Name: purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies at JoVE.com

نشكر باولو ديلابونا وجوليا كاسوراتي على الدعم العلمي والقراءة النقدية للمخطوطة. نشكر أيضا مرفق NIH Tetramer Core على رباعي الأقراص المضغوطة CD1d. تم تمويل الدراسة من قبل فوندازيون كاريبلو غرانت 2018-0366 (إلى M.F.) وزمالة الجمعية الإيطالية لأبحاث السرطان (AIRC) 2019-22604 (إلى G.D.).

تم استعراض الإجراءات الموصوفة هنا والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) (رقم 1048) في معهد سان رافائيل العلمي.
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة. يتم سرد كافة الكواشف المستخدمة في جدول المواد.
1. معالج...

<ol>
	<li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+natural+killer+T+(NKT)+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1(-)CD4(+)+CD1d-dependent+precursor+stage.">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li><li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage.">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li><li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells.">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li><li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development.">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li><li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+CD40/Fas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression.">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy.">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells.">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li><li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo.">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li><li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis.">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L++NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo.">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li><li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells.">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li><li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting.">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-party+CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality.">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4+CD25+FoxP3++regulatory+T+cells.">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li><li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation.">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li><li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism.">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li><li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease.">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma.">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma:+an+interim+analysis.">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li><li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma:+A+Phase+I+Clinical+Trial.">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li><li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy.">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).</li></ol>

هنا نعرض بروتوكول قابل للاستنساخ وقابلة للتنفيذ للحصول على الملايين من خلايا iNKT الجاهزة للاستخدام. بسبب ندرة هذه الخلايا في الجسم الحي، كانت هناك حاجة ماسة إلى طريقة لتوسيعها. البروتوكول الذي نقترحه لا يتطلب أجهزة معينة ولا عدد كبير من الفئران. لقد استغلينا فئران iVα14-Jα18 المعدلة وراثيا عن...

الخلايا التائية القاتلة الطبيعية الثابتة (خلايا iNKT) هي خلايا ليمفاوية T تشبه الفطرية تعبر عن مستقبلات خلايا T شبه ثابتة (TCR) ، تشكلت في الفئران بواسطة سلسلة Vα14-Jα18 ثابتة مقترنة بمجموعة محدودة من سلاسل Vβ المتنوعة1، وهي محددة للمستضدات الدهنية التي يقدمها جزيء MHC I-RELATED CD1d2. تخضع خلايا iNKT لبرنامج اختيار ناهض مما يؤدي إلى اكتساب النمط الظاهري المنشط / الفطري الموجود بالفعل في الغدة الصعترية ، والذي يحدث من خلال عدة مراحلنضوج 3و4، وإنتاج CD4+ و CD4- فرعية. من خلال هذا البرنامج، تكتسب خلايا iNKT مساعد T متميز (TH)الأنماط الظاهرية المؤثرة، وهي TH1 (iNKT1) و TH2 (iNKT2) و TH17 (iNKT17)، التي يمكن التعرف عليها من خلال التعبير عن عوامل النسخ T-bet و GATA3 و PLZF و RORаt، على التوالي5. تتعرف خلايا iNKT على مجموعة من الدهون الميكروبية ولكنها أيضا ذاتية التفاعل ضد الدهون الذاتية التي يتم تنظيمها في سياق الحالات المرضية لإجهاد الخلايا وتلف الأنسجة ، مثل السرطان والمناعة الذاتية2. عند التنشيط، تعدل خلايا iNKT وظائف الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية الأخرى عن طريق الاتصال المباشر وإنتاج السيتوكين2.
وقد تم تسهيل التحقيقات في خلايا iNKT من خلال نماذج الماوس ، بما في ذلك الفئران التي تعاني من نقص CD1d أو Jα18 ، وإنتاج رباعيات CD1d المحملة بالمستضد بالإضافة إلى توليد أجسام مضادة أحادية النسيلة (mAbs) محددة ل TCR البشري شبه المتغير. ومع ذلك، فقد ثبت أن إنشاء خط الخلية iNKT الماوس الأساسي صعبة. لتوصيف أفضل لوظائف antitumor من خلايا iNKT والاستفادة منها للعلاج بالخلايا بالتبني، وضعنا بروتوكول لتنقية وتوسيع خلايا iNKT splenic من الفئران المعدلة وراثيا iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6،والتي خلايا iNKT هي 30 مرة أكثر تواترا مما كانت عليه في الفئران نوع البرية.
يمكن استغلال خلايا iNKT الموسعة لإجراء فحوصات في المختبر ، وفي الجسم الحي عند نقلها مرة أخرى إلى الفئران. في هذا الإعداد، على سبيل المثال، لقد أظهرنا آثارها المضادة للورم قوية7. وعلاوة على ذلك، في المختبر توسيع خلايا iNKT قابلة للتعديل الوظيفي عن طريق نقل الجينات أو التحرير قبل حقنها في الجسم الحي8،مما يسمح التحليل الوظيفي الثاقبة للمسارات الجزيئية، فضلا عن تمهيد الطريق لعلاجات الخلايا المتقدمة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115506</td>
			<td>clone 6D5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d-tetramer -PE</td>
			<td>NIH tetramer core facility</td>
			<td></td>
			<td>mouse PBS57-Cd1d-tetramers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 -PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100528</td>
			<td>clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocker</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0186L</td>
			<td>heat-inactivated and filtered .22 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Transcription factor staining buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2 (IAb) -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>114406</td>
			<td>clone AF6-120.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hrIL-2</td>
			<td>Chiron Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer (MB)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermWash</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>51-2091KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat Mouse IL-7</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>407-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; -APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109212</td>
			<td>clone H57-597</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;CD3CD28 mouse T activator Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11452D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies

الخلايا T القاتل الطبيعي الثابت (iNKT) هي خلايا ليمفاوية T تشبه الفطرية تعبر عن مستقبلات خلايا T شبه ثابتة (TCR) محفوظة محددة لمستضدات الدهون الذاتية أو الميكروبية التي يقدمها جزيء MHC غير متعدد الأشكال من الفئة I-RELATED CD1d. تدعم الدراسات قبل السريرية والسريرية دورا لخلايا iNKT في السرطان والمناعة الذاتية والأمراض المعدية. يتم الحفاظ على خلايا iNKT جدا في جميع أنحاء الأنواع وقد تم تسهيل تحقيقها من خلال نماذج الماوس ، بما في ذلك الفئران التي تعاني من نقص CD1d أو iNKT - deficient ، وإمكانية اكتشافها بشكل لا لبس فيه في الفئران والرجال الذين يعانون من رباعيات CD1d أو mAbs محددة لTCR شبه ثابتة. ومع ذلك، فإن خلايا iNKT نادرة وتحتاج إلى توسيعها للوصول إلى أرقام يمكن التحكم فيها لأي دراسة. لأن جيل خط الخلية iNKT الماوس الأساسي في المختبر قد ثبت صعوبة, وضعنا بروتوكول قوي لتنقية وتوسيع خلايا iNKT splenic من الفئران المعدلة وراثيا iVα14-Jα18 (iVα14Tg), التي خلايا iNKT هي 30 مرات أكثر تواترا. نظهر هنا أن خلايا iVα14Tg iNKTg الأولية يمكن تخصيبها من خلال عملية فصل مغناطيسية مناعية ، مما ينتج عنه حوالي 95-98٪ من خلايا iNKT النقية. يتم تحفيز خلايا iNKT المنقى بواسطة حبات مضادة للCD3/CD28 بالإضافة إلى IL-2 و IL-7 ، مما يؤدي إلى توسع 30 ضعفا بحلول اليوم +14 للثقافة مع نقاء 85-99٪. يمكن التلاعب بسهولة خلايا iNKT الموسعة وراثيا ، مما يوفر أداة لا تقدر بثمن لتشريح آليات التنشيط والوظيفة في المختبر ، والأهم من ذلك ، أيضا عند النقل بالتبني في الجسم الحي.

البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة يمكن من إثراء خلايا iNKT من طحال الفئران المعدلة وراثيا iVa14-Ja18 من خلال عملية فصل مغناطيسية مناعية ملخصة في الشكل 1A. يتم اختيار إجمالي خلايا الطحال T أولا بشكل سلبي عن طريق استنفاد الخلايا B والخلايا الأحادية ، تليها الفرز المناعي الإيجابي لل...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies at JoVE.com

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

نحن نصف بروتوكول سريع وقوي لإثراء الخلايا القاتل الطبيعي الثابت T (iNKT) من طحال الماوس وتوسيعها في المختبر إلى أرقام مناسبة للدراسات المختبرية وفي الجسم الحي.

تنقية وتوسيع الخلايا T القاتل الطبيعي الثابت الماوس في المختبر وفي دراسات في الجسم الحي

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

هذا البروتوكول يتيح تنقية الخلايا التائية الحبر، والتي هي نادرة جدا، ويسمح للتوسع 30 أضعاف في عددهم. يمكن إجراء تنقية في يوم واحد وإنتاج عدد كبير من الخلايا التائية الحبر جاهزة للاستخدام في الجسم الحي وفي المختبر الدراسات في غضون أسبوعين. إثبات الإجراء سيكون غلوريا دلفانتي، ما بعد الوثيقة في المختبر.بعد تشريح طحال الماوس، سحق من خلال مصفاة خلية 70 نانومتر للحصول على تعليق خلية واحدة في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2٪FBS. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع ملليلتر واحد من كلوريد الأمونيوم المعقمة البوتاسيوم يسين العازلة.احتضان الخلايا لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم كتلة مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2٪FBS. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد إزالة supernatant، resuspend بيليه الخلية في ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2٪ FBS وإزالة بقايا الدهون عن طريق الأنابيب.لخطوات التخصيب، والحفاظ على الخلايا الباردة واستخدام حلول تبريد مسبق في أربع درجات مئوية ومن ثم الاحتفاظ بها على الجليد. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. Resuspend جميع الخلايا في المبلغ المناسب من برنامج تلفزيوني مع 2٪ FPS و Fc مانع واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.اغسله بما بين ملليلتر واحد ومليلترين من حاجز فصل MACS لكل 10 ملايين خلية وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق. بعد إزالة النافورة، وصمة عار الخلايا مع CD19-FITC وH2-IAb-FITC واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في أربع إلى ثماني درجات مئوية. اغسل الخلايا بإضافة ملليلتر واحد إلى اثنين من المخزن المؤقت MACS لكل 10 ملايين خلية وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق.إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 90 ميكرولتر من العازلة MACS لكل 10 مليون خلية. إضافة 10 ميكرولتر من الميكروبات المضادة ل FITC لكل 10 ملايين خلية. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في أربع إلى ثماني درجات مئوية.اغسل الخلايا بإضافة ملليلتر إلى ملليلترين من المخزن المؤقت MACS لكل 10 ملايين خلية وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق ما يصل إلى 125 مليون خلية في 500 ميكرولتر من العازلة MACS. ضع عمود LD في المجال المغناطيسي لمفصل MACS.لتجنب انسداد، تطبيق عامل تصفية ما قبل الفصل على العمود LD وشطفه مع اثنين من ملليلتر من المخزن المؤقت MACS. تطبيق تعليق الخلية على مرشح وجمع الخلايا غير البطاقة التي تمر عبر العمود. اغسل خزان العمود الفارغ ثلاث مرات بمللتر واحد من المخزن المؤقت ل MACS.جمع النفايات السائلة المخصبة تي الخلية والعد الخلايا، وحفظ 50 ميكرولتر لتحليل FACS. بعد الطرد المركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق، وإزالة supernatant وصمة عار الخلايا مع TETRAMER-PE CD1d. تخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام على الجليد.اغسل الخلايا بإضافة ملليلتر واحد إلى اثنين من المخزن المؤقت MACS لكل 10 ملايين خلية. بعد الطرد المركزي في 300 مرة G لمدة 10 دقائق، وإزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 80 ميكرولتر من العازلة MACS لكل 10 مليون خلية. إضافة 20 ميكرولتر من الميكروبات المضادة PE لكل 10 مليون خلية.تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في أربع إلى ثماني درجات مئوية. اغسل الخلايا بإضافة ملليلتر واحد إلى اثنين من المخزن المؤقت MACS لكل 10 ملايين خلية وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق ما يصل إلى 100 مليون خلية في 500 ميكرولتر من العازلة MACS.وفقا لعدد الخلايا، ضع عمود LS أو MS في المجال المغناطيسي لفاصل MACS وشطف العمود بحاجز MACS. تطبيق تعليق الخلية على العمود، وجمع الخلايا غير البطاقة التي تمر من خلال وغسل العمود ثلاث مرات كما هو موضح سابقا. هذا هو الكسر السالبقم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي ووضعه على أنبوب تجميع جديد. ماصة MACS المخزن المؤقت على العمود ودفع المكبس المقدمة في العمود لطرد الكسر الإيجابي المخصب في الخلايا التائية الحبر. لزيادة استعادة الخلايا التائية INK، قم بالطرد المركزي للكسر السالب عند 300 مرة G لمدة 10 دقائق وكرر الخطوات السابقة باستخدام عمود LS أو MS جديد.سحب الكسور الموجبة وتحديد عدد الخلايا. احتفظ ب 50 ميكرولتر من الكسور الإيجابية والسلبية لتحليل FACS للتحقق من النقاء. لتنشيط خلايا INK T بنسبة واحد إلى واحد، قم بنقل الحجم المناسب من الخرز المغناطيسي المضاد للCD3 وCD28 إلى أنبوب وبحجم متساو من PBS، ثم دوامة لمدة خمس ثوان.ضع الأنبوب على مغناطيس لمدة دقيقة واحدة وتجاهل العملاق. إزالة أنبوب من المغناطيس وإعادة إنفاق الخرز المغناطيسي غسلها في الحجم المناسب من RPMI. أجهزة الطرد المركزي تنقية الحبر تي الخلايا في 300 مرة G لمدة خمس دقائق ومزجها مع الماوس تي المنشط المضادة CD3 أو CD28 الخرز المغناطيسي.لوحة ملليلتر واحد من تعليق الخلية، والخرز المغناطيسي المضادة CD23 وCD28 في لوحة 48 جيدا مع 20 وحدة لكل ملليلتر IL-2، ثم احتضان في 37 درجة مئوية. بعد خمسة أيام، أضف 10 نانوجرامات لكل ملليلتر IL-7. تقسيم الخلايا إلى نصفين عندما تصل إلى 80 إلى 90٪ التقاء، مضيفا دائما 20 وحدة لكل ملليلتر IL-2 و 10 نانوغرام لكل ملليلتر IL-7.في ظل هذه الظروف، يمكن توسيع خلايا INK T لمدة تصل إلى 15 يوما. باستخدام هذا البروتوكول، يتم إثراء الخلايا التائية INK من طحال الفئران المعدلة وراثيا من خلال عملية فصل المغناطيسية المناعية. بعد التخصيب ، يمكن توسيع الخلايا مع حبات مضادة للCD3 و CD28 ، مما يؤدي إلى توسع 30 ضعفا في المتوسط بحلول اليوم 14 من الثقافة.التنشيط القوي مع مكافحة CD3 والخرز المضادة للقرص تسبب في downregulation التعبير TCR IMK T-الخلية على سطح الخلية وظهر السكان السلبية مزدوجة. غالبية الخلايا التائية الموسعة INK هي CD4 سلبية. جعل توصيف عوامل النسخ الخاصة بالنسب PLZF و ROR gamma T من الممكن تحديد الأنماط الظاهرية NKT1 و NKT2 و NKT17 على خلايا INK T المخصبة في اليوم صفر و14.تظهر الخلايا التائية المخصبة INK النمط الظاهري الشبيه ب T80 ، والذي يتم الحفاظ عليه بعد 14 يوما من التوسع كما أكده إفراز كل من إنترفيرون غاما وIL-4 بعد PMA وتحفيز الأيونوميسين. أثناء خطوات تنقية، تذكر أن تعمل بسرعة مع حلول تبريد مسبق والتخلص من أي بقايا الدهون التي يمكن أن ينظر إليها أثناء الأنابيب. يمكن استغلال الخلايا التائية الموسعة INK لإجراء فحوصات في المختبر وفي عمليات نقل الجسم الحي إلى الفئران ، حتى بعد التعديلات الوظيفية عن طريق نقل الجينات أو تحريرها.التوسع في المختبر من الخلايا التائية الحبر يتغلب على القيود التي تعطى من قبل ندرة, مما يجعلها قابلة للاستغلال في الدراسات قبل السريرية في مجالات مراقبة المناعة الورم, الأمراض المعدية, والمناعة الذاتية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

إعداد واستخدام HIV - 1 CD4 + T الابتدائية المصابة خلايا والخلايا المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية فحوصات السامة للخلايا

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

التوسع في الدم المحيطي الإنسان خلايا T γδ باستخدام Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

اشتقاق خلايا T<em&gt; في المختبر</em&gt; من الفأر الجنينية الخلايا الجذعية

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

والطريقة الأمثل لعزل وتوسيع قسما ثابتا الطبيعية الخلايا التائية القاتلة من الماوس الطحال

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...