Name: purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies at JoVE.com

Vi takker Paolo Dellabona og Giulia Casorati for videnskabelig støtte og kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker også NIH Tetramer Core Facility for mus CD1d tetramer. Undersøgelsen blev finansieret af Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (til M.F.) og Italian Association for Cancer Research (AIRC) stipendium 2019-22604 (til GDP).

De procedurer, der er beskrevet her, blev gennemgået og godkendt af Den Institutionelle Komité for Dyrepleje og Anvendelse (IACUC) (nr. 1048) på San Raffaele Scientific Institute.
BEMÆRK: Alle procedurer skal udføres under sterile forhold. Alle anvendte reagenser er angivet i materialetabellen.
1. Miltbehandling
<ol><li>Aflive iVα14-Jα18 mus ved indånding af CO2 i henhold til den institutionelle politik. BEMÆRK: iVα14-Jα18...

<ol>
	<li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+natural+killer+T+(NKT)+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1(-)CD4(+)+CD1d-dependent+precursor+stage.">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li><li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage.">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li><li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells.">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li><li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development.">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li><li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+CD40/Fas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression.">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy.">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells.">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li><li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo.">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li><li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis.">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L++NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo.">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li><li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells.">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li><li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting.">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-party+CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality.">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4+CD25+FoxP3++regulatory+T+cells.">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li><li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation.">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li><li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism.">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li><li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease.">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma.">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma:+an+interim+analysis.">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li><li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma:+A+Phase+I+Clinical+Trial.">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li><li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy.">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).</li></ol>

Her viser vi en reproducerbar og gennemførlig protokol for at få millioner af brugsklare iNKT-celler. På grund af manglen på disse celler in vivo var der meget brug for en metode til at udvide dem. Den protokol, vi foreslår, kræver hverken en bestemt instrumentering eller et stort antal mus. Vi udnyttede iVα14-Jα18 transgene mus med vilje til at reducere antallet af mus, der var nødvendige for proceduren.
En anden vellykket protokol for iNKT celle ekspansion fra iVα14-Jα18 transgene...

Invariant Naturlige dræber T-celler (iNKT-celler) er medfødte T-lymfocytter, der udtrykker en semi-invariant αβ T-celle receptor (TCR), dannet i mus af en invariant Vα14-Jα18 kæde parret med et begrænset sæt af forskellige Vβ kæder1, som er specifik for lipid antigener præsenteret af MHC klasse I-relaterede molekyle CD1d2. iNKT-celler gennemgår et agonistisk udvælgelsesprogram, hvilket resulterer i erhvervelse af en aktiveret /medfødt effektor fænotype, der allerede er i thymusen, hvilket sker gennem flere modningsstadier3,4, der producerer en CD4+ og en CD4- delmængde. Gennem dette program, iNKT celler erhverve forskellige T hjælper (TH)effektor fænotyper, nemlig TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) og TH17 (iNKT17), identificerbare ved udtryk for transskription faktorer T-bet, GATA3, PLZF, og RORγt, henholdsvis5. iNKT-celler genkender en række mikrobielle lipider, men er også selvreaktive mod endogene lipider, der er opreguleret i forbindelse med patologiske situationer med cellestress og vævsskader, såsom kræft og autoimmunitet2. Ved aktivering modulerer iNKT-celler funktionerne i andre medfødte og adaptive immuneffektorceller via direkte kontakt og cytokinproduktion2.
Undersøgelserne af iNKT-celler er blevet lettet af musemodeller, herunder CD1d-mangelfulde eller Jα18-mangelfulde mus, og af produktionen af antigenindlæste CD1d tetramers plus dannelsen af monoklonale antistoffer (mAbs), der er specifikke for den menneskelige semi-invariant TCR. Men dannelsen af primær mus iNKT celle linje har vist sig vanskeligt. For bedre at karakterisere antitumorfunktionerne i iNKT-celler og bruge dem til adoptivcelleterapi opretter vi en protokol til at rense og udvide milt iNKT-celler af iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg)6, hvor iNKT-celler er 30 gange hyppigere end i vilde mus.
Udvidede iNKT-celler kan udnyttes til in vitro-analyser og in vivo ved overførsel tilbage til mus. I denne indstilling har vi for eksempel vist deres potente anti-tumor effekter7. Desuden er in vitro udvidede iNKT-celler modtagelige for funktionel modifikation via genoverførsel eller redigering forud for deres injektion in vivo8, hvilket giver indsigtsfuld funktionel analyse af molekylære veje samt baner vejen for avancerede celleterapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115506</td>
			<td>clone 6D5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d-tetramer -PE</td>
			<td>NIH tetramer core facility</td>
			<td></td>
			<td>mouse PBS57-Cd1d-tetramers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 -PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100528</td>
			<td>clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocker</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0186L</td>
			<td>heat-inactivated and filtered .22 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Transcription factor staining buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2 (IAb) -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>114406</td>
			<td>clone AF6-120.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hrIL-2</td>
			<td>Chiron Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer (MB)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermWash</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>51-2091KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat Mouse IL-7</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>407-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; -APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109212</td>
			<td>clone H57-597</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;CD3CD28 mouse T activator Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11452D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies

Invariante Natural Killer T (iNKT) celler er medfødte-lignende T lymfocytter udtrykker en bevaret semi-invariant T-celle receptor (TCR) specifikke for selv eller mikrobielle lipid antigener præsenteret af ikke-polymorfe MHC klasse I-relaterede molekyle CD1d. Prækliniske og kliniske undersøgelser understøtter en rolle for iNKT celler i kræft, autoimmunitet og smitsomme sygdomme. iNKT-celler er meget konserverede i hele arterne, og deres undersøgelse er blevet lettet af musemodeller, herunder CD1d-mangelfulde eller iNKT-mangelfulde mus, og muligheden for utvetydigt at opdage dem hos mus og mænd med CD1d tetramers eller mAbs, der er specifikke for den semi-invariante TCR. Men, iNKT celler er sjældne, og de skal udvides for at nå håndterbare tal for enhver undersøgelse. Fordi dannelsen af primær mus iNKT cellelinje in vitro har vist sig vanskeligt, har vi oprettet en robust protokol til at rense og udvide milt iNKT celler fra iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg), hvor iNKT celler er 30 gange hyppigere. Vi viser her, at primære milt iVα14Tg iNKT-celler kan beriges gennem en immunmagnetisk adskillelsesproces, hvilket giver omkring 95-98% rene iNKT-celler. De rensede iNKT-celler stimuleres af anti-CD3/CD28 perler plus IL-2 og IL-7, hvilket resulterer i 30 gange ekspansion af dag +14 af kulturen med 85-99% renhed. De udvidede iNKT-celler kan let genetisk manipuleres, hvilket giver et uvurderligt værktøj til at dissekere aktiverings- og funktionsmekanismer og endnu vigtigere også ved adoptivoverførsel in vivo.

Den protokol, der er beskrevet i dette manuskript, gør det muligt at berige iNKT-celler fra milten af transgene mus iVa14-Ja18 gennem en immunomagnetisk separationsproces opsummeret i figur 1A. Samlede milt T-celler vælges først negativt ved udtømning af B-celler og monocytter, efterfulgt af iNKT-cellepositiv immunmagnetisk sortering med PBS-57 lipidantigenindlæste CD1d tetramers, der gør det muligt specifikt kun at plette iNKT-celler. Denne protokol giver omkring 2 x 106 af...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies at JoVE.com

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Vi beskriver en hurtig og robust protokol til at berige invariant naturlige dræber T (iNKT) celler fra musen milt og udvide dem in vitro til egnede tal for in vitro og in vivo undersøgelser.

Rensning og udvidelse af mus invariant naturlige Killer T-celler til in vitro og in vivo undersøgelser

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Denne protokol muliggør rensning af INK T-celler, som er meget sjældne, og giver mulighed for en 30-fold udvidelse i deres antal. Rensningen kan udføres på en dag og producere et stort antal brugsklare INK T-celler til in vivo- og in vitro-undersøgelser om to uger. Det vil være Gloria Delfanti, der er postdoc i laboratoriet.Efter dissekere musen milt, smadre det gennem en 70 nanometer celle si for at opnå en enkelt celle suspension i 10 milliliter PBS med 2% FBS. Centrifuge ved 300 gange G i fem minutter. Fjern supernatanten og genbrug cellepillen med en milliliter steril ammoniumchlorid kalium lysin buffer.Inkuber cellerne i tre minutter ved stuetemperatur, og bloker derefter med fem milliliter PBS med 2%FBS. Centrifuge ved 300 gange G i fem minutter. Efter fjernelse af supernatanten skal cellepillen genbruges i tre milliliter PBS med 2% FBS og fjerne fedtrester ved pipettering.Til berigelsestrinene skal cellerne holdes kolde og bruge opløsninger, der er forkølet ved fire grader Celsius og derefter opbevares på is. Centrifuge ved 300 gange G i fem minutter. Resuspend alle celler i den passende mængde PBS med 2% FPS og Fc blocker og inkubere i 15 minutter ved stuetemperatur.Vask med en til to milliliter MACS separation buffer pr 10 millioner celler og centrifuge ved 300 gange G i 10 minutter. Efter fjernelse af supernatanten skal cellerne plettes med CD19-FITC og H2-IAb-FITC og inkuberes i 15 minutter i mørke ved fire til otte grader Celsius. Vask celler ved at tilføje en til to milliliter MACS buffer pr 10 millioner celler og centrifuge ved 300 gange G i 10 minutter.Fjern supernatant og genbruge celle pellet i 90 mikroliter af MACS buffer pr 10 millioner celler. Tilsæt 10 mikroliter anti-FITC mikroperler pr. 10 millioner celler. Bland godt og inkuber i 15 minutter i mørket ved fire til otte grader Celsius.Vask cellerne ved at tilføje en til to milliliter MACS buffer pr 10 millioner celler og centrifuge ved 300 gange G i 10 minutter. Fjern supernatanten og genbrug op til 125 millioner celler i 500 mikroliter af MACS buffer. Placer en LD-kolonne i MACS-separatorens magnetfelt.For at undgå tilstopning skal du anvende et filter til separation på LD-kolonnen og skylle det med to milliliter MACS-buffer. Anvend celleaffjedringen på filteret, og saml de celler, der ikke er mærket, og som passerer gennem kolonnen. Vask det tomme søjlebeholder tre gange med en milliliter MACS-buffer.Saml T-celle beriget spildevand og tælle cellerne, holde 50 mikroliter til FACS analyse. Efter centrifugering ved 300 gange G i fem minutter skal supernatanten fjernes og pletter cellerne med CD1d tetramer-PE. Bland godt og inkuber i 30 minutter i mørket på is.Vask cellerne ved at tilføje en til to milliliter MACS buffer pr 10 millioner celler. Efter centrifugering ved 300 gange G i 10 minutter skal supernatanten fjernes og genbruges cellepillen i 80 mikroliters MACS-buffer pr. 10 millioner celler. Tilsæt 20 mikroliter anti-PE mikroperler pr 10 millioner celler.Bland godt og inkuber i 15 minutter i mørket ved fire til otte grader Celsius. Vask celler ved at tilføje en til to milliliter MACS buffer pr 10 millioner celler og centrifuge ved 300 gange G i 10 minutter. Fjern supernatanten og genbrug op til 100 millioner celler i 500 mikroliter af MACS buffer.I henhold til celletællingen skal du placere LS- eller MS-kolonnen i MAGNETFELTET på MACS-separatoren og skylle kolonnen med MACS-buffer. Anvend celleaffjedringen på kolonnen, saml umærkede celler, der passerer igennem, og vask kolonnen tre gange som beskrevet tidligere. Dette er den negative brøk.Fjern kolonnen fra magnetfeltet, og placer den på et nyt opsamlingsrør. Pipette MACS buffer på kolonnen og skubbe den medfølgende stempel ind i kolonnen for at skylle den positive brøkdel beriget i INK T-celler. For yderligere at øge INK T-celle opsving, centrifugere den negative brøk på 300 gange G i 10 minutter og gentag tidligere trin med en ny LS eller MS kolonne.Træk de positive brøker og bestemme celletælling. Hold 50 mikroliter af både positive og negative fraktioner til FACS-analyse for at kontrollere renheden. Hvis du vil aktivere INK T-celler i et en-til-en-forhold, skal du overføre den relevante mængde anti-CD3- og CD28-magnetiske perler til et rør og med et tilsvarende volumen PBS og derefter hvirvle i fem sekunder.Placer røret på en magnet i et minut og kassér supernatanten. Fjern røret fra magneten og genbrug de vaskede magnetiske perler i den korrekte volumen af RPMI. Centrifuge renset INK T-celler på 300 gange G i fem minutter og bland dem med mus T-aktivator anti-CD3 eller CD28 magnetiske perler.Plade en milliliter af celle suspension, anti-CD23 og CD28 magnetiske perler i en 48-brønd plade med 20 enheder pr milliliter IL-2, derefter inkubere ved 37 grader Celsius. Efter fem dage, tilføje 10 nanogram per milliliter IL-7. Split cellerne i halve, når de når 80 til 90% sammenløb, altid tilføje 20 enheder per milliliter IL-2 og 10 nanogram per milliliter IL-7.Under disse forhold kan INK T-celler udvides i op til 15 dage. Ved hjælp af denne protokol beriges INK T-celler fra milten af transgene mus gennem en immunmagnetisk adskillelsesproces. Efter berigelse kan cellerne udvides med anti-CD3 og CD28 perler, hvilket resulterer i en 30-fold udvidelse i gennemsnit af dag 14 af kulturen.Den stærke aktivering med anti-CD3 og anti-CD perler induceret nedregulering af IMK T-celle TCR udtryk på celleoverfladen og en dobbelt negativ population dukkede op. Størstedelen af de udvidede INK T-celler er CD4-negative. Karakterisering af slægtsspecifikke transskriptionsfaktorer PLZF og ROR gamma T gjorde det muligt at identificere NKT1-, NKT2- og NKT17-fænotyperne på berigede INK T-celler på dag nul og 14.De berigede INK T-celler viser en T80-lignende effektor fænotype, som bevares efter 14 dages ekspansion som bekræftet af udskillelsen af både interferon gamma og IL-4 efter PMA og ionomycin stimulation. Under rensningstrinene skal du huske at arbejde hurtigt med forkølede opløsninger og slippe af med eventuelle fedtrester, der kan ses under pipettering. Udvidede INK T-celler kan udnyttes til in vitro-analyser og in vivooverførsler til mus, selv efter funktionelle ændringer via genoverførsel eller redigering.In vitro udvidelse af INK T-celler overvinder den begrænsning, som knaphed, hvilket gør dem udnyttes i prækliniske undersøgelser inden for tumor immunovervågning, smitsomme sygdomme, og auto-immunitet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Kunstig antigenudvisende celle (AAPC) medieret aktivering og ekspansion af naturlige dræberceller T-celler

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigen-præsenterende celler (KaAPC) til effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Udtømning af humane antigen-specifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Afledning af T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Fra mus embryonale stamceller

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolation og<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering til T-celledelmængder

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimeret fremgangsmåde til isolering og udvidelse Invariant Natural Killer T-celler fra musemilt

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...