Name: co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole stöds av Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon är stipendiat från Toulouse Universitetssjukhus (CHU Toulouse).

Informerat skriftligt samtycke erhölls från alla patienter (från Haukeland Hospital, Bergen, Norge, enligt lokala etikkommittébestämmelser). Detta protokoll följer riktlinjerna från Bordeaux University human- och animaliska forskningsetiska kommittéer. Gravida råttor inhysdes och behandlades i djuranläggningen vid Bordeaux University. Dödshjälp av en E18-tidsförd gång gravid råtta utfördes med hjälp av CO2. Alla djurförsök har gjorts i enlighet med de institutionella riktlinjerna och godkän...

<ol>
	<li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma.">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li><li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance.">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li><li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1&#945;/CXCR4+expression+in+glioblastomas.">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1&#945;/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li><li>Boy&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CXCR3/LRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors.">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571 (2017).</li><li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development.">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146 (2019).</li><li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks.">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li><li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma.">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+Printing+by+Light?Induced+Molecular+Adsorption.">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li><li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells.">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li><li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems.">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li><li>Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates.">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).</li><li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+a+dish:+the+promise+of+iPSC-derived+neurons.">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li><li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt/&#946;-catenin+signalling.">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/&#946;-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li></ol>

Glioblastomas invaderar parenkymen i stor utsträckning genom att använda olika lägen: co-option av omgivande blodkärl, interstitiell invasion eller invasion på WMTs18. Detta senare läge är inte väl karakteriserat i litteraturen på grund av svårigheten att hitta lämpliga in vitro- eller in vivo-modeller relaterade till WMT-invasion. Här har en förenklad modell föreslagits där odlade gnagare neuroner var mönstrade på lamininbelagda ytor, och fluorescerande GBM stam...

Primära maligna gliomas, inklusive GBMs, är förödande tumörer, med en medelstor överlevnadsgrad på 12 till 15 månader rapporteras för GBM patienter. Nuvarande terapi förlitar sig på stora tumör massa samband och kemoterapi i kombination med strålbehandling, som bara förlänger överlevnaden med några månader. Terapeutiska misslyckanden är intimt relaterade till dålig läkemedelstillförsel över blod - hjärnbarriären (BBB) och till invasiv tillväxt i perivaskulära utrymmen, hjärnhinnor och längs WMTs1. Perivaskulär invasion, även kallad Vaskulär co-option, är en välstuderad process, och de molekylära mekanismerna börjar belysas; Processen med GBM-cellinvasion längs WMTs är dock inte väl förstådd. Tumörceller migrerar in i den friska hjärnan längs Scherers sekundära strukturer2. För nästan ett sekel sedan beskrev Hans-Joachim Scherer de invasiva vägarna för GBM, som nu kallas perineuronal satellitosis, perivaskulär satellitosis, subpial spread och invasion längs WMT (Figur 1A).
Vissa chemokiner och deras receptorer, såsom stromal cell-härledda faktor-1α (SDF1α) och C-X-C motiv chemokine receptor 4 (CXCR4), men inte Vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF), verkar vara inblandad i WMT invasion3. På senare tid har en transcellulär NOTCH1-SOX2-axel visat sig vara en viktig väg i WMT invasion av GBM celler4. Författarna beskrev hur GBM stamliknande celler invaderar hjärnan parenkym på delvis unmyelinated nervceller, vilket tyder på förstörelsen av myelin mantlar av GBM celler. En milstolpe nåddes 2019 när tre artiklar publicerades i tidskriften Nature, vilket understryker den elektriska aktivitetens roll i gliomutveckling5,6. Monjes och dess medarbetares viktiga arbete belyser den elektriska aktivitetens centrala roll i utsöndring av neuroligin-3, vilket främjar gliomutveckling.
Winkler och samarbetspartners beskrev samband mellan GBM-celler (mikrorör) som avgörande i invasiva steg, och på senare tid interaktioner mellan GBM-celler och nervceller via nyligen beskrivna neuroglioma synapser. Dessa strukturer gynnar glutamatergic stimulering av α-amino-3-hydroxy-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) receptorer ligger vid GBM cellmembran, som främjar tumör utveckling och invasion. Tumör cell invasion är en central process i spridningen av metastaser eller avlägsna sekundära högborgar, som observerats hos GBM patienter. Flera faktorer har identifierats som viktiga i GBM invasion såsom trombospondin-1, en transformerande tillväxtfaktor beta (TGFβ-reglerat matricellular protein, eller chemokin receptorn CXCR3)7,8.
Här har en förenklad biomimetisk modell beskrivits för att studera GBM-invasion, där nervceller mönstras på spår av laminin, och GBM-celler sås på den, som encelliga celler eller som sfäroider (Figur 1B). De två experimentella inställningarna syftar till att rekapitituera invasion på nervceller, vilket observeras i GBM9,10,11. Sådana modeller har tidigare utvecklats som justerade nanofiberbiomaterial (kärnskalselektrospinning) som gör det möjligt att studera cellmigration genom att modulera mekaniska eller kemiska egenskaper12. Den samkulturmodell som beskrivs i den här artikeln möjliggör en bättre förståelse för hur GBM-celler flyr på nervceller genom att definiera nya molekylära vägar som är involverade i denna process.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round-bottom plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2582624</td>
			<td>Used to prepare spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C (long-term) or 4 &#176;C (short-term), sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>111580</td>
			<td>Cell culture substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator cartridges</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z363456-6EA</td>
			<td>Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software, MTrack2 macro</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm&#178;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td></td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Promotes neuronal adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>loading of envisioned micropatterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Software&#160;</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscopy automation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope equipped with a motorized stage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PLPPclassic_1ml</td>
			<td>Photoinitiator used to degrade the PEG brush</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>VA-PEG-VA-5000-5g</td>
			<td>Used as an anti-fouling coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PRIMO1</td>
			<td>Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions

Glioblastomas (GBMs), klass IV maligna gliomas, är en av de dödligaste typerna av mänsklig cancer på grund av deras aggressiva egenskaper. Trots betydande framsteg i genetiken hos dessa tumörer, hur GBM celler invaderar den friska hjärnan parenkym är inte väl förstådd. Det har visat sig att GBM-celler invaderar det peritumorala utrymmet via olika vägar; Huvudintresset för detta papper är rutten längs vit materiaområden (WMP). Interaktionerna mellan tumörceller och peritumorala nervcellskomponenter är inte väl karakteriserade. Häri har en metod beskrivits som utvärderar neurons inverkan på GBM cell invasion. Detta dokument presenterar en avancerad co-culture in vitro-analys som efterliknar WMT invasion genom att analysera migreringen av GBM stamliknande celler på nervceller. Beteendet hos GBM-celler i närvaro av nervceller övervakas med hjälp av en automatiserad spårningsprocedur med programvara med öppen källkod och fri åtkomst. Denna metod är användbar för många tillämpningar, särskilt för funktionella och mekanistiska studier samt för att analysera effekterna av farmakologiska medel som kan blockera GBM-cellmigration på nervceller.

Mönstrade nervceller co-cultured med fluorescerande GBM celler utarbetades som beskrivs i protokoll avsnittet och spårning experiment utfördes. GBM-celler ändrade snabbt sin form medan de migrerade på nervcellerna (Bild 1B: panel 6 och Video 1). Celler migrerade längs neuronala förlängningar, i en slumpmässig rörelse (Video 1). Fluorescerande GBM-celler och icke-fluorescerande nervceller kan lätt urskiljas, och detta gjorde det m?...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Här presenterar vi en lättanvänd co-culture analys för att analysera glioblastom (GBM) migration på mönstrade nervceller. Vi utvecklade ett makro i FiJi programvara för enkel kvantifiering av GBM cell migrering på nervceller, och observerade att nervceller ändra GBM cell invasiv kapacitet.

Samkultur av Glioblastoma stamliknande celler på mönstrade nervceller för att studera migration och cellulära interaktioner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Glioblastom är förödande hjärntumörer med hög invasiv profil. Detta samkultursystem efterliknar glioblastom celler migration på nervceller att rekapitulera en av de invasiva vägar som observerats hos patienter. Geometrin och sammansättningen av vår samkulturmodell är exakt kontrollerad.Det underlättar en bättre reproducerbarhet och även en enkel kvantifiering av komplexa biologiska processer. Denna metod kan anpassas till klinisk diagnos genom att samkultur nyligen dissocierade glioblastom celler och nervceller. Det definierar ett kliniskt index, vilket är mycket viktigt som kliniskt resultat.Vår metod kan också användas för att kvantifiera andra migrerande celler, såsom fibroblaster eller immunceller. Joris Guyon, doktorand från mitt team, visar att proceduren kommer att ske. För att göra ett substrat för mikropapper, behandla 18 millimeter cirkulära glaslock med luft- eller plasmaaktivering i fem minuter innan du placerar täckglasen i en desiccator med 100 mikroliter trietoxisilan i en timme och inkubera sedan en lösning av PEG-SVA vid 100 milligram per milliliter i en timme.För geldeposition, i slutet av inkubationen, tillsätt tre mikroliter PLPP och 50 mikroliter absolut etanol i mitten av bilden och vänta tills den torkar helt. För mikropapper av glasrutschbanor, montera täckglaset i en Ludinkammare och placera kammaren på scenen i ett mikroskop utrustat med ett autofokussystem. Efter avbildning, ladda mikromönsterbilderna i programvaran.Efter automatisk UV-belysningssekvensering, använd en pipett för att tvätta PLPP från täcket i stor utsträckning med PBS. Inkubera sedan täckglaset med 50 mikrogram per milliliter laminin i 30 minuter, följt av en annan tvätt med PBS som visas. För att sätta upp en embryonal råtta hippocampal neuron kultur på micropattern coverslips, efter den sista tvätten, rehydrera glaset glider med neuronal cell kultur medium.Frö fem gånger 10 till den fjärde råtta hippocampal nervceller suspenderade i Neurobasal medium berikas med 3%häst serum per kvadratcentimeter på varje mikropatterned coverslip för en 24-timmars inkubation i en 5%koldioxid inkubator vid 37 grader Celsius. Centrifuge dissocierade glioblastom celler i fem minuter vid 1, 000 RPM och återanvänd pelleten i glioblastoma cell kultur medium, sedan deponera en gånger 10 till tredje GBM celler över de mikropatterned nervcellerna. För levande cellavbildning av cellerna, placera samkulturen på scenen i ett inverterat mikroskop utrustat med en 37 grader Celsius termostatkammare och välj 20X-målet.Använd sedan den flerdimensionella förvärvsverktyglådan i mikroskopprogramvaran för att förvärva levande Brightfield- och epifluorescens GFP-tomatbilder varannan minut i 12 timmar i 16 olika positioner baserat på antalet mönster med nervceller. För neuronal nätverksanalys, efter avbildning, välj en bild från stacken. Högerklicka på nätverksverktyget för att öppna motsvarande alternativ och justera inställningarna för att skapa en exakt segmentering av bilderna.Klicka på OK. Vänsterklicka på nätverksverktyget för att duplicera den markerade bilden och dela upp bilden i de röda, grå och gröna färgkanalerna. Välj den grå kanalen och utför kontraststräckförstärkning för att förbättra separationen mellan de olika områdena. Använd Sobel-kantdetektorn för att utföra 2D-signalbehandlingsinveckningen som grupperad under kommandot find edge.För dubbel filtrering, applicera gaussisk oskärpa och ett medianfilter för att minska bruset och jämna ut objektsignalen. Om du vill konvertera till mask kör du anpassade tröskelvärden för att få en binär bild med svartvita pixlar. Därefter skelettiserar cellområdet till ett enkelt nätverk och använd filterpartiklar för att ta bort små icke-nätverksbaserade partiklar i resultaten.Nätverksfilterpartiklar i en nätverksavbildning. För att få röda och gröna kanaler, utför dubbelfiltrering och konvertera till mask enligt den anpassade tröskelmetoden. Använd analysera partiklar för att bestämma cellmorfologin i den binära gröna bilden.Använd operatorn eller för att slå samman alla kanaler med hjälp av deras intresseområden och justera deras ursprungliga färg till en enkel RGB-bild. Om du vill utföra en encellig motilitetsanalys högerklickar du på spårningsverktyget för en enda cell för att öppna motsvarande alternativ och justera inställningarna för att skapa en exakt segmentering av bilder. Klicka på OK och vänsterklicka på encellsspårning för att ta bort den grå kanalen.Om du vill generera en bild som motsvarar en bildstack enligt tiden använder du Z-projektion och dubbelfilter och konverterar för att maskera spåren som cellerna lämnat efter sig. Ta bort de små partiklarna från den binära röda och gröna bilden som visas. Använd verktyget intresseområde för att markera varje kontur för cellspårningen och markera rutan för identifiering av överhoppningskanten i alternativdialogfönstret.Isolera den röda kanalen i den ursprungliga stapeln och välj en intressant region. Dubbelfiltrering av alla bilder och konvertera till mask så att centroid XY-positionen för varje binariserad kärna kan bestämmas. XY-positionerna kan användas för att beräkna medelvärdet för kvadratisk förskjutning, riktningsförhållande och medelhastighet för cellen.För analys av spårning av flera celler högerklickar du på spårningsverktyget för att öppna motsvarande alternativdialogruta och justerar inställningarna för att skapa en exakt segmentering av bilder. Vänsterklicka på spårningsverktyget för att ta bort den grå kanalen. Dela de röda och gröna kanalerna, dubbelfilter och konvertera till mask.Använd sedan kommandot bildkalkylator med operatorn och för att slå samman kanalerna och endast lämna kärnans signal som finns i membranen och beräkna banatomten, medelvärdet för kvadratförskjutning, riktningsförhållande och medelhastigheten för cellerna som visas. Fluorescerande GBM co-cultured med mönstrade nervceller snabbt ändra sin form och visa migrering längs neuronala förlängningar i en slumpmässig rörelse. GBM-celler som sås på nervceller visar en långsträckt form med flera utskjutningar som följer neuronspåren medan cellerna behåller sin rundade form när de odlas på laminin.I senare stadier av kulturen kan tunna utskjutningar som länkar till celler observeras i GBM neuronala samkulturer. GBM celler sådd på nervceller visar en större flyttande kapacitet än GBM celler sådd på laminin som observerats i dessa bana tomter. Analys av cellernas fluorescerande sammanflöde visar att under en 500-minuters observationsperiod observeras mer cellmigration när sfäroiderna samkultureras med nervceller än när cellerna odlas enbart på laminin.I slutet av analysen är nästan hälften av mönstret täckt med GBM-celler medan sfäroiderna som odlas på laminin förblir oadresserade till täcket. Beroende på de biologiska frågor du vill svara på bör man vara försiktig med att mönsterdesignen och även celltätheten är representativa för in vivo-förhållandena. Cellerna kan fixas och avbildas med konfokal mikroskopi.Live imaging är också möjligt eftersom vår metod inte försämrar bildframställningskapaciteten. Denna teknik är väl lämpad för att studera molekylär interaktion, såsom metaboliska utbyten mellan glioblastomceller och nervceller. Det möjliggör utforskning av funktionsbiologiska processer.Experiment med hög genomströmning kan också göras för kliniska ändamål.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser för att studera makrofager och mikroglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flöde flödescytometri-baserade Drug Screening System för identifiering av små molekyler som främjar celldifferentiering av Glioblastoma stamceller

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Med Dot-analys att analysera Migration av Cell ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulärt och cellulära Lung modell att studera tumör metastasering

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymala stamceller isolering från massa vävnad och samtidig kultur med cancerceller för att studera deras interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Använda Microarrays att förhöra mikromiljö påverkan på cellulära fenotyper i cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering av Stem-liknande celler från 3-dimensionella sfäroid kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Studera effekterna av Tumörutsöndras Paracrine ligander på Makrofagaktivering med hjälp av co-kultur med permeabla membran stöder

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...