Name: purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00
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Ringraziamo Paolo Dellabona e Giulia Casorati per il supporto scientifico e la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche il NIH Tetramer Core Facility per il tetramero CD1d del topo. Lo studio è stato finanziato dalla Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (a M.F.) e dalla borsa di studio 2019-22604 dell'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) (a G.D.).

Le procedure qui descritte sono state esaminate e approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) (n. 1048) dell'Istituto Scientifico San Raffaele.
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili. Tutti i reagenti utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Lavorazione della milza
<ol><li>Eutanasia dei topi iVα14-Jα18 per inalazione di CO2 secondo la politica istituzion...

<ol>
	<li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+natural+killer+T+(NKT)+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1(-)CD4(+)+CD1d-dependent+precursor+stage.">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li><li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage.">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li><li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells.">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li><li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development.">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li><li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+CD40/Fas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression.">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy.">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells.">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li><li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo.">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li><li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis.">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L++NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo.">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li><li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells.">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li><li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting.">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-party+CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality.">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4+CD25+FoxP3++regulatory+T+cells.">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li><li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation.">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li><li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism.">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li><li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease.">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma.">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma:+an+interim+analysis.">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li><li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma:+A+Phase+I+Clinical+Trial.">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li><li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy.">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).</li></ol>

Qui mostriamo un protocollo riproducibile e fattibile per ottenere milioni di celle iNKT pronte all'uso. A causa della scarsità di queste cellule in vivo, era altamente necessario un metodo per espanderle. Il protocollo che proponiamo non richiede né una particolare strumentazione né un elevato numero di topi. Abbiamo sfruttato i topi transgenici iVα14-Jα18 di proposito per ridurre il numero di topi necessari per la procedura.
Un altro protocollo di successo per l'espansione cellulare iNK...

Le cellule T natural killer invarianti (cellule iNKT) sono linfociti T innati che esprimono un recettore semi-invariante delle cellule T αβ (TCR), formato nei topi da una catena Vα14-Jα18 invariante accoppiata con un insieme limitato di diverse catene Vβ1, che è specifico per gli antigeni lipidici presentati dalla molecola correlata alla classe I MHC CD1d2. Le cellule iNKT subiscono un programma di selezione agonista con conseguente acquisizione di un fenotipo effettore attivato/innato già presente nel timo, che avviene attraverso diversi stadi di maturazione3,4,producendo un sottoinsieme CD4+ ecd4- sottoinsieme. Attraverso questo programma, le cellule iNKT acquisiscono fenotipi effettrici T helper (TH) distinti, vale a dire TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) e TH17 (iNKT17), identificabili dall'espressione dei fattori di trascrizione T-bet, GATA3, PLZF e RORγt, rispettivamente5. Le cellule iNKT riconoscono una serie di lipidi microbici ma sono anche autoreattive nei confronti dei lipidi endogeni che sono sovraregolati nel contesto di situazioni patologiche di stress cellulare e danno tissutale, come il cancro e l'autoimmunità2. Al momento dell'attivazione, le cellule iNKT modulano le funzioni di altre cellule effettrici immunitarie innate e adattative attraverso il contatto diretto e la produzione di citochine2.
Le indagini sulle cellule iNKT sono state facilitate da modelli murini, tra cui topi cd1d-deficienti o Jα18-carenti, e dalla produzione di tetrameri CD1d caricati con antigene più la generazione di anticorpi monoclonali (mAbs) specifici per il TCR semi-invariante umano. Tuttavia, la generazione della linea cellulare iNKT del topo primario si è dimostrata difficile. Per caratterizzare meglio le funzioni antitumorali delle cellule iNKT e utilizzarle per la terapia cellulare adottiva, abbiamo istituito un protocollo per purificare ed espandere le cellule iNKT spleniche di topi transgenici iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, in cui le cellule iNKT sono 30 volte più frequenti rispetto ai topi wild type.
Le cellule iNKT espanse possono essere sfruttate per saggi in vitro e in vivo al momento del trasferimento nei topi. In questo contesto, ad esempio, abbiamo mostrato i loro potenti effettiantitumorali 7. Inoltre, le cellule iNKT espanse in vitro sono suscettibili di modificazione funzionale tramite trasferimento genico o modifica prima della loro iniezione in vivo8, consentendo un'analisi funzionale approfondita dei percorsi molecolari, oltre a spianare la strada a terapie cellulari avanzate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115506</td>
			<td>clone 6D5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d-tetramer -PE</td>
			<td>NIH tetramer core facility</td>
			<td></td>
			<td>mouse PBS57-Cd1d-tetramers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 -PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100528</td>
			<td>clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocker</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0186L</td>
			<td>heat-inactivated and filtered .22 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Transcription factor staining buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2 (IAb) -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>114406</td>
			<td>clone AF6-120.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hrIL-2</td>
			<td>Chiron Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer (MB)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermWash</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>51-2091KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat Mouse IL-7</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>407-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; -APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109212</td>
			<td>clone H57-597</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;CD3CD28 mouse T activator Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11452D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies

Le cellule Invariant Natural Killer T (iNKT) sono linfociti T innata che esprimono un recettore delle cellule T semi-invariante (TCR) conservato specifico per antigeni lipidici auto o microbici presentati dalla molecola non polimorfica MHC di classe I CD1d. Studi preclinici e clinici supportano un ruolo delle cellule iNKT nel cancro, nell'autoimmunità e nelle malattie infettive. Le cellule iNKT sono molto conservate in tutte le specie e la loro indagine è stata facilitata da modelli murini, tra cui topi cd1d-carenti o iNKT-carenti, e la possibilità di rilevarle inequivocabilmente in topi e uomini con tetrameri CD1d o mAbs specifici per il TCR semi-invariante. Tuttavia, le cellule iNKT sono rare e devono essere espanse per raggiungere numeri gestibili per qualsiasi studio. Poiché la generazione della linea cellulare iNKT di topo primario in vitro si è dimostrata difficile, abbiamo istituito un protocollo robusto per purificare ed espandere le cellule iNKT spleniche dai topi transgenici iVα14-Jα18 (iVα14Tg), in cui le cellule iNKT sono 30 volte più frequenti. Mostriamo qui che le cellule iNKT iVα14Tg miliniche primarie possono essere arricchite attraverso un processo di separazione immunomagnetica, producendo circa il 95-98% di cellule iNKT pure. Le cellule iNKT purificate sono stimolate da perline anti-CD3 / CD28 più IL-2 e IL-7, con conseguente espansione di 30 volte al giorno +14 della coltura con purezza dell'85-99%. Le cellule iNKT espanse possono essere facilmente manipolate geneticamente, fornendo uno strumento inestimabile per sezionare i meccanismi di attivazione e funzione in vitro e, soprattutto, anche dopo il trasferimento adottivo in vivo.

Il protocollo descritto in questo manoscritto consente di arricchire le cellule iNKT dalla milza di topi transgenici iVa14-Ja18 attraverso un processo di separazione immunomagnetica riassunto in Figura 1A. Le cellule T della milza totale vengono prima selezionate negativamente esaurendo le cellule B e i monociti, seguite dallo smistamento immunomagnetico positivo delle cellule iNKT con tetrameri CD1d caricati con antigene lipidico PBS-57, che consentono di colorare specificamente solo le cel...

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Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Descriviamo un protocollo rapido e robusto per arricchire le cellule T natural killer invarianti (iNKT) dalla milza di topo ed espanderle in vitro a numeri adatti per studi in vitro e in vivo.

Purificazione ed espansione di cellule T Natural Killer invarianti di topo per studi in vitro e in vivo

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Questo protocollo consente la purificazione delle cellule T INK, che sono molto rare, e consente un'espansione di 30 volte nel loro numero. La purificazione può essere eseguita in un giorno e produrre un gran numero di cellule T INK pronte all'uso per studi in vivo e in vitro in due settimane. A dimostrare la procedura sarà Gloria Delfanti, post-doc in laboratorio.Dopo aver sezionato la milza di topo, romperla attraverso un filtro a celle da 70 nanometri per ottenere una sospensione a singola cellula in 10 millilitri di PBS con il 2% di FBS. Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con un millilitro di tampone sterile di cloruro di ammonio potassio lisina.Incubare le cellule per tre minuti a temperatura ambiente, quindi bloccare con cinque millilitri di PBS con il 2% di FBS. Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospese il pellet cellulare in tre millilitri di PBS con 2% FBS e rimuovere i residui di grasso mediante pipettaggio.Per le fasi di arricchimento, mantenere le celle fredde e utilizzare soluzioni pre-raffreddate a quattro gradi Celsius e quindi mantenute sul ghiaccio. Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Sospendere tutte le cellule nella quantità appropriata di PBS con bloccante 2% FPS e Fc e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Lavare con uno o due millilitri di tampone di separazione MACS per 10 milioni di celle e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, colorare le cellule con CD19-FITC e H2-IAb-FITC e incubare per 15 minuti al buio a quattro-otto gradi Celsius. Lavare le celle aggiungendo uno o due millilitri di tampone MACS per 10 milioni di celle e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti.Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare in 90 microlitri di tampone MACS per 10 milioni di cellule. Aggiungere 10 microlitri di microsfere anti-FITC per 10 milioni di cellule. Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a quattro-otto gradi Celsius.Lavare le cellule aggiungendo uno o due millilitri di tampone MACS per 10 milioni di cellule e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere fino a 125 milioni di cellule in 500 microlitri di buffer MACS. Posizionare una colonna LD nel campo magnetico del separatore MACS.Per evitare intasamenti, applicare un filtro di pre-separazione sulla colonna LD e risciacquarla con due millilitri di buffer MACS. Applicare la sospensione cellulare sul filtro e raccogliere le celle senza etichetta che passano attraverso la colonna. Lavare il serbatoio della colonna vuoto tre volte con un millilitro di buffer MACS.Raccogliere l'effluente arricchito con cellule T e contare le cellule, mantenendo 50 microlitri per l'analisi FACS. Dopo aver centrifugato a 300 volte G per cinque minuti, rimuovere il surnatante e macchiare le cellule con CD1d tetramer-PE. Mescolare bene e incubare per 30 minuti al buio sul ghiaccio.Lavare le celle aggiungendo da uno a due millilitri di buffer MACS per 10 milioni di celle. Dopo la centrifugazione a 300 volte G per 10 minuti, rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare in 80 microlitri di tampone MACS per 10 milioni di cellule. Aggiungere 20 microlitri di microsfere anti-PE per 10 milioni di cellule.Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a quattro-otto gradi Celsius. Lavare le celle aggiungendo uno o due millilitri di tampone MACS per 10 milioni di celle e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere fino a 100 milioni di cellule in 500 microlitri di buffer MACS.In base al conteggio delle celle, posizionare la colonna LS o MS nel campo magnetico del separatore MACS e risciacquare la colonna con il buffer MACS. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna, raccogliere le celle senza etichetta che passano attraverso e lavare la colonna tre volte come descritto in precedenza. Questa è la frazione negativa.Rimuovere la colonna dal campo magnetico e posizionarla su un nuovo tubo di raccolta. Pipettare il buffer MACS sulla colonna e spingere lo stantuffo fornito nella colonna per scovare la frazione positiva arricchita in celle T INK. Per aumentare ulteriormente il recupero delle cellule T INK, centrifugare la frazione negativa a 300 volte G per 10 minuti e ripetere i passaggi precedenti con una nuova colonna LS o MS.Tirare le frazioni positive e determinare il conteggio delle cellule. Conservare 50 microlitri di frazioni sia positive che negative per l'analisi FACS per verificarne la purezza. Per attivare le cellule T INK con un rapporto uno-a-uno, trasferire il volume appropriato di perline magnetiche anti-CD3 e CD28 su un tubo e ad un volume uguale di PBS, quindi vortice per cinque secondi.Posizionare il tubo su un magnete per un minuto ed eliminare il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e risospescere le perle magnetiche lavate nel giusto volume di RPMI. Centrifugare le cellule T INK purificate a 300 volte G per cinque minuti e mescolarle con perline magnetiche anti-CD3 o CD28 dell'attivatore T del mouse.Piastra un millilitro della sospensione cellulare, perline magnetiche anti-CD23 e CD28 in una piastra a 48 pozzetti con 20 unità per millilitro IL-2, quindi incubare a 37 gradi Celsius. Dopo cinque giorni, aggiungere 10 nanogrammi per millilitro IL-7. Dividere le cellule a metà quando raggiungono l'80-90% di confluenza, aggiungendo sempre 20 unità per millilitro IL-2 e 10 nanogrammi per millilitro IL-7.In queste condizioni, le cellule T INK possono essere espanse fino a 15 giorni. Utilizzando questo protocollo, le cellule T INK sono arricchite dalla milza di topi transgenici attraverso un processo di separazione immunomagnetica. Dopo l'arricchimento, le cellule possono essere espanse con perline anti-CD3 e CD28, con conseguente espansione di 30 volte in media entro il giorno 14 della coltura.La forte attivazione con perline anti-CD3 e anti-CD ha indotto la downregulation dell'espressione del TCR delle cellule T IMK sulla superficie cellulare ed è apparsa una doppia popolazione negativa. La maggior parte delle cellule T INK espanse sono CD4 negative. La caratterizzazione dei fattori di trascrizione specifici del lignaggio PLZF e ROR gamma T ha permesso di identificare i fenotipi NKT1, NKT2 e NKT17 su cellule T INK arricchite al giorno zero e 14.Le cellule T INK arricchite mostrano un fenotipo effettore simile a T80, che viene conservato dopo 14 giorni di espansione come confermato dalla secrezione di interferone gamma e IL-4 dopo stimolazione di PMA e ionomicina. Durante le fasi di purificazione, ricordarsi di lavorare velocemente con soluzioni pre-raffreddate e di eliminare eventuali residui di grasso che possono essere visti durante il pipettaggio. Le cellule T INK espanse possono essere sfruttate per saggi in vitro e trasferimenti in vivo nei topi, anche dopo modifiche funzionali tramite trasferimento genico o modifica.L'espansione in vitro delle cellule T INK supera il limite dato dalla scarsità, rendendole sfruttabili in studi preclinici nei campi della sorveglianza immunitaria tumorale, delle malattie infettive e dell'autoimmunità.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

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Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

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Killer artificiale cellule presentanti l&#39;antigene (KaAPC) per una efficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

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Derivazione di cellule T<em&gt; In Vitro</em&gt; Da cellule staminali embrionali di topo

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

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Un metodo ottimizzato per l&#39;isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...