Name: co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Bu çalışma Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO tarafından desteklendi. Alveole, Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43) tarafından desteklenmektedir. Joris Guyon, Toulouse Üniversite Hastanesi'nden (CHU Toulouse) burs alan bir kişidir.

Tüm hastalardan (yerel etik kurul yönetmeliklerine göre Norveç'in Bergen kentindeki Haukeland Hastanesi'nden) bilgilendirilmiş yazılı onay alınmıştır. Bu protokol Bordeaux Üniversitesi insan ve hayvan araştırma etik kurullarının yönergelerine uyar. Hamile sıçanlar Bordeaux Üniversitesi'nin hayvan tesisinde barındırıldı ve tedavi edildi. E18 zamanlı hamile bir sıçanın ötanazisi CO2kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm hayvan işlemleri kurumsal yönergelere göre yapılmış ve yer...

<ol>
	<li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma.">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li><li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance.">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li><li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1&#945;/CXCR4+expression+in+glioblastomas.">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1&#945;/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li><li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression.">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li><li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits.">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li><li>Boy&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CXCR3/LRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors.">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571 (2017).</li><li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development.">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146 (2019).</li><li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks.">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li><li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma.">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li><li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+Printing+by+Light?Induced+Molecular+Adsorption.">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li><li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells.">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li><li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems.">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li><li>Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates.">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).</li><li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+a+dish:+the+promise+of+iPSC-derived+neurons.">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li><li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt/&#946;-catenin+signalling.">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/&#946;-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li></ol>

Glioblastomas, farklı modlar kullanarak parenkimayı kapsamlı bir şekilde istila eder: WMTs18'dekan damarlarını çevreleyen ortak seçenek, interstisyel istila veya istila . Bu ikinci mod, literatürde WMT istilası ile ilgili uygun in vitro veya in vivo modelleri bulma zorluğu nedeniyle iyi karakterize değildir. Burada, kültürlü kemirgen nöronlarının laminin kaplı yüzeylerde desenli olduğu ve nöronların üzerine floresan GBM kök benzeri hücrelerin tohum edild...

GBM'ler de dahil olmak üzere primer malign gliomalar yıkıcı tümörlerdir ve GBM hastaları için orta sağkalım oranı 12 ila 15 ay olarak bildirilmiştir. Mevcut tedavi, radyoterapi ile birlikte büyük tümör kitle rezeksiyonu ve kemoterapiye dayanır, bu da sağkalım oranını sadece birkaç ay uzatır. Terapötik başarısızlıklar, kan-beyin bariyeri (BBB) boyunca zayıf ilaç dağıtımı ve pervasküler alanlarda, menenjitlerde ve WMTs1boyunca invaziv büyüme ile yakından ilgilidir. Vasküler ko-seçenek olarak da adlandırılan pervasküler istila iyi çalışılmış bir süreçtir ve moleküler mekanizmalar aydınlatılmaya başlanmıştır; ancak, WMTs boyunca GBM hücre istilası süreci iyi anlaşılamamıştır. Tümör hücreleri Scherer'in ikincil yapıları boyunca sağlıklı beyne göç2. Gerçekten de, neredeyse bir yüzyıl önce, Hans-Joachim Scherer, şimdi perineuronal satellitoz, perivasküler satellitoz, subpial spread ve WMT boyunca istila olarak adlandırılan GBM'nin istilacı yollarını tanımladı (Şekil 1A).
Stromal hücre türevi faktör-1α (SDF1α) ve C-X-C motifli kemokin reseptörü 4 (CXCR4) gibi bazı kemokinler ve reseptörleri, ancak vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) değil, WMT invazyon3'ekarışmış gibi görünmektedir. Daha yakın zamanda, hücrelerarası bir ÇEN1-SOX2 ekseninin, GBM hücrelerinin WMT istilasında önemli bir yol olduğu gösterilmiştir4. Yazarlar, GBM kök benzeri hücrelerin kısmen olgunlaşmamış nöronlarda beyin parenkimini nasıl istila ettiğini anlattılar ve miyelin kılıflarının GBM hücreleri tarafından yok edilmesini önerdiler. 2019 yılında Nature dergisinde üç makalenin güvenli bir şekilde yayınlandığı bir kilometre taşına ulaşıldı ve glioma gelişiminde elektriksel aktivitenin rolünün altını çizdi5,6. Monje ve işbirlikçilerinin ufuk açıcı çalışmaları, glioma gelişimini destekleyen nöroligin-3'ün salgılanmasında elektrik aktivitesinin merkezi rolüne ışık tutuyor.
Winkler ve işbirlikçileri, GBM hücreleri (mikrotüpler) arasındaki bağlantıların invaziv adımlarda ve son zamanlarda yeni tanımlanan nöroglioma sinapsları aracılığıyla GBM hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşimlerde çok önemli olduğunu açıkladılar. Bu yapılar, tümör gelişimini ve istilasını destekleyen GBM hücre zarındaki α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoksazolepropionik asit (AMPA) reseptörlerinin glutamaterjik stimülasyonunu tercih eder. Tümör hücre invazyonu, GBM hastalarında gözlendiği gibi metastazların veya uzak sekonder odakların yayılmasında merkezi bir süreçtir. Thrombospondin-1, dönüşen büyüme faktörü beta (TGFβ tarafından düzenlenmiş matrisli protein veya kemokin reseptörü CXCR3)7,8gibi GBM invazyonunda önemli olduğu belirlenmiştir.
Burada, nöronların laminin izleri üzerinde desenli olduğu ve GBM hücrelerinin tek hücreli veya küresel olarak tohumlandığı GBM istilasını incelemek için basitleştirilmiş bir biyomimetik model tanımlanmıştır (Şekil 1B). İki deneysel ayar, GBM 9,10,11'de gözlenen nöronlar üzerindeki istilayı yeniden yakalamayı amaçlamaktadır. Bu tür modeller geçmişte, mekanik veya kimyasal özellikleri modüle ederek hücre göçlerini incelemeye izin veren hizalanmış nanofiber biyomalzemeler (çekirdek kabuk elektrospinning) olarak geliştirilmiştir12. Bu makalede açıklanan ortak kültür modeli, bu süreçte yer alan yeni moleküler yollar tanımlayarak GBM hücrelerinin nöronlar üzerinde nasıl kaçtığını daha iyi anlamanızı sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440140-100ML</td>
			<td>The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round-bottom plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2582624</td>
			<td>Used to prepare spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C (long-term) or 4 &#176;C (short-term), sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>111580</td>
			<td>Cell culture substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator cartridges</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z363456-6EA</td>
			<td>Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software, MTrack2 macro</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm&#178;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td></td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Promotes neuronal adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>loading of envisioned micropatterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Software&#160;</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscopy automation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>inverted microscope equipped with a motorized stage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLPP</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PLPPclassic_1ml</td>
			<td>Photoinitiator used to degrade the PEG brush</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>VA-PEG-VA-5000-5g</td>
			<td>Used as an anti-fouling coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMO</td>
			<td>Alveole</td>
			<td>PRIMO1</td>
			<td>Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture of glioblastoma stem-like cells on patterned neurons to study migration and cellular interactions

Glioblastomas (GBM), grade IV malign gliomalar, agresif özellikleri nedeniyle en ölümcül insan kanseri türlerinden biridir. Bu tümörlerin genetiğindeki önemli gelişmelere rağmen, GBM hücrelerinin sağlıklı beyin parankimini nasıl istila ettiği iyi anlaşılamamıştır. Özellikle, GBM hücrelerinin peritümoral alanı farklı rotalarla istila ettiği gösterilmiştir; bu makalenin ana ilgisi beyaz madde yolları (WMTs) boyunca rotadır. Tümör hücrelerinin peritumoral sinir hücresi bileşenleri ile etkileşimleri iyi karakterize değildir. Burada nöronların GBM hücre invazyonunun üzerindeki etkisini değerlendiren bir yöntem tanımlanmıştır. Bu makale, GBM kök benzeri hücrelerin nöronlar üzerindeki göçünü analiz ederek WMT invazyonunun taklit edildiği gelişmiş bir ortak kültür in vitro testini sunun. GBM hücrelerinin nöronların varlığındaki davranışları, açık kaynaklı ve serbest erişimli yazılımlarla otomatik bir izleme prosedürü kullanılarak izlenir. Bu yöntem, özellikle fonksiyonel ve mekanistik çalışmalar için birçok uygulamanın yanı sıra GBM hücre göçini engelleyebilen farmakolojik ajanların nöronlar üzerindeki etkilerini analiz etmek için yararlıdır.

Protokol bölümünde açıklandığı gibi floresan GBM hücreleri ile birlikte kültürlenen desenli nöronlar hazırlandı ve izleme deneyleri yapıldı. GBM hücreleri nöronlara göç ederken şekillerini hızla değiştirdi (Şekil 1B: panel 6 ve Video 1). Hücreler rastgele bir hareketle nöronal uzantılar boyunca göç etti (Video 1). Floresan GBM hücreleri ve floresan olmayan nöronlar kolayca ayırt edilebilir ve bu, protokol bö...

Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions at JoVE.com

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Burada, desenli nöronlar üzerinde glioblastoma (GBM) göçünü analiz etmek için kullanımı kolay bir ortak kültür tahlili sunuyoruz. Nöronlar üzerinde GBM hücre göçünün kolay ölçülmesi için FiJi yazılımında bir makro geliştirdik ve nöronların GBM hücre invaziv kapasitesini değiştirdiğini gözlemledik.

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Glioblastomalar, invaziv profili yüksek olan yıkıcı beyin tümörleridir. Bu ortak kültür sistemi, hastalarda gözlenen invaziv rotalardan birini yeniden canlandırmak için nöronlar üzerindeki glioblastoma hücrelerinin göçini taklit eder. Ortak kültür modelimizin geometrisi ve bileşimi tam olarak kontrol edilir.Daha iyi bir tekrarlanabilirliği ve karmaşık biyolojik süreçlerin basit bir nicelemesini kolaylaştırır. Bu yöntem, yeni ayrışmış glioblastoma hücreleri ve nöronları birlikte kült ederek klinik tanıya uyarlanabilir. Klinik sonuç olarak çok önemli olan klinik indeksi tanımlar.Yöntemimiz, fibroblastlar veya bağışıklık hücreleri gibi diğer göç eden hücreleri ölçmek için de kullanılabilir. Prosedürü gösteren joris Guyon olacak, ekibimden bir doktora öğrencisi. Mikropatterning için bir substrat yapmak için, kapakları bir saat boyunca 100 mikrolitre triethoxysilane ile bir desiccator'a yerleştirmeden önce beş dakika boyunca hava veya plazma aktivasyonu ile 18 milimetre dairesel cam kapak örtülerini tedavi edin, ardından bir saat boyunca milimetre başına 100 miligramda bir PEG-SVA çözeltisini kuluçkaya bırakın.Jel biriktirme için, inkübasyonun sonunda, slaytın ortasına üç mikrolitre PLPP ve 50 mikrolitre mutlak etanol ekleyin ve tamamen kuruyana kadar bekleyin. Cam slayt mikropatterning için, kapak kapağını bir Ludin odasına monte edin ve hazneyi otomatik odaklama sistemi ile donatılmış bir mikroskop aşamasına yerleştirin. Görüntülemeden sonra, mikropattern görüntüleri yazılıma yükleyin.Otomatik UV aydınlatma diziliminden sonra, PLPP'yi kapaktan PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkamak için bir pipet kullanın. Daha sonra kapak sapını mililitre laminin başına 50 mikrogram ile 30 dakika kuluçkaya yatırın, ardından gösterildiği gibi PBS ile başka bir yıkama yapın. Mikropattern kapak örtülerinde embriyonik bir sıçan hipokampal nöron kültürü kurmak için, son yıkamadan sonra, cam slaytları nöronal hücre kültürü ortamı ile yeniden sulandırın.Nörobasal ortamda askıya alınan dördüncü sıçan hipokampal nöronlara beş kez 10 tohum, 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit inkübatöründe 24 saatlik bir inkübasyon için her mikropatterned kapak kapağına santimetrekare başına% 3 at serumu ile zenginleştirilmiştir. Santrifüj, glioblastoma hücrelerini 1.000 RPM'de beş dakika boyunca ayrıştırdı ve peleti glioblastoma hücre kültürü ortamına yeniden depoladı, ardından mikropatterned nöronlar üzerinde üçüncü GBM hücrelerine bir kez 10 kez biriktirdi. Hücrelerin canlı hücre görüntülemesi için, ortak kültürü 37 santigrat derece termostat odası ile donatılmış ters bir mikroskop aşamasına yerleştirin ve 20X hedefini seçin.Daha sonra mikroskop yazılımındaki çok boyutlu satın alma araç kutusunu kullanarak nöronlu desenlerin sayısına göre 16 farklı pozisyonda 12 saat boyunca her iki dakikada bir canlı Brightfield ve epifluoresanS GFP domates görüntüleri elde edin. Nöronal ağ analizi için, görüntülemeden sonra yığından bir görüntü seçin. İlgili seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları yapmak için ağ aracını sağ tıklatın.Tamam'ı tıklatın. Seçili görüntüyü çoğaltmak ve görüntüyü kırmızı, gri ve yeşil renk kanallarına bölmek için ağ aracını sol tıklatın. Gri kanalı seçin ve farklı alanlar arasındaki ayrımı iyileştirmek için kontrast uzatma geliştirmesi gerçekleştirin. 2D sinyal işleme konvoksiyonunu find edge komutu altında gruplandırıldığı şekilde gerçekleştirmek için Sobel kenar dedektörünü kullanın.Çift filtreleme için, gürültüyü azaltmak ve nesne sinyalini yumuşatmak için Gauss bulanıklığı ve ortanca filtre uygulayın. Maskeye dönüştürmek için, siyah beyaz pikselli ikili bir resim elde etmek için uyarlanmış eşik algoritmaları çalıştırın. Ardından, hücre alanını basit bir ağa iskeletleştirin ve sonuçlardaki küçük ağ dışı parçacıkları gidermek için filtre parçacıklarını kullanın.Ağ görüntüsündeki ağ filtresi parçacıkları. Kırmızı ve yeşil kanallar elde etmek için, uyarlanmış eşikleme yöntemini kullanarak gösterildiği gibi çift filtreleme gerçekleştirin ve maskeye dönüştürün. İkili yeşil görüntüdeki hücre morfolojisini belirlemek için çözümleme parçacıklarını kullanın.İlgi çekici bölgelerini kullanarak tüm kanalları birleştirmek ve ilk renklerini basit bir RGB görüntüsüne yeniden yönlendirmek için veya işlecini kullanın. Tek hücreli hareketlilik analizi yapmak için, tek hücreli izleme aracını sağ tıklatarak ilgili seçenekler iletişim kutusunu açın ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları yapın. Tamam'ı tıklatın ve gri kanalı kaldırmak için tek hücreli izlemeyi sol tıklatın.Zamana göre bir görüntü yığınına karşılık gelen bir görüntü oluşturmak için Z projeksiyonu ve çift filtre uygulayın ve hücrelerin bıraktığı izleri maskelemek için dönüştürün. Gösterildiği gibi ikili kırmızı ve yeşil görüntüden küçük parçacıkları çıkarın. Hücre izlemenin her konturunun seçilmesi ve seçenekler iletişim penceresinde kenar algılamayı atla kutusunun işaret edilmesi için ilgi alanı aracını kullanın.Kırmızı kanalı özgün yığında yalıtın ve ilgi çekici bir bölge seçin. Tüm görüntüleri çift filtreleyin ve her binarized çekirdeğin centroid XY konumunun belirlenmesini sağlamak için maskeye dönüştürün. XY konumları, hücrenin ortalama kare yer değiştirme, yön oranı ve ortalama hızını hesaplamak için kullanılabilir.Birden çok hücre izleme analizi için, ilgili seçenekler iletişim kutusunu açmak için izleme aracını sağ tıklatın ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları yapın. Gri kanalı kaldırmak için izleme aracını sol tıklatın. Kırmızı ve yeşil kanalları bölün, çift filtreyi filtreleyin ve maskeye dönüştürün.Ardından, yalnızca membranlarda bulunan çekirdek sinyalini bırakan kanalları birleştirmek ve gösterilen gibi hücreler için yörünge grafiğini, ortalama kare yer değiştirmeyi, yön oranını ve ortalama hızı hesaplamak için ve işleci ile görüntü hesaplayıcı komutunu kullanın. Desenli nöronlarla birlikte kültürlenen floresan GBM, şekillerini hızla değiştirir ve rastgele bir hareketle nöronal uzantılar boyunca göçü gösterir. Nöronlara tohumlanan GBM hücreleri, hücreler laminin üzerinde kültürlendiğinde yuvarlatılmış şekillerini korurken nöron izlerini takip eden birden fazla çıkıntı ile uzun bir şekil gösterir.Kültürün sonraki aşamalarında, GBM nöronal ortak kültürlerinde hücrelere bağlanan ince çıkıntılar gözlenebilir. Nöronlara tohumlanan GBM hücreleri, bu yörünge alanlarında gözlemlendiği gibi laminin üzerine tohumlanmış GBM hücrelerinden daha fazla göçmen kapasitesi göstermektedir. Hücrelerin floresan birleştiği analizi, 500 dakikalık bir gözlem süresi boyunca, küreseller nöronlarla birlikte kültürlendiğinde, hücrelerin sadece laminin üzerinde kültürlendiğinden daha fazla hücre göçü gözlendiğini göstermektedir.Gerçekten de analizin sonunda, kalıbın neredeyse yarısı GBM hücreleriyle kaplanırken, laminin üzerinde kültürlenen küreseller kapak ucuna bağlı kalmaz. Cevaplamak istediğiniz biyolojik sorulara bağlı olarak, desen tasarımının ve ayrıca hücre yoğunluğunun in vivo koşulları temsil etmesine dikkat edilmelidir. Hücreler konfokal mikroskopi ile sabitlenebilir ve görüntülenebilir.Yöntemimiz görüntüleme yeteneklerini bozmadığı için canlı görüntüleme de mümkündür. Bu teknik, glioblastoma hücreleri ve nöronlar arasındaki metabolik değişimler gibi moleküler etkileşimi incelemek için çok uygundur. Fonksiyon biyolojik süreçlerinin araştırılmasına izin verir.Yüksek verimli deneyler klinik amaçlar için de yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mezenkimal kök hücre izolasyon hamuru doku ve kanser hücreleri ile ortak kültür ilişkileri incelemek için

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Kanser hücresel Phenotypes üzerinde Mikroçevresel etki Interrogate için Microdiziler kullanma

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

3 Boyutlu Spheroid Kültürlerden Kök Benzeri Hücrelerin İzolasyon

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...