Name: purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies at JoVE.com

Wij danken Paolo Dellabona en Giulia Casorati voor de wetenschappelijke ondersteuning en kritische lezing van het manuscript. We bedanken ook de NIH Tetramer Core Facility voor muis CD1d tetrameer. De studie werd gefinancierd door Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (aan M.F.) en de Italiaanse Vereniging voor Kankeronderzoek (AIRC) fellowship 2019-22604 (aan G.D.).

De hier beschreven procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (nr. 1048) van het San Raffaele Scientific Institute.
OPMERKING: Alle procedures moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Alle gebruikte reagentia zijn opgenomen in de tabel met materialen.
1. Miltverwerking
<ol><li>Euthanaseer iVα14-Jα18 muizen door inademing van CO2 volgens het institutionele bel...

<ol>
	<li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+natural+killer+T+(NKT)+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1(-)CD4(+)+CD1d-dependent+precursor+stage.">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li><li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage.">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li><li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells.">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li><li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development.">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li><li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+CD40/Fas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression.">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy.">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells.">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li><li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo.">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li><li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis.">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L++NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo.">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li><li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells.">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li><li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting.">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-party+CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality.">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4+CD25+FoxP3++regulatory+T+cells.">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li><li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation.">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li><li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism.">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li><li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease.">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma.">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma:+an+interim+analysis.">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li><li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma:+A+Phase+I+Clinical+Trial.">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li><li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy.">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).</li></ol>

Hier tonen we een reproduceerbaar en haalbaar protocol om miljoenen kant-en-klare iNKT-cellen te verkrijgen. Vanwege het gebrek aan deze cellen in vivo, was een methode om ze uit te breiden hard nodig. Het protocol dat wij voorstellen vereist noch een bepaalde instrumentatie, noch een groot aantal muizen. We hebben iVα14-Jα18 transgene muizen met opzet gebruikt om het aantal muizen dat nodig is voor de procedure te verminderen.
Een ander succesvol protocol voor iNKT-celuitbreiding van iVα14...

Invariante Natural killer T-cellen (iNKT-cellen) zijn aangeboren T-lymfocyten die een semi-invariante αβ T-celreceptor (TCR) tot expressie brengen, gevormd in muizen door een invariante Vα14-Jα18-keten in combinatie met een beperkte set van diverse Vβ-ketens1, die specifiek is voor lipide-antigenen gepresenteerd door het MHC klasse I-gerelateerde molecuul CD1d2. iNKT-cellen ondergaan een agonistselectieprogramma dat resulteert in de verwerving van een geactiveerd / aangeboren effectorfenotype al in de thymus, dat optreedt door verschillende rijpingsstadia3,4, waardoor een CD4+ en een CD4- subset ontstaat. Via dit programma verwerven iNKT-cellen verschillende T-helper (TH)effectorfenotypen, namelijk TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) en TH17 (iNKT17), identificeerbaar door de expressie van de transcriptiefactoren T-bet, GATA3, PLZF en RORγt, respectievelijk5. iNKT-cellen herkennen een reeks microbiële lipiden, maar zijn ook zelfreactief tegen endogene lipiden die worden opgereguleerd in de context van pathologische situaties van celstress en weefselschade, zoals kanker en auto-immuniteit2. Na activering moduleren iNKT-cellen de functies van andere aangeboren en adaptieve immuuneffectorcellen via direct contact en cytokineproductie2.
Het onderzoek van iNKT-cellen is vergemakkelijkt door muismodellen, waaronder CD1d-deficiënte of Jα18-deficiënte muizen, en door de productie van antigeen-geladen CD1d-tetrameren plus de generatie van monoklonale antilichamen (mAbs) specifiek voor de menselijke semi-invariante TCR. Het genereren van primaire muis iNKT-cellijn is echter moeilijk gebleken. Om de antitumorfuncties van iNKT-cellen beter te karakteriseren en te gebruiken voor adoptieve celtherapie, hebben we een protocol opgezet om milt iNKT-cellen van iVα14-Jα18 transgene muizen (iVα14Tg)6te zuiveren en uit te breiden , waarbij iNKT-cellen 30 keer vaker voorkomen dan bij muizen van het wilde type.
Geëxpandeerde iNKT-cellen kunnen worden gebruikt voor in vitro testen en in vivo bij overdracht terug naar muizen. In deze setting hebben we bijvoorbeeld hun krachtige anti-tumor effecten aangetoond7. Bovendien zijn in vitro geëxpandeerde iNKT-cellen vatbaar voor functionele modificatie via genoverdracht of bewerking voorafgaand aan hun injectie in vivo8, waardoor inzichtelijke functionele analyse van moleculaire routes mogelijk is en de weg wordt vrijgemaakt voor geavanceerde celtherapieën.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115506</td>
			<td>clone 6D5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d-tetramer -PE</td>
			<td>NIH tetramer core facility</td>
			<td></td>
			<td>mouse PBS57-Cd1d-tetramers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 -PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100528</td>
			<td>clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocker</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0186L</td>
			<td>heat-inactivated and filtered .22 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Transcription factor staining buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2 (IAb) -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>114406</td>
			<td>clone AF6-120.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hrIL-2</td>
			<td>Chiron Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer (MB)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermWash</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>51-2091KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat Mouse IL-7</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>407-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; -APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109212</td>
			<td>clone H57-597</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;CD3CD28 mouse T activator Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11452D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies

Invariante Natural Killer T (iNKT) cellen zijn aangeboren T-lymfocyten die een geconserveerde semi-invariante T-celreceptor (TCR) tot expressie brengen die specifiek is voor zelf- of microbiële lipide-antigenen gepresenteerd door het niet-polymorfe MHC klasse I-gerelateerde molecuul CD1d. Preklinische en klinische studies ondersteunen een rol voor iNKT-cellen bij kanker, auto-immuniteit en infectieziekten. iNKT-cellen zijn zeer geconserveerd in alle soorten en hun onderzoek is vergemakkelijkt door muismodellen, waaronder CD1d-deficiënte of iNKT-deficiënte muizen, en de mogelijkheid om ze ondubbelzinnig te detecteren bij muizen en mannen met CD1d-tetrameren of mAbs specifiek voor de semi-invariante TCR. iNKT-cellen zijn echter zeldzaam en ze moeten worden uitgebreid om beheersbare aantallen te bereiken voor elke studie. Omdat het genereren van primaire muis iNKT-cellijn in vitro moeilijk is gebleken, hebben we een robuust protocol opgezet om milt iNKT-cellen van de iVα14-Jα18 transgene muizen (iVα14Tg) te zuiveren en uit te breiden, waarbij iNKT-cellen 30 keer vaker voorkomen. We laten hier zien dat primaire milt iVα14Tg iNKT-cellen kunnen worden verrijkt door middel van een immunomagnetisch scheidingsproces, wat ongeveer 95-98% pure iNKT-cellen oplevert. De gezuiverde iNKT-cellen worden gestimuleerd door anti-CD3/CD28 kralen plus IL-2 en IL-7, wat resulteert in een 30-voudige expansie op dag +14 van de cultuur met een zuiverheid van 85-99%. De uitgebreide iNKT-cellen kunnen gemakkelijk genetisch worden gemanipuleerd, wat een waardevol hulpmiddel is om mechanismen van activering te ontleden en in vitro te functioneren en, nog belangrijker, ook bij adoptieve overdracht in vivo.

Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, maakt het mogelijk om iNKT-cellen uit de milt van iVa14-Ja18 transgene muizen te verrijken via een immunomagnetisch scheidingsproces samengevat in figuur 1A. Totale milt T-cellen worden eerst negatief geselecteerd door B-cellen en monocyten uit te putten, gevolgd door iNKT-celpositieve immunomagnetische sortering met PBS-57 lipide-antigeen geladen CD1d-tetrameren, die het mogelijk maken om specifiek alleen iNKT-cellen te kleuren. Dit proto...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies at JoVE.com

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

We beschrijven een snel en robuust protocol om invariante natural killer T (iNKT) cellen uit muizen milt te verrijken en in vitro uit te breiden tot geschikte aantallen voor in vitro en in vivo studies.

Zuivering en uitbreiding van muisinvariante Natural Killer T-cellen voor in vitro en in vivo studies

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Dit protocol maakt de zuivering van INK T-cellen mogelijk, die zeer zeldzaam zijn, en maakt een 30-voudige uitbreiding in hun aantal mogelijk. De zuivering kan in één dag worden uitgevoerd en produceert in twee weken een groot aantal kant-en-klare INK T-cellen voor in vivo en in vitro studies. De procedure wordt gedemonstreerd door Gloria Delfanti, een post-doc in het lab.Nadat je de milt van de muis hebt ontleed, sla je hem door een celzeef van 70 nanometer om een eencellige suspensie te verkrijgen in 10 milliliter PBS met 2% FBS. Centrifugeer gedurende vijf minuten op 300 keer G. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel met één milliliter steriele ammoniumchloride kaliumlysinebuffer.Incubeer de cellen gedurende drie minuten bij kamertemperatuur en blok vervolgens met vijf milliliter PBS met 2% FBS. Centrifugeer gedurende vijf minuten op 300 keer G. Na het verwijderen van het supernatant, resuspend de celkorrel in drie milliliter PBS met 2% FBS en verwijder vetresten door pipetteren.Houd voor de verrijkingsstappen de cellen koud en gebruik oplossingen die vooraf zijn afgekoeld bij vier graden Celsius en vervolgens op ijs worden gehouden. Centrifugeer gedurende vijf minuten op 300 keer G. Resuspend alle cellen in de juiste hoeveelheid PBS met 2% FPS en Fc-blokker en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Was met één tot twee milliliter MACS-scheidingsbuffer per 10 miljoen cellen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 maal G. Na het verwijderen van het supernatant, kleur de cellen met CD19-FITC en H2-IAb-FITC en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij vier tot acht graden Celsius. Was cellen door één tot twee milliliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 maal G.Verwijder supernatant en resuspend de celkorrel in 90 microliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen. Voeg 10 microliter anti-FITC microbeads per 10 miljoen cellen toe. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij vier tot acht graden Celsius.Was de cellen door één tot twee milliliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 maal G. Verwijder het supernatant en resuspend tot 125 miljoen cellen in 500 microliter MACS-buffer. Plaats een LD-kolom in het magnetisch veld van de MACS-scheidings separator.Om verstopping te voorkomen, brengt u een voorscheidingsfilter aan op de LD-kolom en spoelt u deze af met twee milliliter MACS-buffer. Breng de celsuspensie aan op het filter en verzamel de niet-gelabelde cellen die door de kolom gaan. Was het lege kolomreservoir driemaal met één milliliter MACS-buffer.Verzamel het met T-cel verrijkte effluent en tel de cellen, waarbij 50 microliter overblijft voor FACS-analyse. Na het centrifugeren op 300 keer G gedurende vijf minuten, verwijder het supernatant en kleur de cellen met CD1d tetrameer-PE. Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten in het donker op ijs.Was de cellen door één tot twee milliliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen toe te voegen. Na centrifugeren op 300 maal G gedurende 10 minuten, verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de celkorrel in 80 microliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen. Voeg 20 microliter anti-PE microbeads per 10 miljoen cellen toe.Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij vier tot acht graden Celsius. Was cellen door één tot twee milliliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 maal G. Verwijder het supernatant en resuspend tot 100 miljoen cellen in 500 microliter MACS-buffer.Plaats volgens het celgetal de LS- of MS-kolom in het magnetisch veld van de MACS-separator en spoel de kolom met MACS-buffer. Breng de celsuspensie aan op de kolom, verzamel niet-gelabelde cellen die er doorheen gaan en was de kolom drie keer zoals eerder beschreven. Dit is de negatieve fractie.Verwijder de kolom uit het magnetisch veld en plaats deze op een nieuwe opvangbuis. Pipetteer MACS-buffer op de kolom en duw de meegeleverde zuiger in de kolom om de positieve fractie verrijkt met INK T-cellen weg te spoelen. Om het herstel van de INK T-cel verder te verhogen, centrifugeert u de negatieve fractie gedurende 10 minuten bij 300 maal G en herhaalt u de vorige stappen met een nieuwe LS- of MS-kolom.Trek de positieve fracties en bepaal het celgetal. Bewaar 50 microliter van zowel positieve als negatieve fracties voor FACS-analyse om de zuiverheid te controleren. Om INK T-cellen in een één-op-één-verhouding te activeren, brengt u het juiste volume anti-CD3- en CD28-magnetische kralen over naar een buis en met een gelijk volume PBS en vervolgens gedurende vijf seconden vortex.Plaats de buis gedurende één minuut op een magneet en gooi het supernatant weg. Verwijder de buis van de magneet en resuspend de gewassen magnetische kralen in het juiste volume RPMI. Centrifugeer gezuiverde INK T-cellen op 300 keer G gedurende vijf minuten en meng ze met muis T-activator anti-CD3 of CD28 magnetische kralen.Plaat één milliliter van de celsuspensie, anti-CD23 en CD28 magnetische kralen in een 48-well plaat met 20 eenheden per milliliter IL-2, dan incuberen bij 37 graden Celsius. Voeg na vijf dagen 10 nanogram per milliliter IL-7 toe. Splits de cellen in tweeën wanneer ze 80 tot 90% confluentie bereiken, waarbij altijd 20 eenheden per milliliter IL-2 en 10 nanogram per milliliter IL-7 worden toegevoegd.Onder deze omstandigheden kunnen INK T-cellen tot 15 dagen worden uitgebreid. Met behulp van dit protocol worden INK T-cellen verrijkt uit de milt van transgene muizen via een immunomagnetisch scheidingsproces. Na verrijking kunnen de cellen worden uitgebreid met anti-CD3- en CD28-kralen, wat resulteert in een 30-voudige expansie gemiddeld op dag 14 van de cultuur.De sterke activering met anti-CD3 en anti-CD kralen veroorzaakte de downregulatie van de IMK T-cel TCR expressie op het celoppervlak en een dubbele negatieve populatie verscheen. De meeste geëxpandeerde INK T-cellen zijn CD4-negatief. Karakterisering van de afstammingsspecifieke transcriptiefactoren PLZF en ROR gamma T maakte het mogelijk om de NKT1-, NKT2- en NKT17-fenotypen te identificeren op verrijkte INK T-cellen op dag nul en 14.De verrijkte INK T-cellen vertonen een T80-achtig effectorfenotype, dat na 14 dagen expansie wordt geconserveerd, zoals bevestigd door de secretie van zowel interferon gamma als IL-4 na PMA- en ionomycinestimulatie. Vergeet tijdens de zuiveringsstappen niet om snel te werken met voorgekoelde oplossingen en verwijder eventuele vetresten die tijdens het pipetteren kunnen worden gezien. Geëxpandeerde INK T-cellen kunnen worden gebruikt voor in vitro assays en in vivo overdrachten in muizen, zelfs na functionele modificaties via genoverdracht of bewerking.In vitro expansie van INK T-cellen overwint de beperking die wordt gegeven door de schaarste, waardoor ze exploiteerbaar zijn in preklinische studies op het gebied van tumorimmuunsurveillance, infectieziekten en auto-immuniteit.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Uitbreiding van de humane perifere bloed γδ T-cellen met behulp van zoledronaat

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Kunstmatige antigeen presenterende cel (AAPC) gemedieerde activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient<em&gt; In Vitro</em&gt; Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Afleiding van T cellen<em&gt; In Vitro</em&gt; Van muis embryonale stamcellen

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Een geoptimaliseerde werkwijze voor het isoleren en Expanding Invariant Natural Killer T-cellen van Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...