다. 뉴런에 시드된 GBM 세포는 세포가 라미닌에서 배양될 때 둥근 모양을 유지하면서 뉴런 트랙을 따르는 여러 돌출부로 길쭉한 모양을 표시합니다.문화의 후반 단계에서, 세포에 연결 하는 얇은 돌출 GBM 신경 공동 배양에서 관찰 될 수 있습니다. 뉴런에 시드된 GBM 세포는 이러한 궤적 플롯에서 관찰된 바와 같이 라미닌에 시드된 GBM 세포보다 더 큰 철새 용량을 보여 준다. 세포의 형광 성 합류의 분석은 500 분 관측 기간 동안, 세포가 혼자 라미닌에 배양 될 때보다 구체와 공동 배양 될 때 더 많은 세포 이동이 관찰된다는 것을 보여줍니다.실제로 분석이 끝날 때까지 패턴의 거의 절반이 GBM 세포로 덮여 있으며 라미닌에서 배양된 스페로이드는 커버슬립에 부착되지 않은 상태로 유지됩니다. 당신이 대답하고자하는 생물학적 질문에 따라, 하나는 패턴 디자인과 또한 세포 밀도가 생체 내 조건을 대표한다는 것을주의해야한다. 세포는 공초점 현미경 검사법에 의해 고정되고 심을 수 있습니다.우리의 방법이 이미징 기능을 손상시키지 않기 때문에 라이브 이미징도 가능합니다. 이 기술은 교모세포종 세포와 뉴런 사이 신진 대사 교류와 같은 분자 상호 작용을 공부하기에 적합합니다. 그것은 기능 생물학적 과정의 탐구를 허용합니다.고처리량 실험은 임상 적 목적을 위해서도 수행 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

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