Name: purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00
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우리는 파올로 델라보나와 줄리아 카소라티에게 과학적 지원과 원고의 비판적 독서에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 CD1d 테트라머에 대한 NIH 테트라머 코어 시설에 감사드립니다. 이 연구는 폰다지오네 카리플로 그랜트 2018-0366 (M.F.) 및 이탈리아 암 연구 협회 (AIRC) 펠로우십 2019-22604 (G.D.에)에 의해 투자되었습니다.

여기에 설명 된 절차는 검토 및 샌 라파엘과학 연구소에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (No. 1048)에 의해 승인되었다.
참고: 모든 절차는 멸균 조건에서 수행해야 합니다. 사용되는 모든 시약은 재료 표에나열됩니다.
1. 비장 가공
<ol><li>기관 정책에 따라 CO2의 흡입에 의한 iVα14-Jα18 마우스의 안락사. 참고: iVα14-Jα18 마우스는...

<ol>
	<li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+natural+killer+T+(NKT)+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1(-)CD4(+)+CD1d-dependent+precursor+stage.">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li><li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage.">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li><li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells.">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li><li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development.">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li><li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+CD40/Fas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression.">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy.">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells.">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li><li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo.">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li><li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis.">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L++NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo.">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li><li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells.">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li><li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting.">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-party+CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality.">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4+CD25+FoxP3++regulatory+T+cells.">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li><li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation.">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li><li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism.">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li><li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease.">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma.">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma:+an+interim+analysis.">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li><li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma:+A+Phase+I+Clinical+Trial.">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li><li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy.">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).</li></ol>

여기에서 우리는 수백만 개의 즉시 사용할 수 있는 iNKT 셀을 얻기 위해 재현 가능하고 실행 가능한 프로토콜을 보여줍니다. 생체 내에서 이러한 세포의 빈약성으로 인해 이를 확장하는 방법이 매우 필요했습니다. 우리가 제안하는 프로토콜은 특정 계측이나 많은 수의 마우스를 필요로하지 않습니다. 당사는 절차에 필요한 마우스의 수를 줄이기 위해 iVα14-Jα18 형질전환 마우스를 의도적으로 이용?...

불변성 천연 킬러 T 세포(iNKT 세포)는 반불변성 αβ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 선천성 T 림프구체로, 비정체 Vα14-Jα18 사슬에 의해 마우스에서 형성된 다양한 Vβ 사슬1의한정된 세트와 결합되어 MHC 급 I-관련 분자CD1 CD에의해 제시된 지질 항원특이이다. iNKT 세포는 여러 성숙 단계3,4를통해 발생하는 흉선에서 이미 활성화 / 타고난 이펙터 표현형을 획득하는 결과 고뇌선별 프로그램을 거치며 CD4+ 및 CD4- 하위 세트를 생성합니다. 이 프로그램을 통해 iNKT 세포는 T-bet, GATA3, PLZF 및 RORγt의 발현에 의해 식별 가능한T-H(iNKT1),TH2(iNKT2) 및 TH17(iNKT17)과 같은 T 조머(TH)이펙터 표현형을 획득한다. iNKT 세포는 다양한 미생물 지질을 인식하지만 암 및 자가 면역2와같은 세포 스트레스 및 조직 손상의 병리학적 상황의 맥락에서 조절되는 내인성 지질에 대해 자가 반응성이다. 활성화시, iNKT 세포는 직접 접촉 및 사이토카인 생성2를통해 다른 선천적이고 적응형 면역 이펙터 세포의 기능을 조절한다.
iNKT 세포의 조사는 CD1d-결핍 또는 Jα18-결핍 마우스를 포함하는 마우스 모델, 및 항원적 로드 CD1d 테트라머의 생산에 의해 촉진되었으며, 인간 반투명 TCR에 특이적인 단일 클론 항체(mAbs)의 생성에 의해 촉진되었다. 그러나, 1차 마우스 iNKT 세포주의 생성은 어렵다는 것을 입증했습니다. iNKT 세포의 항종양 기능을 보다 잘 특성화하고 입양 세포 치료에 활용하기 위해 iVα14-Jα18 트랜스제닉 마우스(iVα14Tg)6의비장 iNKT 세포를 정화하고 확장하는 프로토콜을 설정하여 iNKT 세포가 야생형 마우스보다 30배 더 빈번합니다.
확장된 iNKT 세포는 시험관 내 분석, 그리고 생쥐로 다시 옮겨질 때 생체 내에서 악용될 수 있다. 이 설정에서, 예를 들어, 우리는 그들의 강력한 항 종양 효과 보여 주었다7. 더욱이, 시험관 내 확장된 iNKT 세포는 생체 내에서 그들의 주입 전에 유전자 전달 또는 편집을 통해 기능적 변형을 가능하게하며,분자 통로의 통찰력 있는 기능적 분석을 허용하고, 또한 진보된 세포 치료를 위한 길을 포장할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115506</td>
			<td>clone 6D5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d-tetramer -PE</td>
			<td>NIH tetramer core facility</td>
			<td></td>
			<td>mouse PBS57-Cd1d-tetramers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 -PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100528</td>
			<td>clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocker</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0186L</td>
			<td>heat-inactivated and filtered .22 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Transcription factor staining buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2 (IAb) -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>114406</td>
			<td>clone AF6-120.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hrIL-2</td>
			<td>Chiron Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer (MB)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermWash</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>51-2091KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat Mouse IL-7</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>407-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; -APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109212</td>
			<td>clone H57-597</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;CD3CD28 mouse T activator Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11452D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies

불변성 천연 킬러 T(iNKT) 세포는 비다형성 MHC 급 I 관련 분자 CD1d.전임상 및 임상 연구에서 암, 자가면역 및 감염성 질환에서 iNKT 세포에 대한 역할을 지원하는 자체 또는 미생물 지질 항원에 특이적인 반불변성 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 선천성 T 림프구체이다. iNKT 세포는 종 전체에 걸쳐 매우 보존되고 그들의 조사는 CD1d 결핍 또는 iNKT 결핍 마우스를 포함하여 마우스 모델에 의해 촉진되고, 반 불변 TCR에 특이적인 CD1d 테트라머 또는 mAbs를 가진 마우스와 남자에서 명백하게 검출할 가능성. 그러나 iNKT 세포는 드물며 모든 연구를 위해 관리 가능한 숫자에 도달하기 위해 확장되어야 합니다. 시험관 내의 1차 마우스 iNKT 세포주의 생성이 어렵다는 것이 입증되어 왔으니, iVα14-Jα18 트랜스제닉 마우스(iVα14Tg)로부터 비장 iNKT 세포를 정화하고 확장하기 위한 견고한 프로토콜을 설정하여 iNKT 세포가 30배 더 빈번하다. 우리는 여기에서 1 차적인 비장 iVα14Tg iNKT 세포가 면역자기 분리 과정을 통해 풍부해질 수 있다는 것을, 대략 95-98% 순수한 iNKT 세포를 산출한다는 것을 여기에서 보여줍니다. 정제된 iNKT 세포는 안티 CD3/CD28 구슬플러스 IL-2 및 IL-7에 의해 자극되며, 85-99%의 순도로 배양의 날 +14까지 30배 확장됩니다. 확장된 iNKT 세포는 쉽게 유전적으로 조작될 수 있으며, 생체 외에서 활성화 및 기능 메커니즘을 해부하고, 더 중요한 것은 생체 내에서의 입양 전달시에도 귀중한 도구를 제공합니다.

본 원고에 기재된 프로토콜은 도 1A에요약된 면역자기 분리 과정을 통해 iVa14-Ja18 형질성 마우스의 비장으로부터 iNKT 세포를 풍부하게 할 수 있다. 총 비장 T 세포는 먼저 B 세포와 단세포를 고갈하여 부정적으로 선택되고, PBS-57 지질 항원로드 CD1d 테트라머를 사용하여 iNKT 세포 양성 면역자기 분류를 통해 iNKT 세포만 구체적으로 염색할 수 있게 된다. 이 프로토콜은 단일 iVa14-Ja...

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Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

우리는 마우스 비장에서 불변 자연 킬러 T (iNKT) 세포를 풍부하게하고 체외 및 생체 내 연구에 적합한 숫자로 시험관 내에서 확장하기 위해 신속하고 강력한 프로토콜을 설명합니다.

체외 및 생체 내 연구를 위한 마우스 불변 천연 킬러 T 세포의 정화 및 확장

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

이 프로토콜은 매우 드문 INK T 세포의 정화를 가능하게하고, 그들의 수에 30 배 확장을 허용한다. 정제는 하루에 수행 될 수 있으며 2 주 동안 생체 내 및 체외 연구를위한 즉시 사용할 수있는 잉크 T 세포의 많은 수를 생성 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 실험실의 사후 문서인 글로리아 델판티(Gloria Delfanti)입니다.마우스 비장을 해부 한 후, 70 나노 미터 세포 스트레이너를 통해 분쇄하여 2 % FBS로 PBS의 10 밀리리터에서 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 원심분리기는 5분간 300배 G로 합니다. 상체를 제거하고 멸균 암모늄 염화 칼륨 리신 버퍼의 1 밀리리터로 세포 펠릿을 다시 분리합니다.실온에서 3분 동안 세포를 배양한 다음 2%의 FBS로 PBS 5밀리리터로 차단합니다. 원심분리기는 5분간 300배 G로 합니다. 상체를 제거 한 후, 2 %의 FBS와 PBS의 세 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 파이펫팅하여 지방 잔류물을 제거합니다.농축 단계를 위해 세포를 차갑게 유지하고 섭씨 4도에서 미리 냉각된 다음 얼음 위에 보관하는 솔루션을 사용합니다. 원심분리기는 5분간 300배 G로 합니다. 2%FPS 및 Fc 차단제로 적절한 양의 PBS로 모든 셀을 재중단하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.1,000만 개의 세포당 MACS 분리 버퍼1~2밀리리터로 세척하고 10분 동안 300배 G에서 원심분리기로 세척합니다. 상체를 제거한 후 CD19-FITC 및 H2-IAb-FITC로 세포를 염색하고 4-8°C에서 어둠 속에서 15분 동안 배양합니다. 1,000만 개의 세포당 MACS 버퍼1~2밀리리터를 추가하고 10분 동안 300배 G의 원심분리기를 추가하여 셀을 세척합니다.1,000만 개의 세포당 90마이크로리터의 MACS 버퍼에서 수퍼를 제거하고 세포 펠릿을 재연합니다. 1,000만 개의 세포당 10마이크로리터의 안티 FITC 마이크로비드를 추가합니다. 잘 섞고 4~8도의 어둠 속에서 15분간 배양하세요.1,000만 개의 세포당 MACS 버퍼1~2밀리리터를 추가하고 10분 동안 300배 G의 원심분리기를 추가하여 세포를 세척합니다. 상체를 제거하고 MACS 버퍼의 500 마이크로 리터에서 최대 1억 2,500만 개의 세포를 재연하십시오. MACS 분리기의 자기장에 LD 컬럼을 배치합니다.막힘을 피하려면 LD 열에 사전 분리 필터를 적용하고 MACS 버퍼의 두 밀리리터로 헹신다. 셀 서스펜션을 필터에 적용하고 컬럼을 통과하는 레이블이 없는 셀을 수집합니다. MACS 버퍼 1밀리리터로 빈 기둥 저장소를 세 번 씻으시면 됩니다.T 세포농축 유출물을 수집하고 세포를 계산하여 FACS 분석을 위해 50마이크로리터를 유지합니다. 5 분 동안 300 회 G에서 원심 분리 한 후, 상체를 제거하고 CD1d 테트라머 -PE로 세포를 얼룩. 잘 섞어서 얼음 의 어둠 속에서 30 분 동안 배양하십시오.1,000만 개의 세포당 MACS 버퍼의 1~2밀리리터를 추가하여 셀을 세척합니다. 10분 동안 300회 G에서 원심분리 후, 1,000만 개의 세포당 80마이크로리터의 MACS 버퍼에서 수퍼나탄을 제거하고 세포 펠릿을 재보페한다. 1,000만 개의 세포당 20마이크로리터의 안티-PE 마이크로비드를 추가합니다.잘 섞고 4~8도의 어둠 속에서 15분간 배양하세요. 1,000만 개의 세포당 MACS 버퍼1~2밀리리터를 추가하고 10분 동안 300배 G의 원심분리기를 추가하여 셀을 세척합니다. 상체를 제거하고 MACS 버퍼의 500 마이크로 리터에서 최대 1 억 개의 세포를 다시 일시 중단하십시오.셀 수에 따라 LS 또는 MS 컬럼을 MACS 분리기의 자기장에 배치하고 MACS 버퍼로 컬럼을 헹구는다. 셀 서스펜션을 컬럼에 적용하고, 이전에 설명한 대로 열을 세 번 통과하고 세척하는 레이블이 없는 세포를 수집합니다. 이것은 음수 분수입니다.자기장에서 컬럼을 제거하고 새 수집 튜브에 배치합니다. 파이펫 MACS는 컬럼에 버퍼링하고 제공된 플런저를 컬럼으로 밀어 잉크 T 셀에 농축된 양수 분획을 플러시합니다. INK T 셀 복구를 더욱 증가시키기 위해 음극을 10분 동안 300배 G로 원심분리하고 새로운 LS 또는 MS 열을 사용하여 이전 단계를 반복합니다.양수 분획을 당기고 셀 수를 결정합니다. FACS 분석을 위해 50마이크로리터를 양수 및 음극분수 모두 유지하여 순도를 확인합니다. 1대1 비율로 INK T 세포를 활성화하려면 항 CD3 및 CD28 자기 구슬의 적절한 부피를 튜브로 옮기고 PBS의 동일한 부피로 5초 동안 소용돌이를 전달합니다.튜브를 자석에 1분간 놓고 상체를 폐기합니다. 자석에서 튜브를 제거하고 RPMI의 적절한 부피에서 세척 된 자기 구슬을 다시 분리합니다. 원심분리기는 잉크 T 세포를 5분 동안 300배 G로 정결하고 마우스 T-활성제 안티 CD3 또는 CD28 자기 구슬과 혼합합니다.셀 서스펜션의 1밀리리터, 안티 CD23 및 CD28 마그네틱 구슬을 48웰 플레이트에 넣고 밀리리터 IL-2당 20단위를 한 다음 섭씨 37도에서 배양합니다. 5 일 후, 추가 10 밀리 리터 IL-7 당 나노 그램. 80~90%의 합류에 도달하면 세포를 반으로 나누고, 항상 밀리리터 IL-2당 20단위, 밀리리터 IL-7당 10나노그램을 추가합니다.이러한 조건하에서 INK T 세포는 최대 15일 동안 확장할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 잉크 T 세포는 면역 자기 분리 과정을 통해 형질전환 마우스의 비장에서 풍부하게 된다. 농축 후, 세포는 항 CD3 및 CD28 구슬로 확장될 수 있으며, 그 결과 배양14일까지 평균 30배의 확장이 가능합니다.안티 CD3 및 안티 CD 비드를 통한 강력한 활성화는 세포 표면에 IMK T 세포 TCR 발현의 다운레핑을 유도하고 이중 음수 집단이 나타났다. 확장된 잉크 T 세포의 대다수는 CD4 음성입니다. 계보 특이적 전사 인자 PLZF 및 ROR 감마 T의 특성화는 0일 및 14일에 농축된 잉크 T 세포에 대한 NKT1, NKT2 및 NKT17 표현형을 식별할 수 있게 하였다.농축 된 잉크 T 세포는 PMA 및 이오노마이신 자극 후 인터페론 감마와 IL-4의 분비에 의해 확인된 바와 같이 14 일 간의 확장 후 보존되는 T80과 같은 이펙터 표현형을 보여줍니다. 정화 단계 동안, 미리 냉각 된 솔루션으로 빠르게 작동하고 파이펫하는 동안 볼 수있는 지방 잔류물을 제거해야합니다. 확장된 INK T 세포는 유전자 전달 또는 편집을 통해 기능적 수정 후에도 체외 분석 및 생쥐로의 생체 내 전달을 위해 악용될 수 있다.INK T 세포의 체외 확장은 빈약에 의해 주어진 한계를 극복, 종양 면역 감시의 분야에서 전임상 연구에서 악용 만들기, 전염병, 및 자동 면역.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Zoledronate를 사용하는 사람 말초혈의 확장 γδ T 세포

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

T 세포의 유도<em&gt; 체외</em&gt; 마우스 배아 줄기 세포에서

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...