Name: purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies at JoVE.com

Vi tackar Paolo Dellabona och Giulia Casorati för vetenskapligt stöd och kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar också NIH Tetramer Core Facility för mus CD1d tetramer. Studien finansierades av Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (till M.F.) och Italian Association for Cancer Research (AIRC) fellowship 2019-22604 (till G.D.).

De förfaranden som beskrivs här granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (nr 1048) vid San Raffaele Scientific Institute.
OBS: Alla procedurer måste utföras under sterila förhållanden. Alla reagenser som används anges i tabellen över material.
1. Mjältebehandling
<ol><li>Avliva iVα14-Jα18 möss genom inandning av CO2 enligt den institutionella politiken. OBS: iVα14-Jα18 möss måst...

<ol>
	<li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+natural+killer+T+(NKT)+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1(-)CD4(+)+CD1d-dependent+precursor+stage.">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li><li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage.">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li><li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells.">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li><li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development.">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li><li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+CD40/Fas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression.">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy.">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells.">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li><li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo.">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li><li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis.">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L++NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo.">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li><li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells.">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li><li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting.">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-party+CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality.">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li><li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4+CD25+FoxP3++regulatory+T+cells.">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li><li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation.">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li><li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism.">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li><li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease.">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma.">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li><li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma:+an+interim+analysis.">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li><li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma:+A+Phase+I+Clinical+Trial.">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li><li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy.">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).</li></ol>

Här visar vi ett reproducerbart och genomförbart protokoll för att få miljontals färdiga iNKT-celler. På grund av bristen på dessa celler in vivo, var en metod för att expandera dem välbehövlig. Det protokoll vi föreslår kräver varken en viss instrumentering eller ett stort antal möss. Vi utnyttjade iVα14-Jα18 transgena möss med avsikt att minska antalet möss som behövs för proceduren.
Ett annat framgångsrikt protokoll för iNKT-cellexpansion från iVα14-Jα18 transgena m...

Invarianta naturliga mördar T-celler (iNKT-celler) är medfödda T-lymfocyter som uttrycker en semi-invariant αβ T-cellsreceptor (TCR), bildad hos möss av en invariant Vα14-Jα18-kedja parad med en begränsad uppsättning olika Vβ-kedjor1, vilket är specifikt för lipidantigener som presenteras av MHC-klass I-relaterad molekyl CD1d2. iNKT-celler genomgår ett agonistiskt urvalsprogram som resulterar i förvärv av en aktiverad /medfödd effektorfenotyp redan i tymus, som sker genom flera mognadsstadier3,4, som producerar en CD4+ och en CD4- delmängd. Genom detta program förvärvar iNKT-celler distinkta T helper (TH)effector fenotyper, nämligen TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) och TH17 (iNKT17), identifierbar genom uttryck av transkriptionsfaktorerna T-bet, GATA3, PLZF respektive RORγt,respektive 5. iNKT-celler känner igen en rad mikrobiella lipider men är också självreaktiva mot endogena lipider som är uppreglerade i samband med patologiska situationer av cellstress och vävnadsskador, såsom cancer och autoimmunitet2. Vid aktivering modulerar iNKT-celler funktionerna hos andra medfödda och adaptiva immuneffektorceller via direktkontakt och cytokinproduktion2.
Undersökningarna av iNKT-celler har underlättats av musmodeller, inklusive CD1d-bristfälliga eller Jα18-bristfälliga möss, och genom produktion av antigenbelastade CD1d-tetramerer plus generering av monoklonala antikroppar (mAbs) som är specifika för den mänskliga semiinvarianta TCR. Genereringen av primära musen iNKT cellinje har dock visat sig svårt. För att bättre karakterisera antitumörfunktionerna hos iNKT-celler och för att använda dem för adoptivcellsterapi, inrättar vi ett protokoll för att rena och expandera splenic iNKT-celler av iVα14-Jα18 transgena möss (iVα14Tg)6, där iNKT-celler är 30 gånger vanligare än hos vilda möss.
Expanderade iNKT-celler kan utnyttjas för in vitro-analyser och in vivo vid överföring tillbaka till möss. I den här inställningen har vi till exempel visat deras potenta antitumöreffekter7. Dessutom är in vitro-utökade iNKT-celler mottagliga för funktionell modifiering via genöverföring eller redigering före injektionen in vivo8, vilket möjliggör insiktsfull funktionell analys av molekylära vägar, samt banar väg för avancerade cellterapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115506</td>
			<td>clone 6D5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d-tetramer -PE</td>
			<td>NIH tetramer core facility</td>
			<td></td>
			<td>mouse PBS57-Cd1d-tetramers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 -PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100528</td>
			<td>clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocker</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0186L</td>
			<td>heat-inactivated and filtered .22 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Transcription factor staining buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2 (IAb) -FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>114406</td>
			<td>clone AF6-120.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hrIL-2</td>
			<td>Chiron Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer (MB)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PermWash</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>51-2091KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat Mouse IL-7</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>407-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; -APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109212</td>
			<td>clone H57-597</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;CD3CD28 mouse T activator Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11452D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and expansion of mouse invariant natural killer t cells for in vitro and in vivo studies

Invariant Natural Killer T (iNKT) celler är medfödda-liknande T Lymfocyter uttrycker en bevarad semi-invariant T cell receptor (TCR) specifik för själv eller mikrobiella lipid antigener presenteras av den icke-polymorfa MHC klass I-relaterade molekylen CD1d. Prekliniska och kliniska studier stöder en roll för iNKT celler i cancer, autoimmunitet och infektionssjukdomar. iNKT-celler är mycket bevarade i hela arten och deras undersökning har underlättats av musmodeller, inklusive CD1d-bristfälliga eller iNKT-bristfälliga möss, och möjligheten att otvetydigt upptäcka dem hos möss och män med CD1d-tetramerer eller mAbs som är specifika för semiinvariant TCR. INKT-celler är dock sällsynta och de måste utökas för att nå hanterbara siffror för alla studier. Eftersom genereringen av primära mus iNKT cellinje in vitro har visat sig svårt, har vi inrättat ett robust protokoll för att rena och expandera mjälte iNKT celler från iVα14-Jα18 transgena möss (iVα14Tg), där iNKT celler är 30 gånger vanligare. Vi visar här att primära splenic iVα14Tg iNKT celler kan berikas genom en immunomagnetisk separation process, vilket ger ca 95-98% ren iNKT celler. De renade iNKT-cellerna stimuleras av anti-CD3/CD28 pärlor plus IL-2 och IL-7, vilket resulterar i 30-faldig expansion på dag +14 av kulturen med 85-99% renhet. De expanderade iNKT-cellerna kan lätt manipuleras genetiskt, vilket ger ett ovärderligt verktyg för att dissekera mekanismer för aktivering och funktion in vitro och, ännu viktigare, även vid adoptivöverföring in vivo.

Protokollet som beskrivs i detta manuskript gör det möjligt att berika iNKT-celler från mjälten av iVa14-Ja18 transgena möss genom en immunomagnetisk separationsprocess sammanfattad i figur 1A. Totala mjälte T-celler väljs först negativt genom uttömning av B-celler och monocyter, följt av iNKT-cellspositiv immunomagnetisk sortering med PBS-57 lipidantigen laddade CD1d-tetramerer, som gör det möjligt att specifikt färga endast iNKT-celler. Detta protokoll ger ca 2 x 106</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies at JoVE.com

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Vi beskriver ett snabbt och robust protokoll för att berika invarianta naturliga killer T (iNKT) celler från mus mjälte och expandera dem in vitro till lämpliga nummer för in vitro och in vivo studier.

Rening och expansion av Musinvarianta naturliga killer T-celler för in vitro- och in vivo-studier

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Detta protokoll möjliggör rening av INK T-celler, som är mycket sällsynta, och möjliggör en 30-faldig expansion i deras antal. Reningen kan utföras på en dag och producera ett stort antal färdiga INK T-celler för in vivo- och in vitro-studier på två veckor. Gloria Delfanti, postdoktor i labbet, demonstrerar proceduren.Efter dissekering av musmusjälten, krossa den genom en 70 nanometer cellsil för att få en enda cellupphängning i 10 milliliter PBS med 2%FBS. Centrifugera vid 300 gånger G i fem minuter. Ta bort supernatanten och återanvända cellpelleten med en milliliter steril ammoniumkloridkloridkalusin.Inkubera cellerna i tre minuter vid rumstemperatur och blockera sedan med fem milliliter PBS med 2%FBS. Centrifugera vid 300 gånger G i fem minuter. Efter att ha tagit bort supernatanten, återanvänd cellpelleten i tre milliliter PBS med 2% FBS och ta bort fettrester genom pipettering.För anrikningsstegen, håll cellerna kalla och använd lösningar förkylda vid fyra grader Celsius och sedan hålls på is. Centrifugera vid 300 gånger G i fem minuter. Återanvänd alla celler i lämplig mängd PBS med 2% FPS och Fc blockerare och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.Tvätta med en till två milliliter MACS-separationsbuffert per 10 miljoner celler och centrifugera vid 300 gånger G i 10 minuter. Efter att ha tagit bort supernatanten, färga cellerna med CD19-FITC och H2-IAb-FITC och inkubera i 15 minuter i mörkret vid fyra till åtta grader Celsius. Tvätta celler genom att tillsätta en till två milliliter MACS-buffert per 10 miljoner celler och centrifugera vid 300 gånger G i 10 minuter.Ta bort supernatant och återanvänd cellpelleten i 90 mikroliter MACS-buffert per 10 miljoner celler. Tillsätt 10 mikroliter anti-FITC-mikrober per 10 miljoner celler. Blanda väl och inkubera i 15 minuter i mörkret vid fyra till åtta grader Celsius.Tvätta cellerna genom att tillsätta en till två milliliter MACS-buffert per 10 miljoner celler och centrifugera vid 300 gånger G i 10 minuter. Ta bort supernatanten och återanvänd upp till 125 miljoner celler i 500 mikroliter MACS-buffert. Placera en LD-kolumn i macs-separatorns magnetfält.För att undvika igensättning, applicera ett förseparationsfilter på LD-kolonnen och skölj det med två milliliter MACS-buffert. Applicera cellupphängningen på filtret och samla in de omärkta cellerna som passerar genom kolumnen. Tvätta den tomma kolonnbehållaren tre gånger med en milliliter MACS-buffert.Samla in det T-cellsberikade utflödet och räkna cellerna och behåll 50 mikroliter för FACS-analys. Efter centrifugering vid 300 gånger G i fem minuter, ta bort supernatanten och färga cellerna med CD1d tetramer-PE. Blanda väl och inkubera i 30 minuter i mörkret på is.Tvätta cellerna genom att tillsätta en till två milliliter MACS-buffert per 10 miljoner celler. Efter centrifugering vid 300 gånger G i 10 minuter, ta bort supernatanten och återanvända cellpelleten i 80 mikroliter MACS-buffert per 10 miljoner celler. Tillsätt 20 mikroliter anti-PE-mikrober per 10 miljoner celler.Blanda väl och inkubera i 15 minuter i mörkret vid fyra till åtta grader Celsius. Tvätta celler genom att tillsätta en till två milliliter MACS-buffert per 10 miljoner celler och centrifugera vid 300 gånger G i 10 minuter. Ta bort supernatanten och återanvänd upp till 100 miljoner celler i 500 mikroliter MACS-buffert.Enligt cellantalet placerar du LS- eller MS-kolonnen i macs-separatorns magnetfält och sköljer kolonnen med MACS-buffert. Applicera cellupphängningen på kolonnen, samla omärkta celler som passerar igenom och tvätta kolonnen tre gånger som beskrivits tidigare. Det här är den negativa fraktionen.Ta bort kolonnen från magnetfältet och placera den på ett nytt uppsamlingsrör. Pipette MACS-buffert på kolonnen och tryck in den medföljande kolven i kolonnen för att spola ut den positiva fraktionen berikad i INK T-celler. För att ytterligare öka INK T-cellsåtervinningen centrifugerar du den negativa fraktionen vid 300 gånger G i 10 minuter och upprepar tidigare steg med en ny LS- eller MS-kolumn.Dra de positiva fraktionerna och bestäm antalet celler. Håll 50 mikroliter av både positiva och negativa fraktioner för FACS-analys för att kontrollera renheten. Om du vill aktivera INK T-celler med ett förhållande överför du lämplig volym anti-CD3- och CD28-magnetiska pärlor till ett rör och med samma volym PBS och virvlar sedan i fem sekunder.Placera röret på en magnet i en minut och kassera supernatanten. Ta bort röret från magneten och återanvänd de tvättade magnetiska pärlorna i rätt volym av RPMI. Centrifug renade INK T-celler vid 300 gånger G i fem minuter och blanda dem med mus T-aktivator anti-CD3 eller CD28 magnetiska pärlor.Plätera en milliliter av cellupphängningen, anti-CD23 och CD28 magnetiska pärlor i en 48-brunnsplatta med 20 enheter per milliliter IL-2, och inkubera sedan vid 37 grader Celsius. Efter fem dagar tillsätt 10 nanogram per milliliter IL-7. Dela cellerna i hälften när de når 80 till 90% sammanflöde, tillsätt alltid 20 enheter per milliliter IL-2 och 10 nanogram per milliliter IL-7.Under dessa förhållanden kan INK T-celler expanderas i upp till 15 dagar. Med hjälp av detta protokoll berikas INK T-celler från mjälten av transgena möss genom en immunomagnetisk separationsprocess. Efter berikning kan cellerna utökas med anti-CD3- och CD28-pärlor, vilket resulterar i en 30-faldig expansion i genomsnitt dag 14 av kulturen.Den starka aktiveringen med anti-CD3 och anti-CD pärlor inducerad nedreglering av IMK T-cells TCR uttryck på cellytan och en dubbel negativ population uppträdde. Majoriteten av de expanderade INK T-cellerna är CD4-negativa. Karakterisering av de härstamningsspecifika transkriptionsfaktorerna PLZF och ROR gamma T gjorde det möjligt att identifiera NKT1, NKT2 och NKT17 fenotyper på berikade INK T-celler dag noll och 14.De berikade INK T-cellerna visar en T80-liknande effektor fenotyp, som bevaras efter 14 dagars expansion som bekräftas av utsöndringen av både interferon gamma och IL-4 efter PMA och jonomycin stimulering. Under reningsstegen, kom ihåg att arbeta snabbt med förkylda lösningar och bli av med eventuella fettrester som kan ses vid pipettering. Utökade INK T-celler kan utnyttjas för in vitro-analyser och in vivo-överföringar till möss, även efter funktionella modifieringar via genöverföring eller redigering.In vitro-expansion av INK T-celler övervinner den begränsning som ges av bristen, vilket gör dem exploaterbara i prekliniska studier inom områdena tumör immunövervakning, infektionssjukdomar och autoimmunitet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Beredning och användning av HIV-1 infekterade Primär CD4 + T-celler som målceller i Natural Cytotoxiska Killer Cell analyser

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Utbyggnad av Human Peripheral Blood γδ T-celler med hjälp zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Konstgjord antigenpresenterande cell (AAPC) medierad aktivering och utbyggnad av naturliga mördarceller T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Härledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Från Mouse embryonala stamceller

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naiv CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering i T cellundergrupper

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimerad metod för att isolera och utöka Invariant Natural Killer T-celler från musmjälte

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...