Name: purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies at JoVE.com

Wir danken Paolo Dellabona und Giulia Casorati für die wissenschaftliche Unterstützung und kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch der NIH Tetramer Core Facility für Maus-CD1d-Tetramer. Die Studie wurde durch das Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (an M.F.) und das Stipendium der Italian Association for Cancer Research (AIRC) 2019-22604 (an G.D.) finanziert.

Die hier beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Nr. 1048) am San Raffaele Scientific Institute überprüft und genehmigt.
HINWEIS: Alle Verfahren müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Alle verwendeten Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Milzverarbeitung
<ol><li>Euthanasierung von iVα14-Jα18-Mäusen durch Inhalation von CO2 gemäß der institutionell...

<ol>
	<li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+natural+killer+T+(NKT)+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1(-)CD4(+)+CD1d-dependent+precursor+stage.">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li><li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage.">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li><li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells.">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li><li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development.">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li><li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+CD40/Fas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression.">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy.">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells.">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li><li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo.">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li><li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis.">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L++NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo.">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li><li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells.">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li><li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting.">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-party+CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality.">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4+CD25+FoxP3++regulatory+T+cells.">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li><li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation.">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li><li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism.">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li><li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease.">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma.">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma:+an+interim+analysis.">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li><li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma:+A+Phase+I+Clinical+Trial.">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li><li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy.">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).</li></ol>

Hier zeigen wir ein reproduzierbares und praktikables Protokoll, um Millionen von gebrauchsfertigen iNKT-Zellen zu erhalten. Aufgrund des Mangels an diesen Zellen in vivo war eine Methode, um sie zu erweitern, dringend erforderlich. Das von uns vorgeschlagene Protokoll erfordert weder eine bestimmte Instrumentierung noch eine hohe Anzahl von Mäusen. Wir nutzten iVα14-Jα18 transgene Mäuse absichtlich, um die Anzahl der für das Verfahren benötigten Mäuse zu reduzieren.
Ein weiteres erfolg...

Invariante natürliche Killer-T-Zellen (iNKT-Zellen) sind angeborene T-Lymphozyten, die einen semi-invarianten αβ-T-Zellrezeptor (TCR) exprimieren, der in Mäusen durch eine invariante Vα14-Jα18-Kette gebildet wird, gepaart mit einem begrenzten Satz verschiedener Vβ-Ketten1, die spezifisch für Lipidantigene ist, die durch das MHC-Klasse-I-verwandte Molekül CD1d2präsentiert werden. iNKT-Zellen durchlaufen ein Agonisten-Selektionsprogramm, das zum Erwerb eines aktivierten/angeborenen Effektor-Phänotyps bereits im Thymus führt, der durch mehrere Reifestufen3,4auftrittundeine CD4+ und eine CD4- Untergruppe produziert. Durch dieses Programm erwerben iNKT-Zellen unterschiedliche T-Helfer (TH)-Effektor-Phänotypen, nämlich TH1 (iNKT1), TH2(iNKT2) und TH17 (iNKT17), die durch die Expression der Transkriptionsfaktoren T-bet, GATA3, PLZF und RORγt identifizierbar sind5. iNKT-Zellen erkennen eine Reihe von mikrobiellen Lipiden, sind aber auch selbstreaktiv gegen endogene Lipide, die im Kontext pathologischer Situationen von Zellstress und Gewebeschäden wie Krebs und Autoimmunität hochreguliert werden2. Nach der Aktivierung modulieren iNKT-Zellen die Funktionen anderer angeborener und adaptiver Immuneffektorzellen durch direkten Kontakt und Zytokinproduktion2.
Die Untersuchungen von iNKT-Zellen wurden durch Mausmodelle, einschließlich CD1d-defizienter oder Jα18-defizienter Mäuse, und durch die Produktion von antigenbeladenen CD1d-Tetrameren sowie die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) speziell für die menschliche semi-invariante TCR erleichtert. Die Erzeugung der primären Maus-iNKT-Zelllinie hat sich jedoch als schwierig erwiesen. Um die Antitumorfunktionen von iNKT-Zellen besser zu charakterisieren und für die adoptive Zelltherapie zu nutzen, haben wir ein Protokoll zur Reinigung und Erweiterung von Milz-iNKT-Zellen von iVα14-Jα18 transgenen Mäusen (iVα14Tg)6eingerichtet, bei denen iNKT-Zellen 30-mal häufiger vorkommen als bei Wildtyp-Mäusen.
Expandierte iNKT-Zellen können für In-vitro-Assays und in vivo bei der Rückübertragung in Mäuse genutzt werden. In diesem Setting haben wir zum Beispiel ihre potenten Anti-Tumor-Effekte gezeigt7. Darüber hinaus sind in vitro expandierte iNKT-Zellen für eine funktionelle Modifikation durch Gentransfer oder Editierung vor ihrer Injektion in vivo8zugänglich, was eine aufschlussreiche funktionelle Analyse molekularer Signalwege ermöglicht und den Weg für fortschrittliche Zelltherapien ebnet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115506</td>
			<td>clone 6D5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d-tetramer -PE</td>
			<td>NIH tetramer core facility</td>
			<td></td>
			<td>mouse PBS57-Cd1d-tetramers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 -PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100528</td>
			<td>clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocker</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0186L</td>
			<td>heat-inactivated and filtered .22 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Transcription factor staining buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2 (IAb) -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>114406</td>
			<td>clone AF6-120.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hrIL-2</td>
			<td>Chiron Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer (MB)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermWash</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>51-2091KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat Mouse IL-7</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>407-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; -APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109212</td>
			<td>clone H57-597</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;CD3CD28 mouse T activator Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11452D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies

Invariante Natural Killer T (iNKT)-Zellen sind angeborene T-Lymphozyten, die einen konservierten semi-invarianten T-Zellrezeptor (TCR) exprimieren, der spezifisch für selbst- oder mikrobielle Lipidantigene ist, die durch das nicht-polymorphe MHC-Klasse-I-bezogene Molekül CD1d präsentiert werden. iNKT-Zellen sind in allen Spezies sehr konserviert und ihre Untersuchung wurde durch Mausmodelle erleichtert, einschließlich CD1d-defizienter oder iNKT-defizienter Mäuse, und die Möglichkeit, sie eindeutig in Mäusen und Männern mit CD1d-Tetrameren oder mAbs nachzuweisen, die für die semi-invariante TCR spezifisch sind. iNKT-Zellen sind jedoch selten und müssen erweitert werden, um für jede Studie überschaubare Zahlen zu erreichen. Da sich die Erzeugung primärer Maus-iNKT-Zelllinien in vitro als schwierig erwiesen hat, haben wir ein robustes Protokoll zur Reinigung und Erweiterung von Milz-iNKT-Zellen aus den transgenen iVα14-Jα18-Mäusen (iVα14Tg) eingerichtet, in denen iNKT-Zellen 30-mal häufiger vorkommen. Wir zeigen hier, dass primäre milzhaltige iVα14Tg iNKT-Zellen durch einen immunmagnetischen Trennprozess angereichert werden können, was zu etwa 95-98% reinen iNKT-Zellen führt. Die gereinigten iNKT-Zellen werden durch Anti-CD3/CD28-Kügelchen plus IL-2 und IL-7 stimuliert, was zu einer 30-fachen Ausdehnung pro Tag +14 der Kultur mit 85-99% Reinheit führt. Die expandierten iNKT-Zellen können leicht genetisch manipuliert werden und bieten ein unschätzbares Werkzeug, um Mechanismen der Aktivierung und Funktion in vitro und vor allem auch beim adoptiven Transfer in vivo zu sezieren.

Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll ermöglicht es, iNKT-Zellen aus der Milz transgener iVa14-Ja18-Mäuse durch einen immunmagnetischen Trennprozess anzureichern, der in Abbildung 1Azusammengefasst ist. Gesamtmilz-T-Zellen werden zunächst negativ selektiert, indem B-Zellen und Monozyten erschöpft werden, gefolgt von einer iNKT-Zell-positiven immunmagnetischen Sortierung mit PBS-57-Lipidantigen-beladenen CD1d-Tetrameren, die es ermöglichen, nur iNKT-Zellen spezifisch zu färben...

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Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Wir beschreiben ein schnelles und robustes Protokoll, um invariante natürliche Killer-T-Zellen (iNKT) aus Mausmilz anzureichern und sie in vitro auf geeignete Zahlen für In-vitro- und In-vivo-Studien zu erweitern.

Aufreinigung und Expansion von mausinvarianten natürlichen Killer-T-Zellen für in vitro und in vivo Studien

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Reinigung von INK-T-Zellen, die sehr selten sind, und ermöglicht eine 30-fache Ausdehnung ihrer Anzahl. Die Reinigung kann an einem Tag durchgeführt werden und produziert in zwei Wochen eine große Anzahl von gebrauchsfertigen INK-T-Zellen für In-vivo- und In-vitro-Studien. Das Verfahren wird Gloria Delfanti, eine Postdoktorandin im Labor, demonstrieren.Nachdem Sie die Milz der Maus seziert haben, zerschlagen Sie sie durch ein 70-Nanometer-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension in 10 Milliliter PBS mit 2% FBS zu erhalten. Zentrifugiere bei 300 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit einem Milliliter sterilem Ammoniumchlorid-Kaliumlysinpuffer.Inkubieren Sie die Zellen für drei Minuten bei Raumtemperatur und blockieren Sie sie dann mit fünf Millilitern PBS mit 2% FBS. Zentrifugiere bei 300 mal G für fünf Minuten. Nach dem Entfernen des Überstandes das Zellpellet in drei Milliliter PBS mit 2% FBS resuspendieren und Fettrückstände durch Pipettieren entfernen.Halten Sie die Zellen für die Anreicherungsschritte kalt und verwenden Sie Lösungen, die bei vier Grad Celsius vorgekühlt und dann auf Eis gehalten werden. Zentrifugiere bei 300 mal G für fünf Minuten. Alle Zellen in der entsprechenden Menge PBS mit 2% FPS und Fc-Blocker resuspendieren und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Mit ein bis zwei Millilitern MACS-Trennpuffer pro 10 Millionen Zellen waschen und bei 300 mal G für 10 Minuten zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstandes färben Sie die Zellen mit CD19-FITC und H2-IAb-FITC und inkubieren Sie 15 Minuten im Dunkeln bei vier bis acht Grad Celsius. Waschen Sie Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen und zentrifugieren Sie bei 300 mal G für 10 Minuten.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 90 Mikroliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen. Fügen Sie 10 Mikroliter Anti-FITC-Mikrokügelchen pro 10 Millionen Zellen hinzu. Gut mischen und 15 Minuten im Dunkeln bei vier bis acht Grad Celsius inkubieren.Waschen Sie die Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen und 10 Minuten lang bei 300 mal G zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie bis zu 125 Millionen Zellen in 500 Mikroliter MACS-Puffer. Platzieren Sie eine LD-Säule im Magnetfeld des MACS-Separators.Um Verstopfungen zu vermeiden, tragen Sie einen Vorzerlegungsfilter auf die LD-Säule auf und spülen Sie sie mit zwei Millilitern MACS-Puffer ab. Tragen Sie die Zellsuspension auf den Filter auf und sammeln Sie die unbeschrifteten Zellen, die die Spalte passieren. Waschen Sie den leeren Säulenbehälter dreimal mit einem Milliliter MACS-Puffer.Sammeln Sie das mit T-Zellen angereicherte Abwasser und zählen Sie die Zellen, wobei Sie 50 Mikroliter für die FACS-Analyse aufbewahren. Nach dem Zentrifugieren bei 300 mal G für fünf Minuten den Überstand entfernen und die Zellen mit CD1d Tetramer-PE färben. Gut mischen und 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.Waschen Sie die Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen. Nach der Zentrifugation bei 300 mal G für 10 Minuten den Überstand entfernen und das Zellpellet in 80 Mikroliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen resuspendieren. Fügen Sie 20 Mikroliter Anti-PE-Mikrokügelchen pro 10 Millionen Zellen hinzu.Gut mischen und 15 Minuten im Dunkeln bei vier bis acht Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen und zentrifugieren Sie bei 300 mal G für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie bis zu 100 Millionen Zellen in 500 Mikroliter MACS-Puffer.Platzieren Sie je nach Zellzahl die LS- oder MS-Säule im Magnetfeld des MACS-Separators und spülen Sie die Säule mit MACS-Puffer ab. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf, sammeln Sie unbeschriftete Zellen, die passieren, und waschen Sie die Spalte dreimal wie zuvor beschrieben. Dies ist der negative Bruch.Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und legen Sie sie auf ein neues Auffangrohr. Den MACS-Puffer auf die Säule pipettieren und den mitgelieferten Kolben in die Säule drücken, um die mit INK-T-Zellen angereicherte positive Fraktion auszuspülen. Um die Ink-T-Zell-Wiederherstellung weiter zu erhöhen, zentrifugieren Sie die negative Fraktion bei 300 mal G für 10 Minuten und wiederholen Sie die vorherigen Schritte mit einer neuen LS- oder MS-Säule.Ziehen Sie die positiven Fraktionen und bestimmen Sie die Zellzahl. Bewahren Sie 50 Mikroliter positiver und negativer Fraktionen für die FACS-Analyse auf, um die Reinheit zu überprüfen. Um INK-T-Zellen in einem Verhältnis von eins zu eins zu aktivieren, übertragen Sie das entsprechende Volumen an Anti-CD3- und CD28-Magnetperlen in eine Röhre und mit einem gleichen Volumen pbS, dann wirbeln Sie für fünf Sekunden.Legen Sie das Rohr für eine Minute auf einen Magneten und entsorgen Sie den Überstand. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten und befestigen Sie die gewaschenen Magnetperlen im richtigen Volumen von RPMI. Zentrifugieren Sie gereinigte INK-T-Zellen bei 300 mal G für fünf Minuten und mischen Sie sie mit Maus-T-Aktivator Anti-CD3 oder CD28 Magnetperlen.Einen Milliliter der Zellsuspension, Anti-CD23- und CD28-Magnetperlen in einer 48-Well-Platte mit 20 Einheiten pro Milliliter IL-2 plattieren, dann bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach fünf Tagen 10 Nanogramm pro Milliliter IL-7 hinzufügen. Teilen Sie die Zellen in zwei Hälften, wenn sie 80 bis 90% Konfluenz erreichen, und fügen Sie immer 20 Einheiten pro Milliliter IL-2 und 10 Nanogramm pro Milliliter IL-7 hinzu.Unter diesen Bedingungen können INK-T-Zellen bis zu 15 Tage lang expandiert werden. Mit diesem Protokoll werden INK-T-Zellen durch einen immunmagnetischen Trennprozess aus der Milz transgener Mäuse angereichert. Nach der Anreicherung können die Zellen mit Anti-CD3- und CD28-Kügelchen erweitert werden, was zu einer 30-fachen Ausdehnung im Durchschnitt bis zum 14. Tag der Kultur führt.Die starke Aktivierung mit Anti-CD3- und Anti-CD-Kügelchen induzierte die Herunterregulierung der IMK-T-Zell-TCR-Expression auf der Zelloberfläche und eine doppelt negative Population trat auf. Die Mehrheit der expandierten INK-T-Zellen ist CD4-negativ. Die Charakterisierung der linienspezifischen Transkriptionsfaktoren PLZF und ROR gamma T ermöglichte es, die Phänotypen NKT1, NKT2 und NKT17 auf angereicherten INK-T-Zellen am Tag Null und 14 zu identifizieren.Die angereicherten INK-T-Zellen zeigen einen T80-ähnlichen Effektor-Phänotyp, der nach 14 Tagen der Expansion konserviert wird, wie durch die Sekretion von Interferon gamma und IL-4 nach PMA- und Ionomycin-Stimulation bestätigt wird. Denken Sie während der Reinigungsschritte daran, schnell mit vorgekühlten Lösungen zu arbeiten und Fettrückstände zu entfernen, die beim Pipettieren auftreten können. Erweiterte INK-T-Zellen können für In-vitro-Assays und In-vivo-Transfers in Mäuse genutzt werden, auch nach funktionellen Modifikationen durch Gentransfer oder Editing.Die In-vitro-Expansion von INK-T-Zellen überwindet die durch den Mangel gegebene Einschränkung und macht sie in präklinischen Studien in den Bereichen Tumorimmunüberwachung, Infektionskrankheiten und Autoimmunität nutzbar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Ableitung von T-Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Aus embryonalen Stammzellen der Maus

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...