Name: co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole støttes av Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon er mottaker av stipendiatstilling fra Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).

Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter (fra Haukeland sykehus, Bergen, Norge, i henhold til lokale etiske komiteforskrifter). Denne protokollen følger retningslinjene fra Bordeaux Universitys forskningsetiske komiteer for mennesker og dyr. Gravide rotter ble plassert og behandlet i dyreavdelingen til Bordeaux University. Eutanasi av en E18-tidsinnstilt gravid rotte ble utført ved hjelp av CO2. Alle dyreprosedyrer er gjort i henhold til institusjonelle retningslinjer og godkjent av den ...

<ol>
	<li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma.">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li><li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance.">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li><li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1&#945;/CXCR4+expression+in+glioblastomas.">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1&#945;/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li><li>Boy&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CXCR3/LRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors.">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571 (2017).</li><li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development.">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146 (2019).</li><li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks.">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li><li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma.">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+Printing+by+Light?Induced+Molecular+Adsorption.">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li><li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells.">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li><li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems.">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li><li>Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates.">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).</li><li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+a+dish:+the+promise+of+iPSC-derived+neurons.">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li><li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt/&#946;-catenin+signalling.">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/&#946;-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li></ol>

Glioblastomer invaderer parenchymaen mye ved å bruke forskjellige moduser: samalternativ for omkringliggende blodkar, interstitiell invasjon eller invasjon på WMTs18. Denne sistnevnte modusen er ikke godt karakterisert i litteraturen på grunn av vanskeligheten med å finne egnede in vitro- eller in vivo-modeller relatert til WMT-invasjon. Her er det foreslått en forenklet modell der dyrkede gnagernevroner ble mønstret på lamininbelagte overflater, og fluorescerende GBM stam...

Primære ondartede gliomer, inkludert GBMs, er ødeleggende svulster, med en middels overlevelsesrate på 12 til 15 måneder rapportert for GBM-pasienter. Nåværende terapi er avhengig av stor tumormasse reseksjon og kjemoterapi kombinert med strålebehandling, som bare forlenger overlevelsesraten med få måneder. Terapeutiske feil er nært knyttet til dårlig legemiddellevering på tvers av blod-hjernebarrieren (BBB) og til invasiv vekst i perivascular rom, meninger, og langs WMTs1. Perivascular invasjon, også kalt vaskulært samalternativ, er en godt studert prosess, og de molekylære mekanismene begynner å bli belyst; Prosessen med GBM-celleinvasjon langs WMTs er imidlertid ikke godt forstått. Tumorceller migrerer inn i den sunne hjernen langs Scherers sekundære strukturer2. Faktisk, for nesten et århundre siden, beskrev Hans-Joachim Scherer de invaderende rutene til GBM, som nå kalles perineuronal satellitose, perivascular satellitosis, subpial spredning og invasjon langs WMT (Figur 1A).
Noen kjemokiner og deres reseptorer, som stromal celle-avledet faktor-1α (SDF1α) og C-X-C motiv kjemokinreseptor 4 (CXCR4), men ikke vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF), synes å være involvert i WMT invasjon3. Mer nylig har en transcellulær NOTCH1-SOX2-akse vist seg å være en viktig vei i WMT-invasjon av GBM-celler4. Forfatterne beskrev hvordan GBM stamceller invaderer hjerneparenchyma på delvis umyelinerte nevroner, noe som tyder på ødeleggelse av myelinhylser av GBM-celler. En milepæl ble nådd i 2019 da tre artikler ble publisert i Nature journal, noe som understreker rollen som elektrisk aktivitet i gliomautvikling5,6. Seminalarbeid av Monje og samarbeidspartnere belyser den sentrale rollen elektrisk aktivitet har i sekresjonen av nevroligin-3, noe som fremmer gliomautvikling.
Winkler og samarbeidspartnere beskrev forbindelser mellom GBM-celler (mikrorør) som avgjørende i invaderende trinn, og i det siste, interaksjoner mellom GBM-celler og nevroner via nylig beskrevne nevrogliomasynapser. Disse strukturene favoriserer glutamatergisk stimulering av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) reseptorer plassert ved GBM cellemembranen, som fremmer tumorutvikling og invasjon. Tumorcelleinvasjon er en sentral prosess i formidling av metastaser eller fjern sekundærfokus, som observert hos GBM-pasienter. Flere faktorer har blitt identifisert å være viktige i GBM invasjon som trombospondin-1, en transformerende vekstfaktor beta (TGFβ-regulert matrikellulært protein, eller kjemokinreseptoren CXCR3)7,8.
Her er en forenklet biomimetisk modell beskrevet for å studere GBM-invasjon, der nevroner er mønstret på spor av laminin, og GBM-celler blir sådd på den, som enkeltceller eller som sfæroider (Figur 1B). De to eksperimentelle innstillingene er rettet mot å recapitulating invasjon på nevroner, som observeres i GBM9,10,11. Slike modeller har tidligere blitt utviklet som justerte nanofiberbiomaterialer (kjerneskallelektrospinning) som gjør det mulig å studere cellemigrasjon ved å modulere mekaniske eller kjemiske egenskaper12. Medkulturmodellen beskrevet i denne artikkelen gir en bedre forståelse av hvordan GBM-celler unnslipper på nevroner ved å definere nye molekylære veier involvert i denne prosessen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round-bottom plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2582624</td>
			<td>Used to prepare spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C (long-term) or 4 &#176;C (short-term), sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>111580</td>
			<td>Cell culture substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator cartridges</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z363456-6EA</td>
			<td>Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software, MTrack2 macro</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm&#178;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td></td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Promotes neuronal adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>loading of envisioned micropatterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Software&#160;</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscopy automation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope equipped with a motorized stage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PLPPclassic_1ml</td>
			<td>Photoinitiator used to degrade the PEG brush</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>VA-PEG-VA-5000-5g</td>
			<td>Used as an anti-fouling coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PRIMO1</td>
			<td>Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions

Glioblastomer (GBMs), grad IV ondartede gliomer, er en av de dødeligste typer menneskelig kreft på grunn av deres aggressive egenskaper. Til tross for betydelige fremskritt i genetikken til disse svulstene, er det ikke godt forstått hvordan GBM-celler invaderer det sunne hjerneparenchymaet. Spesielt har det vist seg at GBM-celler invaderer det peritumorale rommet via forskjellige ruter; Hovedinteressen til dette papiret er ruten langs hvite materiekanaler (WMTs). Samspillet mellom tumorceller med de peritumorale nervecellekomponentene er ikke godt karakterisert. Heri har det blitt beskrevet en metode som evaluerer virkningen av nevroner på GBM celleinvasjon. Denne artikkelen presenterer en avansert co-kultur in vitro analyse som etterligner WMT invasjon ved å analysere migrasjon av GBM stamceller på nevroner. Oppførselen til GBM-celler i nærvær av nevroner overvåkes ved hjelp av en automatisert sporingsprosedyre med programvare med åpen kildekode og fri tilgang. Denne metoden er nyttig for mange applikasjoner, spesielt for funksjonelle og mekanistiske studier, samt for å analysere effekten av farmakologiske midler som kan blokkere GBM cellemigrasjon på nevroner.

Mønstrede nevroner som var dyrket sammen med fluorescerende GBM-celler ble utarbeidet som beskrevet i protokolldelen, og sporingseksperimenter ble utført. GBM-celler endret raskt formen mens de migrerte på nevronene (Figur 1B: panel 6 og Video 1). Celler migrerte langs nevronale utvidelser, i en tilfeldig bevegelse (Video 1). Fluorescerende GBM-celler og ikke-fluorescerende nevroner kan lett skille seg ut, og dette tillot sporing av celle...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Her presenterer vi en brukervennlig samkulturanalyse for å analysere glioblastom (GBM) migrasjon på mønstrede nevroner. Vi utviklet en makro i FiJi-programvare for enkel kvantifisering av GBM cellemigrering på nevroner, og observerte at nevroner endrer GBM-celleinvasiv kapasitet.

Samkultur av Glioblastoma stamceller på mønstrede nevroner for å studere migrasjon og cellulære interaksjoner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Glioblastomer er ødeleggende hjernesvulster med høy invasiv profil. Dette samkultursystemet etterligner glioblastomcellers migrasjon på nevroner for å rekapitulere en av de invasive rutene som observeres hos pasienter. Geometrien og sammensetningen av vår samkulturmodell er nøyaktig kontrollert.Det letter en bedre reproduserbarhet og også en enkel kvantifisering av komplekse biologiske prosesser. Denne metoden kan tilpasses klinisk diagnose ved å kokulturere nyoppløselige glioblastomceller og nevroner. Den definerer en klinisk indeks, som er svært viktig som klinisk utfall.Vår metode kan også brukes til å kvantifisere andre migrerende celler, for eksempel fibroblaster eller immunceller. Å demonstrere prosedyren vil være Joris Guyon, en ph.d.-student fra teamet mitt. For å lage et substrat for mikropatterning, behandle 18 millimeter sirkulære glassdeksler ved luft- eller plasmaaktivering i fem minutter før du plasserer dekslene i en desiccator med 100 mikroliter trietoksysilane i en time, og inkuber deretter en løsning av PEG-SVA ved 100 milligram per milliliter i en time.For gelavsetning, på slutten av inkubasjonen, legg til tre mikroliter PLPP og 50 mikroliter absolutt etanol på midten av lysbildet og vent til det tørker helt. For mikropattering av glasssklie monterer du dekslene i et Ludin-kammer og plasserer kammeret på scenen til et mikroskop utstyrt med et autofokussystem. Etter avbildning, last mikropatternbildene inn i programvaren.Etter automatisk UV-belysningssekvensering, bruk en pipette for å vaske PLPP fra dekslene i stor grad med PBS. Inkuber deretter dekslene med 50 mikrogram per milliliter laminin i 30 minutter, etterfulgt av en annen vask med PBS som demonstrert. For å sette opp en embryonal rotte hippocampal nevronkultur på mikropatterndekslene, etter siste vask, rehydrer glasset glir med nevronal cellekulturmedium.Frø fem ganger 10 til den fjerde rotte hippocampal nevroner suspendert i Neurobasal medium beriket med 3% hest serum per kvadratcentimeter på hver mikropatterned coverlip for en 24-timers inkubasjon i en 5% karbondioksid inkubator ved 37 grader Celsius. Sentrifuge dissosierte glioblastomceller i fem minutter ved 1000 RPM og resuspend pellet i glioblastom cellekultur medium, deretter deponere en ganger 10 til tredje GBM celler over mikropatterned nevroner. For levende celleavbildning av cellene, plasser medkulturen på scenen til et invertert mikroskop utstyrt med et 37 grader Celsius termostatkammer og velg 20X-målet.Bruk deretter den flerdimensjonale oppkjøpsverktøykassen i mikroskopprogramvaren for å skaffe live Brightfield og epifluorescence GFP tomatbilder hvert annet minutt i 12 timer i 16 forskjellige stillinger basert på antall mønstre med nevroner. For nevronnettverksanalyse, etter avbildning, velg ett bilde fra stakken. Høyreklikk på nettverksverktøyet for å åpne den tilsvarende alternativdialogboksen og justere innstillingene for å få en presis segmentering av bildene.Klikk OK. Venstreklikk på nettverksverktøyet for å duplisere det valgte bildet og dele bildet inn i de røde, grå og grønne fargekanalene. Velg den grå kanalen og utfør kontraststrekkforbedring for å forbedre separasjonen mellom de forskjellige områdene. Bruk Sobel kantdetektor til å utføre 2D-signalbehandlingskonvolusjonen som gruppert under finn kant-kommandoen.For dobbel filtrering, bruk gaussisk uskarphet og et medianfilter for å redusere støyen og for å jevne ut objektsignalet. Hvis du vil konvertere til maske, utfører du tilpassede terskelalgoritmer for å få et binært bilde med svart-hvitt-bildepunkter. Deretter skjeletter celleområdet inn i et enkelt nettverk og bruk filterpartikler for å fjerne små ikke-nettverkspartikler i resultatene.Nettverksfilterpartikler i en nettverksavbildning. For å få røde og grønne kanaler, utfør dobbel filtrering og konverter til maske som demonstrert ved hjelp av den tilpassede terningsmetoden. Bruk analysepartikler til å bestemme cellemorfologien i det binære grønne bildet.Bruk operatoren eller til å slå sammen alle kanalene ved hjelp av områdene av interesse, og juster den opprinnelige fargen til et enkelt RGB-bilde. Hvis du vil utføre en enkeltcellet bevegelighetsanalyse, høyreklikker du verktøyet for sporing av enkeltceller for å åpne dialogboksen for tilsvarende alternativer og justere innstillingene for å få en nøyaktig segmentering av bilder. Klikk OK og venstreklikk på sporing med én celle for å fjerne den grå kanalen.Hvis du vil generere et bilde som tilsvarer en bildestakk i henhold til klokkeslettet, bruker du Z-projeksjon og dobbeltfilter og konverterer for å maskere stiene som cellene etterlater seg. Fjern de små partiklene fra det binære røde og grønne bildet som vist. Bruk interesseområdet til å velge hver kontur av cellesporingen og merke av for hopp over kantgjenkjenning i dialogboksen for alternativer.Isoler den røde kanalen i den opprinnelige stakken, og velg ett interesseområde. Dobbeltfiltrer alle bildene og konverter til maske for å la centroid XY-posisjonen til hver binariserte kjerne bestemmes. XY-posisjonene kan brukes til å beregne gjennomsnittlig kvadratisk forskyvning, retningsforhold og gjennomsnittlig hastighet for cellen.For analyse av sporing av flere celler høyreklikker du sporingsverktøyet for å åpne dialogboksen for tilsvarende alternativer og justere innstillingene for å få en nøyaktig segmentering av bilder. Venstreklikk på sporingsverktøyet for å fjerne den grå kanalen. Del de røde og grønne kanalene, dobbeltfilteret og konverter til maske.Bruk deretter bildekalkulatorkommandoen med operatoren og til å slå sammen kanalene, slik at bare kjernesignalet ligger i membranene og beregner baneplottet, gjennomsnittlig firkantet forskyvning, retningsforhold og gjennomsnittlig hastighet for cellene som vist. Fluorescerende GBM-kokulturert med mønstrede nevroner endrer raskt formen og viser migrasjon langs nevronale utvidelser i en tilfeldig bevegelse. GBM-celler frøet på nevroner viser en langstrakt form med flere fremspring som følger nevronsporene mens cellene beholder sin avrundede form når de dyrkes på laminin.På senere stadier av kulturen kan tynne fremspring som knytter seg til celler observeres i GBM nevronale samkulturer. GBM-celler frøet på nevroner viser større trekkkapasitet enn GBM-celler frøet på laminin som observert i disse baneplottene. Analyse av cellenes fluorescerende samløp viser at over en 500-minutters observasjonsperiode observeres mer cellemigrasjon når sfæroidene er samkulturert med nevroner enn når cellene dyrkes på laminin alene.Faktisk ved slutten av analysen er nesten halvparten av mønsteret dekket med GBM-celler, mens sfæroidene som dyrkes på laminin forblir uadhered til dekslene. Avhengig av de biologiske spørsmålene du vil svare på, bør man passe på at mønsterdesignet og også celletettheten er representativ for in vivo-forholdene. Cellene kan festes og avbildes ved konfektmikroskopi.Levende avbildning er også mulig siden metoden vår ikke svekker bildebehandlingsfunksjonene. Denne teknikken er velegnet til å studere molekylær interaksjon, for eksempel metabolske utvekslinger mellom glioblastomceller og nevroner. Det tillater utforskning av funksjon biologiske prosesser.Eksperimenter med høy gjennomstrømning kan også gjøres for kliniske formål.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser å studere macrophage og Microglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow cytometri-baserte narkotika Screening System for identifisering av små molekyler som fremmer differensiering av glioblastom stilk celler

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Bruke Dot analysen å analysere migrering av cellen ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellular og cellulær lunge modell å studere svulst metastasering

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal stamceller isolert fra cellulose vev og co kultur kreftceller å studere deres samhandling

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Bruke Microarrays å avhøre Microenvironmental Impact on Cellular fenotyper i Cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering av Stem-lignende celler fra 3-dimensjonale spheroid kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Studere effekter av tumor-utskilt paracrine ligander på macrophage aktivisering bruker co-kultur med gjennomtrengelig membran støtter

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...