Name: purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies at JoVE.com

Vi takker Paolo Dellabona og Giulia Casorati for vitenskapelig støtte og kritisk lesning av manuskriptet. Vi takker også NIH Tetramer Core Facility for mus CD1d tetramer. Studien ble finansiert av Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (til M.F.) og Italian Association for Cancer Research (AIRC) fellowship 2019-22604 (til G.D.).

Prosedyrer beskrevet her ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (nr. 1048) ved San Raffaele Scientific Institute.
MERK: Alle prosedyrene må utføres under sterile forhold. Alle reagensene som brukes er oppført i Materiallisten.
1. Miltbehandling
<ol><li>Euthanize iVα14-Jα18 mus ved innånding av CO2 i henhold til institusjonell politikk. MERK: iVα14-Jα18-mus må være 8 uker gamle el...

<ol>
	<li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+natural+killer+T+(NKT)+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1(-)CD4(+)+CD1d-dependent+precursor+stage.">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li><li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage.">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li><li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells.">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li><li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development.">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li><li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+CD40/Fas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression.">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy.">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells.">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li><li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo.">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li><li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis.">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L++NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo.">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li><li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells.">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li><li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting.">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-party+CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality.">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4+CD25+FoxP3++regulatory+T+cells.">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li><li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation.">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li><li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism.">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li><li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease.">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma.">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma:+an+interim+analysis.">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li><li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma:+A+Phase+I+Clinical+Trial.">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li><li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy.">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).</li></ol>

Her viser vi en reproduserbar og gjennomførbar protokoll for å skaffe millioner av iNKT-celler som er klare til bruk. På grunn av paucity av disse cellene in vivo, var det svært nødvendig med en metode for å utvide dem. Protokollen vi foreslår krever verken en bestemt instrumentering eller et høyt antall mus. Vi utnyttet iVα14-Jα18 transgene mus med vilje for å redusere antall mus som trengs for prosedyren.
En annen vellykket protokoll for iNKT celleutvidelse fra iVα14-Jα18 transg...

Invariant Natural killer T celler (iNKT celler) er medfødt-lignende T-lymfocytter som uttrykker en semi-invariant αβ T celle reseptor (TCR), dannet i mus av en invariant Vα14-Jα18 kjede sammen med et begrenset sett med forskjellige Vβ kjeder1, som er spesifikk for lipid antigener presentert av MHC klasse I-relatert molekyl CD1d2. iNKT-celler gjennomgår et agonistisk utvalgsprogram som resulterer i oppkjøpet av en aktivert / medfødt effektorfenotype allerede i tymus, som oppstår gjennom flere modningsstadier3,4, og produserer en CD4+ og en CD4- delsett. Gjennom dette programmet får iNKT-celler distinkte T-hjelper (TH) effektorfenotyper, nemlig TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) og TH17 (iNKT17), identifiserbar ved uttrykk for transkripsjonsfaktorene T-bet, GATA3, PLZF og RORγt, henholdsvis5. iNKT-celler gjenkjenner en rekke mikrobielle lipider, men er også selvreaktive mot endogene lipider som er oppregulert i sammenheng med patologiske situasjoner med cellestress og vevsskade, for eksempel kreft og autoimmunitet2. Ved aktivering modulerer iNKT-celler funksjonene til andre medfødte og adaptive immuneffektorceller via direkte kontakt og cytokinproduksjon2.
Undersøkelsene av iNKT-celler har blitt tilrettelagt av musemodeller, inkludert CD1d-mangelfulle eller Jα18-mangelfulle mus, og ved produksjon av antigenbelastede CD1d tetramerer pluss generering av monoklonale antistoffer (mAbs) som er spesifikke for den menneskelige semi-invariantE TCR. Imidlertid har genereringen av primærmus iNKT cellelinje vist seg vanskelig. For bedre å karakterisere antitumorfunksjonene til iNKT-celler og for å bruke dem til adoptivcelleterapi, setter vi opp en protokoll for å rense og utvide miltika iNKT-celler av iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg)6, der iNKT-celler er 30 ganger hyppigere enn hos villtype mus.
Utvidede iNKT-celler kan utnyttes for in vitro-analyser, og in vivo ved overføring tilbake til mus. I denne innstillingen har vi for eksempel vist deres potente anti-tumor effekter7. Videre er in vitro utvidede iNKT-celler egnet til funksjonell modifikasjon via genoverføring eller redigering før injeksjonen in vivo8, noe som gir innsiktsfull funksjonell analyse av molekylære veier, samt baner vei for avanserte celleterapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115506</td>
			<td>clone 6D5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d-tetramer -PE</td>
			<td>NIH tetramer core facility</td>
			<td></td>
			<td>mouse PBS57-Cd1d-tetramers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 -PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100528</td>
			<td>clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocker</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0186L</td>
			<td>heat-inactivated and filtered .22 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Transcription factor staining buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2 (IAb) -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>114406</td>
			<td>clone AF6-120.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hrIL-2</td>
			<td>Chiron Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer (MB)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermWash</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>51-2091KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat Mouse IL-7</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>407-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; -APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109212</td>
			<td>clone H57-597</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;CD3CD28 mouse T activator Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11452D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies

Invariant Natural Killer T (iNKT) celler er medfødt-lignende T Lymphocytes uttrykker en konservert semi-invariant T celle reseptor (TCR) spesifikk for selv eller mikrobielle lipid antigener presentert av ikke-polymorfisk MHC klasse I-relatert molekyl CD1d. Prekliniske og kliniske studier støtter en rolle for iNKT celler i kreft, autoimmunitet og smittsomme sykdommer. iNKT-celler er svært bevart gjennom arter, og deres undersøkelse har blitt tilrettelagt av musemodeller, inkludert CD1d-mangelfulle eller iNKT-mangelfulle mus, og muligheten til å utvetydig oppdage dem hos mus og menn med CD1d tetramers eller mAbs som er spesifikke for den semi-konstante TCR. Imidlertid er iNKT-celler sjeldne, og de må utvides for å nå håndterbare tall for enhver studie. Fordi genereringen av primærmus iNKT cellelinje in vitro har vist seg vanskelig, har vi satt opp en robust protokoll for å rense og utvide miltniske iNKT-celler fra iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg), der iNKT-celler er 30 ganger hyppigere. Vi viser her at primære milt iVα14Tg iNKT-celler kan berikes gjennom en immunomagnetisk separasjonsprosess, noe som gir ca 95-98% rene iNKT-celler. De rensede iNKT-cellene stimuleres av anti-CD3 / CD28 perler pluss IL-2 og IL-7, noe som resulterer i 30 ganger utvidelse om dagen +14 av kulturen med 85-99% renhet. De utvidede iNKT-cellene kan enkelt genetisk manipuleres, og gir et uvurderlig verktøy for å dissekere mekanismer for aktivering og funksjon in vitro og, enda viktigere, også ved adoptivoverføring in vivo.

Protokollen beskrevet i dette manuskriptet gjør det mulig å berike iNKT-celler fra milten av iVa14-Ja18 transgene mus gjennom en immunomagnetisk separasjonsprosess oppsummert i figur 1A. Totalt milt T-celler velges først negativt ved å tømme B-celler og monocytter, etterfulgt av iNKT-cellens positive immunomagnetiske sortering med PBS-57 lipidantigenbelastede CD1d-tetramerer, som gjør det mulig å spesifikt flekke bare iNKT-celler. Denne protokollen gir omtrent 2 x 106 av 95...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies at JoVE.com

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Vi beskriver en rask og robust protokoll for å berike invariante naturlige killer T (iNKT) celler fra mus milt og utvide dem in vitro til passende tall for in vitro og in vivo studier.

Rensing og utvidelse av mus konstant naturlig killer T celler for in vitro og in vivo studier

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Denne protokollen muliggjør rensing av INK T-celler, som er svært sjeldne, og tillater en 30 ganger utvidelse i nummeret. Rensingen kan utføres på en dag og produsere et stort antall blekk T-celler som er klare til bruk for in vivo- og in vitro-studier om to uker. Å demonstrere prosedyren vil være Gloria Delfanti, en postdoktor i laboratoriet.Etter å ha dissekert musen milt, knuse den gjennom en 70 nanometer celle sil for å få en enkelt celle suspensjon i 10 milliliter PBS med 2%FBS. Sentrifuge på 300 ganger G i fem minutter. Fjern supernatanten og resuspend cellepellet med en milliliter steril ammoniumklorid kalium lysinbuffer.Inkuber cellene i tre minutter ved romtemperatur, og blokker deretter med fem milliliter PBS med 2% FBS. Sentrifuge på 300 ganger G i fem minutter. Etter å ha fjernet supernatanten, resuspenderer cellepellet i tre milliliter PBS med 2% FBS og fjern fettrester ved pipettering.For berikelsestrinnene, hold cellene kalde og bruk løsninger forhåndskjølt ved fire grader Celsius og deretter holdt på is. Sentrifuge på 300 ganger G i fem minutter. Resuspend alle cellene i riktig mengde PBS med 2% FPS og Fc blokkering og inkubere i 15 minutter ved romtemperatur.Vask med en til to milliliter MACS-separasjonsbuffer per 10 millioner celler og sentrifuger ved 300 ganger G i 10 minutter. Etter å ha fjernet supernatanten, flekk cellene med CD19-FITC og H2-IAb-FITC og inkuber i 15 minutter i mørket ved fire til åtte grader Celsius. Vask celler ved å legge til en til to milliliter MACS-buffer per 10 millioner celler og sentrifuger ved 300 ganger G i 10 minutter.Fjern supernatant og resuspend cellepellet i 90 mikroliter MACS buffer per 10 millioner celler. Tilsett 10 mikroliter anti-FITC mikrober per 10 millioner celler. Bland godt og inkuber i 15 minutter i mørket ved fire til åtte grader Celsius.Vask cellene ved å legge til en til to milliliter MACS-buffer per 10 millioner celler og sentrifuger ved 300 ganger G i 10 minutter. Fjern supernatanten og resuspend opptil 125 millioner celler i 500 mikroliter MACS-buffer. Plasser en LD-kolonne i magnetfeltet til MACS-separatoren.For å unngå tilstopping, bruk et forseparasjonsfilter på LD-kolonnen og skyll det med to milliliter MACS-buffer. Bruk celleopphenget på filteret, og samle cellene uten etikett som passerer gjennom kolonnen. Vask det tomme søylereservoaret tre ganger med en milliliter MACS-buffer.Samle T-celle beriket avløp og telle cellene, holde 50 mikroliter for FACS analyse. Etter sentrifugering ved 300 ganger G i fem minutter, fjern supernatanten og flekk cellene med CD1d tetramer-PE. Bland godt og inkuber i 30 minutter i mørket på is.Vask cellene ved å legge til en til to milliliter MACS-buffer per 10 millioner celler. Etter sentrifugering ved 300 ganger G i 10 minutter, fjern supernatanten og resuspend cellepelleten i 80 mikroliter MACS-buffer per 10 millioner celler. Tilsett 20 mikroliter anti-PE mikrober per 10 millioner celler.Bland godt og inkuber i 15 minutter i mørket ved fire til åtte grader Celsius. Vask celler ved å legge til en til to milliliter MACS-buffer per 10 millioner celler og sentrifuger ved 300 ganger G i 10 minutter. Fjern supernatanten og resuspend opptil 100 millioner celler i 500 mikroliter MACS-buffer.I følge celleantallet plasserer du LS- eller MS-kolonnen i magnetfeltet til MACS-separatoren og skyll kolonnen med MACS-buffer. Påfør celleopphenget på kolonnen, samle celler uten etikett som passerer gjennom og vask kolonnen tre ganger som beskrevet tidligere. Dette er den negative brøkdelen.Fjern kolonnen fra magnetfeltet og legg den på et nytt oppsamlingsrør. Pipette MACS-buffer på kolonnen og skyv det medfølgende stempelet inn i kolonnen for å skylle ut den positive fraksjonen som er beriket i INK T-celler. Hvis du vil øke gjenopprettingen av INK T-celler ytterligere, sentrifugerer du den negative brøken ved 300 ganger G i 10 minutter og gjentar tidligere trinn med en ny LS- eller MS-kolonne.Trekk de positive brøkene og bestem celleantall. Hold 50 mikroliter av både positive og negative fraksjoner for FACS-analyse for å sjekke renheten. Hvis du vil aktivere INK T-celler med et en-til-en-forhold, overfører du riktig volum anti-CD3 og CD28 magnetiske perler til et rør og med samme volum PBS, deretter virvel i fem sekunder.Plasser røret på en magnet i ett minutt og kast supernatanten. Fjern røret fra magneten og resuspend de vaskede magnetiske perlene i riktig volum av RPMI. Sentrifuge renset INK T-celler ved 300 ganger G i fem minutter og bland dem med musen T-aktivator anti-CD3 eller CD28 magnetiske perler.Plate en milliliter av celle suspensjon, anti-CD23 og CD28 magnetiske perler i en 48-brønns plate med 20 enheter per milliliter IL-2, deretter inkubere på 37 grader Celsius. Etter fem dager, tilsett 10 nanogram per milliliter IL-7. Del cellene i to når de når 80 til 90% samløp, og legg alltid til 20 enheter per milliliter IL-2 og 10 nanogram per milliliter IL-7.Under disse forholdene kan INK T-celler utvides i opptil 15 dager. Ved hjelp av denne protokollen er INK T-celler beriket fra milten av transgene mus gjennom en immunomagnetisk separasjonsprosess. Etter berikelse kan cellene utvides med anti-CD3- og CD28-perler, noe som resulterer i en 30 ganger utvidelse i gjennomsnitt etter dag 14 av kulturen.Den sterke aktiveringen med anti-CD3- og anti-CD-perler induserte nedreguleringen av IMK T-celle TCR-uttrykket på celleoverflaten, og en dobbel negativ populasjon dukket opp. De fleste utvidede INK T-celler er CD4-negative. Karakterisering av de avledningsspesifikke transkripsjonsfaktorene PLZF og ROR gamma T gjorde det mulig å identifisere NKT1-, NKT2- og NKT17-fenotypene på berikede INK T-celler på dag null og 14.De berikede INK T-cellene viser en T80-lignende effektorfenotype, som bevares etter 14 dagers ekspansjon som bekreftet av sekresjonen av både interferongamma og IL-4 etter PMA og ionomycinstimulering. Under rensetrinnene, husk å jobbe raskt med forhåndskjølte løsninger og bli kvitt eventuelle fettrester som kan ses under pipettering. Utvidede INK T-celler kan utnyttes for in vitro-analyser og in vivo-overføringer til mus, selv etter funksjonelle modifikasjoner via genoverføring eller redigering.In vitro utvidelse av INK T-celler overvinner begrensningen gitt av paucity, noe som gjør dem utnyttbare i prekliniske studier innen tumor immunovervåking, smittsomme sykdommer og auto-immunitet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Endring av primære humane T celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Kunstig antigenpresenterende Cell (AAPC) mediert aktivering og utvidelse av Natural Killer T celler

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigenpresenterende celler (KaAPC) for effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Nedbryting av humant antigen-spesifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Avledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Fra Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolasjon og<em&gt; In vitro</em&gt; Differensiering i T cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimalisert metode for å isolere og utvide Invariant Natural Killer T-celler fra mus Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...