Name: in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Val Millar og Dr. Sohaib Nizami for deres hjælp med mikroskopi med højt indhold og Dr. Daniel Ebner for adgang til mikroskoper med højt indhold. Desuden forfatterne takke Dr. Emma Mead for assay udvikling rådgivning, og Fru Cathy Browne for iPSC støtte. Dette arbejde blev støttet af Alzheimers Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, tilskud reference ARUK-2020DDI-OX), med yderligere støtte til James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) fra Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award fra Parkinsons UK (J-1403); MRC Demens Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnerskab MR/N013255/1 og Momentum MC_PC_16034 Awards.

<ol>
	<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li><li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+in+the+brain:+Homeostasis+and+disease.">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).</li><li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer's+disease:+potential+therapeutic+targets.">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li><li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+live+neurons.">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li><li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia.">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding.">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).</li><li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila.">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li><li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2.">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).</li><li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets.">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li><li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages.">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li><li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Alzheimer's+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout,+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages.">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12, 151 (2020).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer's+disease+not+evident+in+mouse+models.">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li><li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+robust+Z'+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons.">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).</li><li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+&#945;-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson's+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons.">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular &#945;-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li><li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2.">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li><li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease.">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Witting, A., M&#252;ller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia/brain+macrophages+in+vitro:+Involvement+of+lectin-,+integrin-,+and+phosphatidylserine-mediated+recognition.">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li><li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia.">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li><li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease.">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).</li><li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome.">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li><li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells.">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li><li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis.">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Microglia har vigtige funktioner, der påvirker indledningen og progressionen af neurodegenerative sygdomme, herunder fagocytose af apoptotiske neuroner. Nedsat mikroglial phagocytose og uhensigtsmæssig fagocytose af synapser har begge været forbundet med neurodegenerative sygdomme, selv om de underliggende mekanismer og årsagssammenhæng ikke er velforstået4,23. Dette papir skitserer en fagocytose assay til måling af fagocytose af apoptotiske celler ved iPSC-makrofager, med enten en levende celle time-lapse imaging udlæsning eller fast celle højt indhold mikroskopi, eller en kombination af begge på en enkelt analyse. Denne alsidighed betyder, at analysen kan bruges til at studere individuelle fagocytiske begivenheder over tid i et par brønde eller bruges til højindhold screening med flere betingelser eller behandlinger. Da analysen med højt indhold er fastgjort på et enkelt tidspunkt, kan flere analyseplader fremstilles samtidigt. Den højindhold assay har potentiale nytte til karakterisering makrofager / mikroglia med sygdomsrelaterede genetiske varianter eller screening små molekyle hæmmere for ændringer i fagocytose. Analysen kan også let tilpasses til at studere fagocytose af andre mikroglia modeller, eller potentielt astrocytter. Den phagocytose assay kan potentielt multiplexed med levende celle imaging pletter, f.eks mitokondrier, calcium, eller ROS indikatorer, og post-fiksering immunofluorescent farvning for proteiner-of-interesse kan udføres. Sammenlignet med eksisterende fagocytose assays, der udnytter apoptotiske neuronale celler, de vigtigste fordele, at denne protokol giver er, at forberedelsen af den fagocytiske last er relativt enkel og hurtig, og resulterer i et ensartet produkt. Andre analyser fremkalder apoptose af neuroner eller SH-SY5Ys med S-nitroso-L-cystein i 2 h25, okadainsyre i 3 h22, staurosporin i 4-16 h26,27,28,29 eller UV-bestråling i 24 timer30, og kan resultere i celler på forskellige stadier af apoptose. Desuden er live-celle billeddannelse og højt indhold billeddannelse udlæsninger ikke tidligere blevet beskrevet, så vidt forfatterne er klar over. Den største begrænsning ved at bruge paraformaldehyd-fiksering til at forberede den fagocytiske last er, at den ikke fuldt ud generobrer apoptoseprocessen, da fiksering forhindrer cellerne i at opdeles i apoptotiske kroppe, som sandsynligvis vil blive phagocytosed hurtigere på grund af deres mindre størrelse. Det vides ikke, hvilken effekt fiksering har på udskillelsen af nukleotid "find mig" signaler (f.eks ATP, UDP) fra målcellen, der tiltrækker fagocytter. Svarende til apoptotiske celler, de faste SH-SY5Ys udviser nogle membran permeabilitet til propidium jod. Membran permeabilitet er forbundet med frigivelsen af "find mig" signaler; Dette er dog ikke blevet undersøgt i de faste SH-SY5Ys, og hvis nukleotid frigives for hurtigt, vil de blive vasket væk, før SH-SY5Ys føjes til iPSC-makrofagerne.
Det første kritiske skridt i protokollen er farvning af døde SH-SY5Ys med en STP ester af en pH-følsomme rød fluorescerende farvestof. Dette farvestof reagerer hurtigt og kovalent med frie primære aminer på overfladen af de døde SH-SY5Ys. Varigheden af farvning behøver ikke at blive optimeret; Der skal dog udvises forsigtighed med håndtering af farvestoffet, inden mærkningen mærkes. Mærkningsreaktionen må ikke udføres i buffere, der indeholder frie aminer. Desuden er der risiko for nedbør, hvis DMSO-bestanden fortyndes i kold vandig buffer eller ved høj endelig koncentration. Bundfald vises som tætte mørke objekter under mikroskopet. Derudover klæber den pH-følsomme farveopløsning til almindelige plastcentrifugrør og vaskes langsomt af; Derfor anbefales lavbindende rør til mærkningstrinnet. Brug af et pH-følsomt farvestof, i stedet for et permanent fluorescerende farvestof, hjælper med at identificere opslugte partikler versus partikler, der nabo til plasmamembranen. Da der er en vis fluorescens ved neutral pH, skal tætheden af fagocytisk last og iPSC-makrofager holdes lav nok til nøjagtig segmentering, selv om den er høj nok til, at mange fagocytiske hændelser fanges. Mikroskopi med højt indhold var i stand til præcist at identificere fagocytose med en medium massefylde af last i brønden (mere end 2 SH-SY5Ys pr. iPSC-makrofag). Omvendt, på grund af svagere følsomhed af mikroskopet i det dybe røde spektrum, segmentering af iPSC-makrofager i live-celle time-lapse billeddata var mindre sikker, og det var nødvendigt at bruge en meget lav tæthed af last til at reducere sandsynligheden for falske positiver (1 SH-SY5Y for hver to iPSC-makrofager). Validering af korrekt segmentering og lasttæthed bør udføres med sammenligninger mellem ubehandlede og cytochalasin D-behandlede brønde. I en veloptimeret analyse, cytochalasin D bør reducere det gennemsnitlige antal pletter per celle med 90% i forhold til ubehandlede prøver.
Et andet vigtigt trin i protokollen er iPSC-makrofag farvning, som gør det muligt for cellen at blive identificeret og segmenteret i billedanalyse, således at eventuelle eksterne SH-SY5Ys er udelukket fra optællingen. Det anbefalede farvestof er cellepermeant, konverteret til et uopløseligt fluorescerende produkt inden for cytoplasmaet, fixable og ikke-giftigt (se Materialetabel). Farvningstrinnet blev optimeret til brug af iPSC-makrofager med højindhold imaging fagocytose assay, og vi foreslår, at det skal optimeres igen, hvis andre celletyper anvendes. Varigheden af cellefarvning kan øges for at forbedre aflejringen af det uopløselige fluorescerende produkt i cellerne. Hvis farvekoncentrationen optimeres, skal det sikres, at man undgår toksiske niveauer af det organiske opløsningsmiddelkøretøj.
Den tredje afgørende faktor for analysens succes er dataanalysen. De leverede analyserørledninger er beregnet til at være vejledende snarere end præskriptive, da forskelle i farvningsintensitet eller cellemorfologi kan reducere effektiviteten af segmentering af rørledningerne som skrevet. Der vil derfor være behov for visse optimeringer med test af pipelinen på passende positive og negative kontroller, og de parametre, der skal optimeres, er angivet i protokolteksten. Negative kontroller bør omfatte en tilstand, hvor iPSC-makrofager forbehandles med en potent fagocytosehæmmer, såsom cytochalasin D før tilsætning af SH-SY5Ys. En anden mulig negativ kontrol er tilsætning af SH-SY5Ys til tidligere ubehandlede brønde af iPSC-makrofager i slutningen af analysen, 10 minutter før fiksering, som tillader en vis afregning af lasten, men er for kort til en betydelig mængde fagocytose at forekomme. En fagocytosehændelse defineres som et rødt fluorescerende objekt inden for grænserne af en iPSC-makrofag, defineret af softwarealgoritmen ved hjælp af den dybe røde fluorescenskanal. Hvis segmentering af cellerne er dårlig (Figur 2), kan mange ikke-fagocytosed SH-SY5Ys i umiddelbar nærhed af iPSC-makrofager fejlagtigt indgå i analysen, dvs falske positiver. Den vigtigste faktor for at opnå god segmentering er streng afgrænsning af iPSC-makrofagerne. Segmentering for begge analyser er automatiseret, så det er ikke muligt at opnå perfekt segmentering for hver celle; Et par parametre kan dog justeres for at gøre segmentering mere optimal ved hjælp af et par testbilleder som reference. Cytochalasin D-styringen er vigtig for vurderingen af optimal segmentering, fordi et stort antal fagocytiske hændelser, der opdages i denne tilstand, indikerer, at segmentering er suboptimal. Optimering af dataanalysepipelinen bør ideelt set gentages, indtil antallet af fagocytiske hændelser pr. celle er 80%-90% lavere i cytochalasin D-tilstanden versus ingen hæmmer.
De problemer med fagocytoseanalysen, der er mest tilbøjelige til at forekomme, er: (1) svag pH-følsom fluorescens i positive kontroller, (2) sparsom eller ujævn fordeling af makrofager i slutningen af analysen eller (3) et højt antal falske positiver i analysen fra ikke-phagocytosed SH-SY5Ys. Fejlfinding af svag pH-følsom fluorescens bør først kontrollere, at farvning af SH-SY5Ys resulterede i en celle pellet med en stærk magenta farve. Hvis farven er svag, skal du sikre dig, at der anvendes et friskfarvelager, sikre, at mærkningsbufferen er aminefri, tilføje en ekstra vask til SH-SY5Ys før farvning, kontrollere, om det korrekte antal SH-SY5Y'er blev farvet, sikre, at der ikke er nogen farvetryk, og optimere mærkningskoncentrationen af farvestoffet. Hvis SH-SY5Ys er stærkt farvede, kontrollere, om koncentrationen tilsat til assay plade er korrekt, og sikre, at iPSC-makrofager er sunde og ikke for gamle. Den anden type problem, ujævn makrofagfordeling, kan skyldes tab af celler under pipettering, og der bør tages skridt til at reducere de pipetteringskræfter, som cellerne oplever, så man undgår smalborespidser. Hvis problemet forbliver, reducere inkubationstiden for lastning af iPSC-makrofager med cellepermeant farvestof. Det tredje problem med hensyn til fejlagtig optagelse af ikke-fagocyste partikler i analysen viser, at der er behov for mere optimering af analysepipelinen. Fejlfinding bør først og fremmest fokusere på cellesegmentering, og om softwaren indeholder tilstødende objekter. Specifikke parametre, der kan justeres, foreslås i noterne under de relevante trin (trin 6.1.11-6.1.15 for analyse af tidsfald med levende celler og trin 6.2.4-6.2.8 til analysen af højt indhold). Hvis cellesegmenteringen ikke kan forbedres yderligere, har analysen af højt indhold et ekstra trin (trin 6.2.8), der udelukker forkert segmenterede iPSC-makrofager. Desuden kan modulet, der filtrerer accepterede pletter af pH-følsom fluorescens i iPSC-makrofager, optimeres, hvilket øger tærskelintensiteten af accepterede objekter, hvilket skulle bidrage til at udelukke ikke-fagocytosed SH-SY5Ys (trin 6.1.17 til live-celle time-lapse-analysen og trin 6.2.11 til analysen med højt indhold).
Vi udviklede to typer af mikroskopi udlæsning for fagocytose assay, at hver har fordele og begrænsninger. Live-celle time-lapse imaging har den fordel at give ekstra information om fagocytose kinetik og er mere bredt tilgængelige end højt indhold billeddannelse platforme. Den anbefalede open source-software er agnostiker til mikroskopkilden og kan bruges med ethvert fluorescerende mikroskop af god kvalitet med eller uden live-celletidsforgang. Den vigtigste begrænsning af live-celle billeddannelse er begrænset følsomhed og optik, hvilket gør det mere udfordrende at opdage og udføre god segmentering af iPSC-makrofager. Denne begrænsning kan afhjælpes enten ved at øge varigheden af iPSC-makrofagfarvning eller ved at skifte til et mere følsomt mikroskop, hvis det er tilgængeligt. Den højindhold imaging fagocytose assay er den anbefalede udlæsning, hvis et højt indhold billeddannelsessystem er tilgængelig. Højindhold billeddannelsessystemer muliggør højere gennemløb og mere pålidelige data, gør det muligt at bruge denne analyse til screening, hvor en robust Z 'på ≥0,7 ville forventes for "antallet af pletter pr celle" output20. Sammenlignet med live-celle time-lapse metode, det høje indhold mikroskopi udlæsning har højere følsomhed, en højere grad af automatisering og hastighed, flere brønde og billedbehandling felter kan behandles, og høj opløsning confocal billeder er produceret. Cellesegmentering er mere effektiv med gode billeder, og segmentering er desuden hjulpet af højindhold billedanalyse software giver flere celle segmentering metoder egnet til stærkt uregelmæssigt formede celler. Den højindhold imaging analyse software også beregnet flere parametre for fagocytose, sammenlignet med open source-software, såsom procentdelen af fagocytiske celler. Den vigtigste begrænsning af højindhold fagocytose assay er en af omkostninger og tilgængelighed af billedbehandling system og analyse software.
Afslutningsvis er den kvantitative fagocytoseanalyse, der præsenteres i dette papir, et nyttigt værktøj til modellering af mikroglia-phagocytose af døde neuroner in vitro. Mikroglia er modelleret af iPSC-makrofager og de døde neuroner er modelleret af paraformaldehyd-faste SH-SY5Ys. Selvom det ikke er de mest autentiske mikroglia og døde / apoptotiske neuronmodeller offentliggjort, er disse nemme at forberede og skalerbare. Analysen selv er meget alsidig, med to typer af billedbehandling udlæsning detaljeret, og det har potentiale til at blive tilpasset til brug med forskellige microglia / makrofag monokultur modeller, eller en anden celletype til at fungere som fagocytisk last. Den højindhold imaging udlæsning er fordelagtigt for at opnå kvantitative data og kan skaleres op til assay små molekyle modulatorer af fagocytose, eller skærmen genetiske varianter i iPSC-makrofager. Men da højindhold billeddannelsessystemer er dyre og datatunge, er en alternativ billedbehandlingsudlæsning blevet inkluderet i protokollen ved hjælp af et live-celle time-lapse mikroskop, som kan erstatte ethvert konventionelt fluorescensmikroskop af god kvalitet, hvis det er nødvendigt.

Microglia er hjernevæv-resident makrofager, og deres funktioner omfatter immunovervågning, koordinere inflammatoriske reaktioner på skade / infektion, synaptisk remodeling, og fagocytose af døde celler, myelin, protein aggregater, og patogener. Phagocytose er den proces, hvorved mikroglia genkender last med overfladereceptorer og reorganiserer deres cytoskeleton for at opsluge objektet til en fagocsome, som derefter smelter sammen med lysosomer til nedbrydning af lasten. Sunde mikroglia phagocytose apoptotiske hjerneceller til at fjerne dem, før de bliver nekrotiske1. Fagocytose af apoptotiske celler er også kendt som efferocytose, og kræver visning af en fosfattidylserin "eat-me" signal af den døende celle2. Talrige mikroglia receptorer direkte binde sig til fosfattidylserin, herunder TIM-4, BAI1, Stabilin-2, og TREM2. Mikrogliale TAM-receptorer (f.eks. MERTK) og integriner binder sig indirekte til fosfattidylserin ved hjælp af tilbehørsproteinerne GAS6 eller MFG-E8. Andre "eat-me"-signaler kan være nødvendige for anerkendelse af døende celler, disse omfatter ændringer i glykosylation eller ladning af overfladeproteiner; ekspression af intracellulære proteiner ICAM3, calreticulin, annexin-I ved celleoverfladen oxideret LDL; eller belægning af apoptotiske celler med mikroglia-produceret komplement C1q1,2.
Neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, frontotemporal demens, og amyotrofisk lateral sklerose har været forbundet med svækkelse af microglia funktion, herunder en ophobning af hjerneaffald produkter såsom døde celler, myelin fragmenter, og protein aggregater, og overdrevne inflammatoriske reaktioner på disse stimuli3. Fagocytose kan være nedsat i neurodegenerative sygdomme og bidrage til patologien på grund af en kombination af aldring, betændelse eller specifikke genetiske risikovarianter4,5. På den anden side er der også beviser fra dyremodeller af neurodegenerative sygdomme, at mikroglia uhensigtsmæssigt kan phagocytose levedygtige neuroner eller synapser6,7,8. Mekanismen vil sandsynligvis blive anstiftet af fosfattidylserin display af beskadigede neurites, som er direkte fornemmes af mikroglial fagocytose receptorer TREM2 eller GPR56, eller indirekte fornemmes ved opløselig supplement C1q belægning fosfatylserin-beriget membran, hvilket fører til CR3-medieret phagocytose9,10,11.
In vitro-analyser af fagocytosefunktion, f.eks. for at vurdere den fænotypiske virkning af en genetisk risikovariant i mikroglia, udføres ofte ved hjælp af ikke-fysiologiske laster som latexperler4. Fluorescerende mærkede bakterier og zymosaner anvendes også, som er fysiologiske, men ikke relevante for neurodegenerative sygdomme. Ikke-fysiologiske fagocytiske laster kan bruges til at opdage defekter i de grundlæggende maskineri af fagocytisk opslugning, men undlader at præcist model det første "anerkendelse" skridt i fagocytose af apoptotiske neuroner. Størrelsen, formen, stivheden og typen af last dikterer også de intracellulære signalveje, der aktiveres, hvilket fører til forskellige resultater af mikrogliaaktiveringstilstand. For eksempel er E.coli-bakterier små og stive, i modsætning til menneskelige celler, og lipopolysaccharider på deres overflade genkendes af Toll-lignende receptor 4 (TLR4), der aktiverer fagocytose og proinflammatoriske signalveje2,12.
I forbindelse med neurodegenerative sygdomsundersøgelser ville en mere relevant fagocytisk last have fosfatylserindisplay på pattedyrs plasmamembraner og ideelt set være menneskelige og neuronale for at inkludere signaler, som mikroglia sandsynligvis vil støde på. Til denne fagocytose protokol, den menneskelige neuroblastom celle linje SH-SY5Y blev valgt som en neuron model, der er let at kultur. Permanent overfladephosphatidylserin display blev kunstigt induceret af paraformaldehyd, som tidligere har vist sig at forårsage fosfattidylserin visning af blodplader13. For mikroglia celle model menneskelige iPSC-makrofager blev anvendt, som efterligner ontogeny og transcriptional profil af menneskelige mikroglia, og er fagocytisk kompetente14,15,16,17. iPSC-makrofager er ikke den mest autentiske mikroglia-model, der findes, f.eks. man kan dog erstatte det med en mere autentisk monokultur iPSC-model af mikroglia, hvis det ønskes, såsom Haenseler et al.15. Humane iPSC-modeller er at foretrække frem for primær gnavermikroglilia til undersøgelse af neurodegeneration på grund af bekymringer om den begrænsede overlapning af mikroglia-transskriptionsmoduler observeret hos human versus mus neurodegenerative sygdomsvæv18. De døde SH-SY5Ys er plettet med en syre-følsomme farvestof, fluorescer svagt ved neutral pH og stærkere inde i fagagolyomer af iPSC-makrofager efter fagocytose. Ved hjælp af et syrefølsomt farvestof forbedres nøjagtigheden af detektering af fagocytiske hændelser med alsidighed til forskellige udlæsninger af levende og faste makrofager19. Denne protokol skitserer både live-celle time-lapse imaging af fagocytose, og en fast højindhold imaging assay for phagocytose, med de samme celle forberedelse trin før udlæsning (Figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Figur 1: Skemat diagram over metodologi. Omrids af fagocytoseanalysen, hvor fremstilling af SH-SY5Ys og farvning af iPSC-makrofagerne udføres parallelt, og derefter ledes SH-SY5Y'erne på iPSC-makrofagerne. Enten udføres levende celletidsfordårlig billeddannelse med det samme, eller cellerne inkuberes ved 37 °C/5% CO2 i den krævede varighed og fastsættes, før der udføres mikroskopi med højt indhold. PFA: paraformaldehyd, HBM: phenol rød-fri HEPES-buffered medier, pHr: pH-følsomme rød fluorescerende farvestof STP Ester løsning, PRFMM: phenol rød-fri makrofag medier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>For centrifugation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L, 20-200 &#181;L, 100-1000 &#181;L single-channel micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Component of Factory media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>For fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell-800 24-well plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34815</td>
			<td>Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14085</td>
			<td>Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 &#956;M, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 laminar air flow safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, set to 37&#176;C and 5 % CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image Data Storage and Analysis System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11330</td>
			<td>Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20&#176;C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320074</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for CellTracker and pHrodo dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>Live-cell time-lapse imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube CY5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4656</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4650</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube RFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 10-547F</td>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant BMP4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-3</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC0033</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant VEGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein binding 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108.132</td>
			<td>For staining SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC9501</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel 20-200 uL pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For liquid handling of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td>High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36011</td>
			<td>pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 &#956;L (12.5 &#956;g) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette filler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as &#34;Factories&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for SH-SY5Y culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealers</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676001</td>
			<td>For assay plate storage and transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, set to 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418F</td>
			<td>Component of Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-744Q</td>
			<td>Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages

Microglia orkestrere neuroimmune reaktioner i flere neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom og Alzheimers sygdom. Microglia rydde op døde og døende neuroner gennem processen med efferocytose, en specialiseret form for fagocytose. Fagocytosefunktionen kan forstyrres af miljømæssige eller genetiske risikofaktorer, der påvirker mikroglia. Dette papir præsenterer en hurtig og enkel in vitro mikroskopi protokol til undersøgelse af mikroglial efferocytose i en induceret pluripotente stamcelle (iPSC) model af mikroglia, ved hjælp af en menneskelig neuroblastom celle linje (SH-SY5Y) mærket med en pH-følsomme farvestof til fagocytisk last. Proceduren resulterer i et højt udbytte af døde neuroblastomceller, som viser overfladefosfatylserin, anerkendt som et "spis-mig" signal af fagocytter. 96-brønd plade assay er velegnet til live-celle time-lapse imaging, eller pladen kan med succes fastsættes forud for yderligere behandling og kvantificeret ved højindhold mikroskopi. Mikroskopi med højt indhold med fast celle gør det muligt at skaleres analysen op til screening af små molekylehæmmere eller til vurdering af den fagocytiske funktion af genetiske variant iPSC-linjer. Mens denne analyse blev udviklet til at studere fagocytose af hele døde neuroblastomceller ved iPSC-makrofager, kan analysen let tilpasses til andre laster, der er relevante for neurodegenerative sygdomme, såsom synaptosomes og myelin og andre fagocytiske celletyper.

Live-celle time-lapse billeddannelse blev udført ved hjælp af den tidligere skitserede protokol, med vilde-type iPSC-makrofager seedet på 20.000 celler pr godt. Forskellige mængder sh-SY5Ys blev anvendt (10.000-30.000 pr. samt anslået fra celletallet i trin 3.1), og fagocytosehæmmeren cytochalasin D blev præinkuberet (1 h) med nogle brønde, der fungerede som en kontrol for at hæmme fagocytose for hver mængde SH-SY5Ys. Billedbehandling begyndte 40 min efter tilsætning af SH-SY5Ys og billeder blev taget med 5 min intervaller for de næste 3 h (data omfatter den første 40 min forsinkelse). En repræsentativ time-lapse-video medtages i de supplerende dataog analyseres kvantitative data, der vises i figur 3. Med mængden af 10.000 SH-SY5Ys pr. brønd steg antallet af fagocytosed partikler (pletter) pr. celle lineært med tiden og blev hæmmet af ca. 50% af cytochalasin D. Hæmningen ved cytochalasin D var svagere end forventet, sandsynligvis forårsaget af utilstrækkelige tekniske eller biologiske replikker, da kun en brønd pr. tilstand blev afbildet med tre billedfelter. Med højere mængder af SH-SY5Ys per brønd (20.000 og 30.000), phagocytose udstillet dårlig linearitet, sandsynligvis på grund af dårlig segmentering af iPSC-makrofager og SH-SY5Ys i en mere overfyldt synsfelt.
Fast celle højindhold billeddannelse blev udført ved hjælp af den tidligere skitserede protokol, med vilde-type iPSC-makrofager på 20.000 celler pr godt, flere forskellige mængder af SH-SY5Ys (10.000-80.000 per brønd), og analysen plade blev fastsat og afbildet efter 5 timer. Et repræsentativt billede af fagocytose præsenteres i figur 4A, og de analyserede data vist i figur 4B17. Forøgelse af mængden af SH-SY5Ys resulterede i et højere antal fagocytosed partikler (pletter) pr. celle; En fordobling af SH-SY5Y-mængden fører dog kun til en stigning på 1,5x i antallet af pletter pr. celle. Dette indikerer, at de testede mængder ikke er hastighedsbegrænsende for fagocytose. Efterfølgende blev phagocytoseanalysen med højt indhold valideret ved hjælp af flere hæmmere af fagocytose (Figur 4C)17. Actin polymeriseringshæmmerne cytochalasin D og jasplakinolid hæmmede signifikant fagocytose med henholdsvis 91% og 90%, når de præinkuberes i 1 time før fagocytose. Analysens robuste Z' ved cytochalasin D eller jasplakinolid anvendes som negativ kontrol beregnes som henholdsvis 0,7 og 0,8. Lysosomeforsuringshæmmeren bafilomycin A1 reducerede phagocytose betydeligt med 31%, når den inkuberede 1 time før fagocytose. Den svagere effekt af lysosome forsuring hæmmer versus actin hæmmere tyder på, at påvisning af den internaliserede last kan ikke kræve fuld forsuring af fagocsomet. Rekombinant annexin V blev brugt som en kontrol til specifikt at blokere fosfattidylserin eksponeret på overfladen af SH-SY5Ys, forhindrer fagocytiske receptorer i at få adgang til ligand, en vigtig "eat-me" signal. Tilsætning af rekombinant annexin V reducerede phagocytose betydeligt med 30%, når den tilsættes til brønde umiddelbart før SH-SY5Y-tilsætning. Faste SH-SY5Ys blev bekræftet at eksponere fosfattidylserin ved hjælp af en fluorescerende annexin V sonde, mens levende SH-SY5Ys var negative for annexin V farvning (Figur 4D).
Den mikrogliale fagocytosereceptor TREM2 har tidligere vist sig at være vigtig for fagocytose hos apoptotiske neuroner21. R47H-mutationen af TREM2 er et risikogen for sen debut af Alzheimers sygdom og er hypotese for at reducere ligandbindingen af TREM223. Med henblik på at vurdere fagocytisk funktion af R47H TREM2 og TREM2 KO blev den fastcellede højindholds phagocytoseanalyse udført ved hjælp af isogene iPSC-makrofagslinjer med WT/R47H/KO TREM217. Flere længder af fagocytose varighed fra 1 til 5 timer blev testet, ved hjælp af en forskudt tilsætning af fagocytisk last (40.000 SH-SY5Ys). Det resulterende signal øges lineært til 4 timer og udjævnes en smule ved 5 timer (Figur 5)17. Reduceret fagocytose og kapacitet (% spot positive celler) var tydelig i TREM2 KO sammenlignet med WT, mens R47H TREM2 mutanten ikke udviste ændret fagocytose. Den fagocytiske defekt i TREM2 KO-celler er ikke phenocopied af R47H TREM2 mutation, tilsyneladende fordi TREM2-funktionen er tilstrækkelig til at understøtte normal fagocytose.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Figur 3: Eksempeldata for live-celle time-lapse phagocytosis assay. Optagelse af døde SH-SY5Ys af vilde iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) afbildet med 5 min intervaller i 3 timer. Tider, der vises på grafen, er fra indledning af fagocytose, herunder de første 40 minutter uden måling. Det gennemsnitlige antal pletter pr. celle fra tre replikat brønde er afbildet. Fagocytose på 10.000 SH-SY5Ys hæmmes med 10 μM cytochalasin D med 1 h forbehandling, mens større mængder SH-SY5Ys (20.000 og 30.000) har suboptimal kvantificering af phagocytose. Gennemsnitlig ± standardafvigelse (SD), N = 1 eksperiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Figur 4: Optimering og validering af phagocytoseanalyse med fast celleindhold. (A) Repræsentativt mikroskopibillede med højt indhold af SH-SY5Ys fagocytosed af vilde iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). En 3 timers tid-punkt med 40.000 SH-SY5Ys er vist. Fluorescenskanaler flettes, med iPSC-makrofagsplet vist som rød, kerner som blå og SH-SY5Ys som gul. Indslagspanelet er en del af billedet forstørret 3x. (B) Antallet af pletter pr. celle af fagocytosed døde SH-SY5Ys efter 5 timer ved hjælp af forskellige mængder last ud over vilde iPSC-makrofager. Gennemsnitlig ± standardfejl i middelværdien (SEM) for N = 3 høst. (C) Fagocytose (3 h) hæmmes med 10 μM cytochalasin D (Cyt), 1 μM bafilomycin A1 (Baf), 1 μM jasplakinolide (med 1 h forbehandling; Jas) og 13 μg/ml rekombinant annexin V (tilsættes samtidig til de døde SH-SY5Ys; Ann). iPSC-makrofager uden tilsat SH-SY5Ys blev brugt som et negativt kontrolelement (-ve), og det positive (+ve) kontrolelement er ubehandlet iPSC-makrofager med SH-SY5Ys tilføjet. Data blev normaliseret til middelværdi for eksperimentet gentage. Midler ± SEM, for N = 3-6 høst og med to vilde cellelinjer (SFC840-03-03, karakteriseringen af denne linje er beskrevet i (Fernandes et al.21 og BIONi010-C). 1-vejs ANOVA med Dunnetts post hoc-test, sammenligninger med ubehandlede celler. * p < 0,05, *** p < 0,001. (D) Friskfast SH-SY5Ys plet ensartet for fosfattidylserin display (annexin V-FITC) og har begrænset celle permeabilitet (propidium jod). Live SH-SY5Ys pletter ikke for annexin V-FITC eller propidium jod, bortset fra fokal farvning til stede på de få døde celler i kulturen. Figurer gengives med tilladelse fra Alzheimers Forskning &Terapi17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Figur 5: Fagocytose reduceres i TREM2 KO, men ikke i R47H TREM2 iPSC-makrofager. Højindhold fagocytose assay udført med 40.000 SH-SY5Ys per brønd med forskudte tilføjelser. Midlerne blev kvantificeret for parametrene: antal pletter pr. celle, summen af spotområder (μm2) pr. celle og procentdel af celler, der indeholder fagocytoserede partikler pr. felt. Data blev normaliseret til at betyde for hver genotype pr. eksperiment. Gennemsnitlig ± SEM, for N = 3 høst. Gentagne foranstaltninger 2-vejs ANOVA, Dunnett's post-hoc test, parvis sammenligninger med WT for hver gang: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Figurer gengives med tilladelse fra Alzheimers Forskning &Terapi17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende figur S1: Eksempel QC for SH-SY5Ys forberedelse. Dissocierede SH-SY5Ys blev fastsat i 10 min med 0% (levende celler), 1% og 2% af paraformaldehyd (PFA), derefter vasket. Cellerne blev farves med annexin V-FITC og propidium jod (PI) og straks målt ved flowcytometri. Farvetæthed prik plots blev skabt i flow cytometri analyse software, ved hjælp af enkelt-farvede og unstained kontrol til at placere en kvadrant gate. Kvadranter er kommenteret med procentdelen af begivenheder inden for denne kvadrant. Levende celler er hovedsageligt i Q4, og faste celler er hovedsageligt i Q2. Q1 = bilag I V-/PI-, Q2 = bilag I V+/PI+, Q3 = annexin V+/PI-, Q4 = annexin V-/PI- (levende celler). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende video: Live-celle time-lapse phagocytosis. Repræsentativ time-lapse video af SH-SY5Ys fagocytosed af vilde-type iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Billeder blev taget hvert 5. minut i 3 timer. Video beskæres og kører med 3 billeder i sekundet, der viser de sidste 1,5 timer i analysen. De syrefølsomme farvestofplettede SH-SY5Ys vises med rødt, signalintensiteten øges med fagosomeforsuring. Cellekerner, der er plettet med Hoechst 33342, vises med blåt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Neurodegenerative sygdomme er forbundet med dysregulerede mikrogliafunktioner. Denne artikel skitserer en in vitro assay af fagocytose af neuroblastom celler ved iPSC-makrofager. Kvantitative udlæsninger af mikroskopi er beskrevet for både live-celle time-lapse imaging og fast celle højindhold billeddannelse.

In vitro kvantitativ billeddannelse assay for phagocytose af døde neuroblastom celler ved iPSC-makrofager

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Denne in vitro imaging assay gør det muligt at kvantificere effekten af forskellige cellebehandlinger eller forskellige genotyper på mikroglial fagocytose. Ved hjælp af to celletyper, der er relevante for neurodegenerativ sygdom, bruger vi døde neuroblastomceller til den fagocytiske last, som fremstilles på en måde, der let og billigt kan skaleres op af store billedskærmer med højt indhold. I et biologisk sikkerhedsskab i klasse 2 skal du adskille SH-SY5Ys ved at aspirere mediet.Tilsæt 4 ml celle dissociation buffer, og fjern bufferen straks, så mindre end 1 ml forbliver som en tynd film belægning cellerne. Inkuber i 2 til 3 minutter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Derefter ved 10 ml HBSS til T-75 kolben.Og pipette SH-SY5Ys i en 15 ml koniske centrifuge rør. Centrifuge ved 400xG i 5 minutter. Aspirere supernatanten, og suspendere cellerne igen i 2 ml phenol rød-fri HEPES buffered medier, og sørg for at bryde op klumper før fiksering.Fastgør cellerne ved at tilsætte 2 ml 4% power formaldehyd til røret og inkubere i 10 minutter ved stuetemperatur med lejlighedsvis blid agitation. 10 ml HBSS til røret tilsættes. Derefter centrifuge ved 1200xG i 7 minutter.Aspirere supernatanten, og suspendere cellepillen igen i 2 ml phenol rødfri HEPES buffered medier. Tæl og fjern 1 million HS-SY5Y-celler i et 2 ml lavt proteinbindende rør. Bring den samlede volumen til 300 til 500 mikroliter med phenol rød-fri HEPES buffered medier.Derefter kort varme røret i en 37 grader Celsius vandbad. Rekonstruer det pH-følsomme røde fluorescerende farvestof STP ester i henhold til producentens anvisninger. Derefter tilsættes 12,5 mikrogram farvestof pr. million SH-SY5Y-celler.Bland forsigtigt ved at svirpe røret. Og inkubere røret ved stuetemperatur i 30 minutter, beskyttet mod lys. Tilsæt 1 ml HBSS og centrifuge ved 1200xG i 7 minutter og 4 grader Celsius.Kassér supernatanten. Og vask med 2 ml HBSS. Re-suspendere celle pellet i phenol rød-fri makrofag medier til en koncentration på 0,2 til 1,2 millioner celler pr ml, således at 50 mikroliter indeholder 10.000 til 60.000 celler.I et biologisk sikkerhedsskab skal du forberede en opløsning af dybrøde fluorescerende celler permeant succinimidyl esterreaktivt farvestof i makrofagmedier. Tilsæt Hoechst 33342, og varm arbejdsopløsningen til 37 grader Celsius i et vandbad. Aspirer iPSC makrofag medium forsigtigt, ved pipetter cellen supernatant med en multi-kanal pipette i et sterilt reservoir.Tilsæt 70 mikroliter pr. brønd af farveopløsningen til iPSC-makrofagerne ved hjælp af en multikanalpipette. Inkuber i 1 time ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Reparer eksperimentelle behandlinger i phenol rød-fri makrofag medier.Efter inkubationen, aspirere iPSC makrofag medium meget forsigtigt med en multi-kanal pipette, og tilsæt 100 mikroliter af HBSS per brønd. Fjern straks HBSS ved at skånsomt rør. Derefter tilføje 100 mikroliter af phenol rød-fri makrofag medier, plus eksperimentelle behandlinger i separate brønde.Inkuber i 10 minutter til 1 time ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Brug en multikanalpipette til at tilføje 50 mikroliter af de mærkede SH-SY5Ys pr. brønd fra siderne af hver brønd ved kanten af væsken. Inkuber derefter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 3 til 5 timer.Efter fagocytose inkubation, forsigtigt aspirere celle supernatants ved pipettering med en multi-kanal pipette og kassere. Vask en gang med 100 mikroliter PBS. Fastgør derefter cellerne ved at tilføje 100 mikroliter af 2% effekt formaldehyd og inkubation i 15 minutter ved stuetemperatur.Aspirere brønde og tilsæt 100 mikroliter PBS. Enten gå direkte til billeddannelse med det høje indhold mikroskop, eller dække med plade sealer og folie, og gemme pladen på 4 grader Celsius, indtil det er nødvendigt. Tænd mikroskopet billedbehandling med højt indhold, og åbn billedoptagelsessoftwaren.Læg analysepladen i mikroskopet ved at klikke på LOAD"-ikonet øverst på skærmen. Vælg fanen INSTALLATION". Vælg den relevante pladetype i rullemenuerne øverst til venstre.Den autofokuseringsindstilling:to top"Målsætningen:40x Vand, NA 1.1"Confocal"-tilstand og Binning på 1. Skyl 40x Vandmålet før brug via indstillingsmenuen. Brug plusikonet i feltet kanalvalg til at tilføje kanalerne DAPI, Alexa 647 og Alexa 568.Indstil disse til at måle på et enkelt plan på et mikrometer. Optimer tids- og effektindstillingerne for analysepladens farvningseffektivitet. Sørg for, at kanalerne ikke måles samtidigt ved at klikke på kanalsekvensen for at adskille kanalerne.Vælg brøndene til måling under navigation og definer layout, og vælg 9 til 12 felter pr. brønd. Under opsætningen skal du klikke på et repræsentativt felt på pladekortet. Og kontroller hver målekanal igen for at sikre, at farvningen er til stede, og at billederne er fokuseret ved at justere kanalforskydningen.Hvis du vil overføre dataene til en server til fjernanalyse, skal du klikke på feltet onlinejob" og det relevante skærmnavn. Gem analyseprotokollen ved at klikke på knappen Gem", og klik på fanen køreeksperiment øverst. Navngiv eksperimentet plade, så klik på start"En levende celle tid lever fagocytose assay viste, at med 10.000 SH-SY5Ys per brønd, antallet af fagocytose partikler pr celle steg lineært med tiden og blev hæmmet af ca. 50% af Cytochalasin D.Med højere mængder af SH-SY5Ys per brønd, phagocytose udstillet dårlig linearitet, sandsynligvis på grund af dårlig segmentering af iPSC, makrofager og SH-SY5Y'er i et mere overfyldt synsfelt.Følgende resultater blev opnået ved at udføre en fast celle højindhold billeddannelse, herunder dette repræsentative billede af fagocytose. Forøgelse af mængden af SH-SY5Ys resulterede i et højere antal fagocytosed partikler pr celle. Phagocytoseanalysen blev valideret ved hjælp af flere hæmmere af fagocytose.Cytochalasin D og Jasplakinolid hæmmede signifikant fagocytose med henholdsvis 91 og 90 procent. Og Bafilomycin A1 reducerede phagocytose betydeligt med 31%, når den blev inkuberet i 1 time før fagocytose. Tilsætning af rekombinant annexin 5 reducerede phagocytose betydeligt med 30%, når den tilsættes til brønde umiddelbart før SH-SY5Y-tilsætning.Fiksede at SH-SY5Ys vi er bekræftet til at afsløre Fosfattidylserin ved hjælp af en fluorescerende Annexin 5 sonde. Mens levende SH-SY5Ys var negative for annexin 5 farvning. Flere længder af fagocytose varighed, fra 1 til 5 timer, blev testet ved hjælp af forskudt tilsætning af fagocytisk last.Den samlede længde af dette protocall kan forkortes ved at forberede den fagocytiske last og farvning af iPSC makrofager parallelt. Hvis du vil gøre dette, skal du udarbejde tiderne på forhånd og bruge dine inkubationer til at forberede løsninger til de fremtidige trin.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

En kvantitativ Cell Migration Assay for Murine Enteriske Neural Progenitorer

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM og pH-følsomme GFP-prober til Evaluer Neurotransmitter Vesikel Dynamics i SH-SY5Y neuroblastomaceller: Cell Imaging og Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverførsel til Schwann-celler i Rodent iskiasnerven ved elektroporering

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Fagocytose af Myelin resterne af knoglemarv-afledte makrofager

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay udvikling for høje indhold kvantificering af Sod1 Mutant Protein samlede dannelse i levende celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

En roman In Vitro Live-imaging analyse af Astrocyte-medieret fagocytose bruger pH indikator-konjugeret Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Analysen til at studere en sammenlægning af Tau Protein og stof Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...