Name: in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

De auteurs bedanken Dr. Val Millar en Dr. Sohaib Nizami voor hun hulp bij microscopie met een hoog gehalte, en Dr. Daniel Ebner voor toegang tot de microscopen met een hoog gehalte. Verder bedanken de auteurs Dr. Emma Mead voor het advies over de ontwikkeling van testen en mevrouw Cathy Browne voor iPSC-ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Alzheimer's Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, subsidiereferentie ARUK-2020DDI-OX), met aanvullende ondersteuning voor de James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) van de Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award van Parkinson's UK (J-1403); het MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 en Momentum MC_PC_16034 Awards.

<ol>
	<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li><li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+in+the+brain:+Homeostasis+and+disease.">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).</li><li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer's+disease:+potential+therapeutic+targets.">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li><li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+live+neurons.">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li><li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia.">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding.">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).</li><li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila.">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li><li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2.">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).</li><li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets.">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li><li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages.">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li><li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Alzheimer's+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout,+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages.">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12, 151 (2020).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer's+disease+not+evident+in+mouse+models.">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li><li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+robust+Z'+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons.">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).</li><li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+&#945;-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson's+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons.">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular &#945;-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li><li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2.">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li><li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease.">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Witting, A., M&#252;ller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia/brain+macrophages+in+vitro:+Involvement+of+lectin-,+integrin-,+and+phosphatidylserine-mediated+recognition.">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li><li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia.">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li><li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease.">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).</li><li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome.">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li><li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells.">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li><li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis.">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microglia hebben belangrijke functies die de initiatie en progressie van neurodegeneratieve ziekten beïnvloeden, waaronder fagocytose van apoptotische neuronen. Verminderde microgliale fagocytose en ongepaste fagocytose van synapsen zijn beide in verband gebracht met neurodegeneratieve ziekten, hoewel de onderliggende mechanismen en causaliteit niet goed worden begrepen4,23. Dit artikel schetst een fagocytose-assay om fagocytose van apoptotische cellen te meten door iPSC-macrofagen, met ofwel een live-cell time-lapse imaging-uitlezing of fixed-cell high-content microscopie, of een combinatie van beide op een enkele assay. Deze veelzijdigheid betekent dat de test kan worden gebruikt om individuele fagocytische gebeurtenissen in de loop van de tijd in een paar putten te bestuderen of kan worden gebruikt voor screening met een hoog gehalte aan meerdere aandoeningen of behandelingen. Omdat de test met een hoog gehalte op één tijdstip is gefixeerd, kunnen meerdere testplaten tegelijkertijd worden bereid. De test met een hoog gehalte heeft potentieel nut voor het karakteriseren van macrofagen / microglia met ziekte-geassocieerde genetische varianten of het screenen van kleine molecuulremmers op veranderingen in fagocytose. De test kan ook gemakkelijk worden aangepast om fagocytose van andere microgliamodellen of mogelijk astrocyten te bestuderen. De fagocytosetest kan mogelijk worden gemultixt met levendcellige beeldvormingsvlekken, bijvoorbeeld mitochondriën, calcium of ROS-indicatoren, en post-fixatie immunofluorescente kleuring voor eiwitten-van-belang kan worden uitgevoerd. In vergelijking met bestaande fagocytose-assays die apoptotische neuronale cellen gebruiken, zijn de belangrijkste voordelen die dit protocol biedt dat de bereiding van de fagocytische lading relatief eenvoudig en snel is en resulteert in een uniform product. Andere assays induceren apoptose van neuronen of SH-SY5Ys met S-nitroso-L-cysteïne gedurende 2 h25,okadaïnezuur gedurende 3 h22,staurosporine voor 4-16 h26,27,28,29 of UV-bestraling gedurende 24 h30,en kunnen resulteren in cellen in verschillende stadia van apoptose. Bovendien zijn de live-cell imaging en high-content imaging readouts niet eerder beschreven, voor zover de auteurs weten. De belangrijkste beperking van het gebruik van paraformaldehyde-fixatie om de fagocytische lading te bereiden, is dat het het proces van apoptose niet volledig samenvat, omdat fixatie voorkomt dat de cellen zich splitsen in apoptotische lichamen, die waarschijnlijk sneller worden gefagocytoseerd vanwege hun kleinere omvang. Het is niet bekend welk effect fixatie heeft op de secretie van nucleotide "vind me" -signalen (bijv. ATP, UDP) van de doelcel die fagocyten aantrekken. Net als bij apoptotische cellen vertonen de vaste SH-SY5Ys enige membraandoorlaatbaarheid voor propidiumjodide. Membraandoorlaatbaarheid wordt geassocieerd met het vrijkomen van "vind mij" -signalen; dit is echter niet onderzocht in de vaste SH-SY5Ys, en als het nucleotide te snel vrijkomt, zouden ze worden weggespoeld voordat SH-SY5Ys worden toegevoegd aan de iPSC-macrofagen.
De eerste kritische stap in het protocol is het kleuren van dode SH-SY5Y's met een STP-ester van een pH-gevoelige rode fluorescerende kleurstof. Deze kleurstof reageert snel en covalent met vrije primaire amines op het oppervlak van de dode SH-SY5Ys. De duur van de kleuring hoeft niet te worden geoptimaliseerd; er moet echter voorzichtig worden omgegaan met het hanteren van de kleurstof voordat deze wordt gelabeld. De etiketteringsreactie mag niet worden uitgevoerd in buffers die vrije amines bevatten. Bovendien bestaat er een risico op neerslag als de DMSO-voorraad wordt verdund in een koude waterige buffer of bij een hoge eindconcentratie. Precipitaten verschijnen als dichte donkere objecten onder de microscoop. Bovendien kleeft de pH-gevoelige kleurstofoplossing aan gewone plastic centrifugebuizen en spoelt langzaam af; daarom worden laagbindende buizen aanbevolen voor de etiketteringsstap. Het gebruik van een pH-gevoelige kleurstof, in plaats van een permanent fluorescerende kleurstof, helpt bij de identificatie van overspoelde deeltjes, versus deeltjes die het plasmamembraan omsluiten. Aangezien er enige fluorescentie is bij neutrale pH, moet de dichtheid van fagocytische lading en iPSC-macrofagen laag genoeg worden gehouden voor nauwkeurige segmentatie, hoewel hoog genoeg om talrijke fagocytische gebeurtenissen te vangen. Microscopie met een hoog gehalte was in staat om fagocytose met een gemiddelde dichtheid van lading in de put nauwkeurig te identificeren (meer dan 2 SH-SY5Ys per iPSC-macrofaag). Omgekeerd, vanwege de zwakkere gevoeligheid van de microscoop in het dieprode spectrum, was segmentatie van iPSC-macrofagen in de live-cell time-lapse beeldvormingsgegevens minder zeker en was het noodzakelijk om een zeer lage dichtheid van lading te gebruiken om de kans op valse positieven te verminderen (1 SH-SY5Y voor elke twee iPSC-macrofagen). Validatie van de juiste segmentatie en ladingsdichtheid moet worden uitgevoerd met vergelijkingen tussen onbehandelde en cytochalasine D-behandelde putten. In een goed geoptimaliseerde test zou cytochalasine D het gemiddelde aantal vlekken per cel met 90% moeten verminderen ten opzichte van onbehandelde monsters.
Een andere cruciale stap in het protocol is de iPSC-macrofaagkleuring, waarmee de cel kan worden geïdentificeerd en gesegmenteerd in beeldanalyse, zodat externe SH-SY5Ys worden uitgesloten van de telling. De aanbevolen kleurstof is celpermeant, omgezet in een onoplosbaar fluorescerend product in het cytoplasma, fixeerbaar en niet-toxisch (zie Tabel met materialen). De kleuringsstap werd geoptimaliseerd voor het gebruik van iPSC-macrofagen met de high-content imaging fagocytose-test, en we stellen voor dat deze opnieuw moet worden geoptimaliseerd als andere celtypen worden gebruikt. De duur van celkleuring kan worden verhoogd om de afzetting van het onoplosbare fluorescerende product in cellen te verbeteren. Als de kleurstofconcentratie is geoptimaliseerd, moet ervoor worden gezorgd dat toxische niveaus van het organische oplosmiddel worden vermeden.
De derde kritische factor voor het succes van de assay is de data-analyse. De verstrekte analysepijplijnen zijn bedoeld als leidraad in plaats van prescriptief, omdat verschillen in kleuringsintensiteit of celmorfologie de effectiviteit van segmentatie van de pijpleidingen zoals geschreven kunnen verminderen. Er zullen daarom enkele optimalisaties nodig zijn, waarbij de pijplijn wordt getest op de juiste positieve en negatieve controles, en de parameters die moeten worden geoptimaliseerd, worden aangegeven in de protocoltekst. Negatieve controles moeten een aandoening omvatten waarbij iPSC-macrofagen worden voorbehandeld met een krachtige fagocytoseremmer zoals cytochalasine D vóór toevoeging van SH-SY5Ys. Een andere mogelijke negatieve controle is de toevoeging van de SH-SY5Ys aan eerder onbehandelde putten van iPSC-macrofagen aan het einde van de test, 10 minuten voor de fixatie, waardoor enige bezinking van de lading mogelijk is, maar te kort is voor een merkbare hoeveelheid fagocytose. Een fagocytosegebeurtenis wordt gedefinieerd als een rood-fluorescerend object binnen de grenzen van een iPSC-macrofaag, gedefinieerd door het softwarealgoritme met behulp van het dieprode fluorescentiekanaal. Als de segmentatie van de cellen slecht is(figuur 2),kunnen veel niet-gefagocyteerde SH-SY5Y's in de nabijheid van iPSC-macrofagen ten onrechte in de analyse worden opgenomen, d.w.z. vals-positieven. De belangrijkste factor bij het bereiken van een goede segmentatie is een strikte afbakening van de iPSC-macrofagen. Segmentatie voor beide analyses is geautomatiseerd, dus het is niet mogelijk om perfecte segmentatie voor elke cel te verkrijgen; er kunnen echter enkele parameters worden aangepast om de segmentatie optimaler te maken, met behulp van enkele testafbeeldingen als referentie. De cytochalasine D-controle is belangrijk voor het beoordelen van optimale segmentatie omdat een groot aantal fagocytische gebeurtenissen die in deze aandoening worden gedetecteerd, aangeeft dat de segmentatie suboptimaal is. Optimalisatie van de data-analysepijplijn moet idealiter worden herhaald totdat het aantal fagocytische gebeurtenissen per cel 80% -90% lager is in de cytochalasine D-conditie versus geen remmer.
De problemen met de fagocytosetest die het meest waarschijnlijk optreden zijn: (1) zwakke pH-gevoelige fluorescentie in positieve controles, (2) schaarse of ongelijke verdeling van macrofagen aan het einde van de test, of (3) hoge aantallen vals-positieven in de analyse van niet-fagocytosed SH-SY5Ys. Het oplossen van problemen met zwakke pH-gevoelige fluorescentie moet eerst controleren of kleuring van de SH-SY5Ys resulteerde in een celkorrel met een sterke magentakleur. Als de kleur zwak is, zorg er dan voor dat een verse kleurstofvoorraad wordt gebruikt, zorg ervoor dat de etiketteringsbuffer aminevrij is, voeg een extra was toe aan de SH-SY5Ys voor het kleuren, controleer of het juiste aantal SH-SY5Ys is gekleurd, zorg ervoor dat er geen kleurstofprecipitaten zichtbaar zijn en optimaliseer de etiketteringsconcentratie van de kleurstof. Als de SH-SY5Ys sterk gekleurd zijn, controleer dan of de concentratie die aan de testplaat is toegevoegd correct is en zorg ervoor dat de iPSC-macrofagen gezond en niet te oud zijn. Het tweede type probleem, ongelijke macrofaagverdeling, kan het gevolg zijn van verlies van cellen tijdens het pipetteren en er moeten stappen worden ondernomen om de pipetteerkrachten die door de cellen worden ervaren te verminderen, waarbij smalle boringspunten worden vermeden. Als het probleem zich blijft, verminder dan de incubatietijd van het laden van de iPSC-macrofagen met celpermeante kleurstof. Het derde probleem, met betrekking tot het foutief opnemen van niet-fagocytosed deeltjes in de analyse, geeft aan dat meer optimalisatie van de analysepijplijn nodig is. Probleemoplossing moet zich in de eerste plaats richten op celsegmentatie en of de software aangrenzende objecten opneemt. Specifieke parameters die kunnen worden aangepast, worden voorgesteld in de opmerkingen onder de relevante stappen (stappen 6.1.11-6.1.15 voor de live-cell time-lapse-analyse en stappen 6.2.4-6.2.8 voor de analyse met een hoog gehalte). Als de celsegmentatie niet verder kan worden verbeterd, heeft de analyse met een hoog gehalte een extra stap (stap 6.2.8) die onjuist gesegmenteerde iPSC-macrofagen uitsluit. Bovendien kan de module die geaccepteerde vlekken van pH-gevoelige fluorescentie binnen iPSC-macrofagen filtert, worden geoptimaliseerd, waardoor de drempelintensiteit van geaccepteerde objecten wordt verhoogd, wat zou moeten helpen om niet-fagocytosed SH-SY5Ys uit te sluiten (stap 6.1.17 voor de live-cell time-lapse-analyse en stap 6.2.11 voor de high-content analyse).
We ontwikkelden twee soorten microscopie-uitlezing voor de fagocytose-test die elk voordelen en beperkingen hebben. Live-cell time-lapse beeldvorming heeft de voordelen van het verstrekken van extra informatie over fagocytosekinetiek en is breder beschikbaar dan high-content beeldvormingsplatforms. De aanbevolen open-source software is agnostisch voor de microscoopbron en kan worden gebruikt met elke fluorescerende microscoop van goede kwaliteit, met of zonder live-cell time-lapse-mogelijkheid. De belangrijkste beperking van de live-cell imaging is beperkte gevoeligheid en optica, die het uitdagender maken om goede segmentatie van iPSC-macrofagen te detecteren en uit te voeren. Deze beperking kan worden verzacht door de duur van iPSC-macrofaagkleuring te verhogen of door over te schakelen naar een gevoeligere microscoop, indien beschikbaar. De high-content imaging fagocytose assay is de aanbevolen uitlezing als er een high-content imaging systeem beschikbaar is. Beeldvormingssystemen met een hoog gehalte maken een hogere doorvoer en betrouwbaardere gegevens mogelijk, waardoor deze test kan worden gebruikt voor screening, waarbij een robuuste Z ' van ≥ 0,7 zou worden verwacht voor het "aantal vlekken per cel" output20. In vergelijking met de live-cell time-lapse-methode heeft de high-content microscopie-uitlezing een hogere gevoeligheid, een hogere mate van automatisering en snelheid, kunnen meer putten en beeldvormende velden worden verwerkt en worden confocale beelden met een hoge resolutie geproduceerd. Celsegmentatie is effectiever met goede beelden en segmentatie wordt bovendien geholpen door de software voor beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte die meer celsegmentatiemethoden biedt die geschikt zijn voor zeer onregelmatig gevormde cellen. De high-content imaging analyse software berekende ook meer parameters van fagocytose, vergeleken met de open-source software, zoals het percentage fagocytische cellen. De belangrijkste beperking van de fagocytosetest met een hoog gehalte is er een van kosten en toegankelijkheid van het beeldvormingssysteem en de analysesoftware.
Kortom, de kwantitatieve fagocytose-assay die in dit artikel wordt gepresenteerd, is een nuttig hulpmiddel voor het modelleren van microglia fagocytose van dode neuronen in vitro. De microglia worden gemodelleerd door iPSC-macrofagen en de dode neuronen worden gemodelleerd door paraformaldehyde-gefixeerde SH-SY5Ys. Hoewel niet de meest authentieke microglia en dode / apoptotische neuronmodellen gepubliceerd, zijn deze gemakkelijk te bereiden en schaalbaar. De test zelf is zeer veelzijdig, met twee soorten beelduitlezing gedetailleerd, en het heeft potentieel om te worden aangepast voor gebruik met verschillende microglia / macrofaag monocultuurmodellen, of een ander celtype om als de fagocytische lading te fungeren. De high-content imaging-uitlezing is voordelig voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens en kan worden opgeschaald om kleine molecuulmodulatoren van fagocytose te testen, of genetische varianten in de iPSC-macrofagen te screenen. Omdat beeldvormingssystemen met een hoog gehalte echter duur en gegevensrijk zijn, is een alternatieve beelduitlezing in het protocol opgenomen met behulp van een live-cell time-lapse-microscoop, die indien nodig kan worden vervangen door een conventionele fluorescentiemicroscoop van goede kwaliteit.

Microglia zijn macrofagen die in hersenweefsel wonen en hun functies omvatten immuunsurveillance, het coördineren van ontstekingsreacties op letsel / infectie, synaptische remodellering en fagocytose van dode cellen, myeline, eiwitaggregaten en pathogenen. Fagocytose is het proces waarbij microglia lading herkennen met oppervlaktereceptoren en hun cytoskelet reorganiseren om het object te verzwelgen tot een fagosoom, dat vervolgens fuseert met lysosomen voor degradatie van de lading. Gezonde microglia fagocytose apoptotische hersencellen om ze te verwijderen voordat ze necrotisch worden1. De fagocytose van apoptotische cellen is ook bekend als efferocytose en vereist de weergave van een fosfatidylserine "eet-me" -signaal door de stervende cel2. Talrijke microgliareceptoren binden direct aan fosfatidylserine, waaronder TIM-4, BAI1, Stabilin-2 en TREM2. Microgliale TAM-receptoren (bijv. MERTK) en integrinen binden indirect aan fosfatidylserine, met behulp van respectievelijk accessoire-eiwitten GAS6 of MFG-E8. Andere "eet-me" -signalen kunnen nodig zijn voor herkenning van stervende cellen, deze omvatten veranderingen in glycosylatie of lading van oppervlakte-eiwitten; expressie van intracellulaire eiwitten ICAM3, calreticuline, annexine-I aan het celoppervlak; geoxideerd LDL; of coating van de apoptotische cel door microglia-geproduceerd complement C1q1,2.
Neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer, frontotemporale dementie en amyotrofische laterale sclerose zijn in verband gebracht met een aantasting van de microgliafunctie, waaronder een opeenhoping van hersenafvalproducten zoals dode cellen, myelinefragmenten en eiwitaggregaten, en overdreven ontstekingsreacties op deze stimuli3. Fagocytose kan worden aangetast bij neurodegeneratieve ziekten en bijdragen aan de pathologie, als gevolg van een combinatie van veroudering, ontsteking of specifieke genetische risicovarianten4,5. Aan de andere kant is er ook bewijs uit diermodellen van neurodegeneratieve ziekten dat microglia ten onrechte levensvatbare neuronen of synapsen kunnen fagocytosen6,7,8. Het mechanisme wordt waarschijnlijk geïnstigeerd door fosfatidylserineweergave van beschadigde neurieten, die direct wordt gevoeld door microgliale fagocytosereceptoren TREM2 of GPR56, of indirect wordt gevoeld door oplosbaar complement C1q dat het fosfatidylserine-verrijkte membraan bedekt, wat leidt tot CR3-gemedieerde fagocytose9,10,11.
In vitro assays van fagocytosefunctie, bijvoorbeeld om de fenotypische impact van een genetische risicovariant in microglia te beoordelen, worden vaak uitgevoerd met behulp van niet-fysiologische ladingen zoals latexparels4. Fluorescerend gelabelde bacteriën en zymosan worden ook gebruikt, die fysiologisch zijn maar niet relevant voor neurodegeneratieve ziekten. Niet-fysiologische fagocytische ladingen kunnen worden gebruikt om defecten in de basismachinerie van fagocytische overspoeling te detecteren, maar slagen er niet in om de eerste "herkenningsstap" in fagocytose van apoptotische neuronen nauwkeurig te modelleren. De grootte, vorm, stijfheid en het type lading dicteren ook de intracellulaire signaalroutes die worden geactiveerd, wat leidt tot verschillende uitkomsten van de activeringstoestand van microglia. E.coli-bacteriën zijn bijvoorbeeld klein en stijf, in tegenstelling tot menselijke cellen, en de lipopolysacchariden op hun oppervlak worden herkend door Toll-like receptor 4 (TLR4) die fagocytose en pro-inflammatoire signaalroutesactiveert 2,12.
In de context van neurodegeneratieve ziektestudies zou een meer relevante fagocytische lading fosfatidylserine-weergave hebben op plasmamembranen van zoogdieren, en idealiter menselijk en neuronaal zijn, om signalen op te nemen die microglia waarschijnlijk zullen tegenkomen. Voor dit fagocytoseprotocol werd de menselijke neuroblastoomcellijn SH-SY5Y gekozen als een neuronmodel dat gemakkelijk te culturen is. Permanente oppervlaktefosfatidylserineweergave werd kunstmatig geïnduceerd door paraformaldehyde, waarvan eerder is aangetoond dat het fosfatidylserine-weergave van bloedplaatjesveroorzaakt 13. Voor het microgliacelmodel werden menselijke iPSC-macrofagen gebruikt, die het ontogenie- en transcriptieprofiel van menselijke microglia nabootsen en fagocytisch competent zijn14,15,16,17. iPSC-macrofagen zijn niet het meest authentieke microgliamodel dat beschikbaar is, ze bootsen bijvoorbeeld geen microgliamorfologie na; men kan het echter vervangen door een meer authentiek monocultuur iPSC-model van microglia indien gewenst, zoals Haenseler et al.15. Menselijke iPSC-modellen hebben de voorkeur boven primaire knaagdiermicroglia voor het bestuderen van neurodegeneratie, vanwege bezorgdheid over de beperkte overlap van de microglia-transcriptionele modules waargenomen in neurodegeneratieve ziekteweefsels van mens versus muis18. De dode SH-SY5Y's zijn gekleurd met een zuurgevoelige kleurstof die zwak fluoresceert bij neutrale pH en sterker in de fagolysosomen van iPSC-macrofagen na fagocytose. Het gebruik van een zuurgevoelige kleurstof verbetert de nauwkeurigheid van het detecteren van fagocytische gebeurtenissen, met veelzijdigheid voor verschillende uitlezingen van levende en vaste macrofagen19. Dit protocol schetst zowel live-cell time-lapse beeldvorming van fagocytose, als een vaste high-content imaging assay voor fagocytose, met dezelfde celvoorbereidingsstappen voorafgaand aan de uitlezing(Figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Figuur 1: Schematisch schema van de methodologie. Omtrek van de fagocytosetest, waarbij de bereiding van de SH-SY5Ys en kleuring van de iPSC-macrofagen parallel wordt uitgevoerd en vervolgens de SH-SY5Ys op de iPSC-macrofagen worden gepipteerd. Ofwel wordt live-cell time-lapse imaging onmiddellijk uitgevoerd, ofwel worden de cellen geïncubeerd bij 37 °C/5% CO2 voor de vereiste duur en gefixeerd voordat microscopie met een hoog gehalte wordt uitgevoerd. PFA: paraformaldehyde, HBM: fenol roodvrije HEPES-gebufferde media, pHr: pH-gevoelige rode fluorescerende kleurstof STP Ester oplossing, PRFMM: fenol roodvrije macrofaag media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>For centrifugation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L, 20-200 &#181;L, 100-1000 &#181;L single-channel micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Component of Factory media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>For fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell-800 24-well plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34815</td>
			<td>Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14085</td>
			<td>Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 &#956;M, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 laminar air flow safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, set to 37&#176;C and 5 % CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image Data Storage and Analysis System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11330</td>
			<td>Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20&#176;C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320074</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for CellTracker and pHrodo dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>Live-cell time-lapse imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube CY5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4656</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4650</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube RFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 10-547F</td>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant BMP4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-3</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC0033</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant VEGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein binding 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108.132</td>
			<td>For staining SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC9501</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel 20-200 uL pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For liquid handling of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td>High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36011</td>
			<td>pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 &#956;L (12.5 &#956;g) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette filler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as &#34;Factories&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for SH-SY5Y culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealers</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676001</td>
			<td>For assay plate storage and transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, set to 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418F</td>
			<td>Component of Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-744Q</td>
			<td>Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages

Microglia orkestreren neuro-immuunreacties bij verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer. Microglia ruimen dode en stervende neuronen op door het proces van efferocytose, een gespecialiseerde vorm van fagocytose. De fagocytosefunctie kan worden verstoord door omgevings- of genetische risicofactoren die microglia beïnvloeden. Dit artikel presenteert een snel en eenvoudig in vitro microscopieprotocol voor het bestuderen van microgliale efferocytose in een geïnduceerd pluripotent stamcelmodel (iPSC) van microglia, met behulp van een menselijke neuroblastoomcellijn (SH-SY5Y) gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof voor de fagocytische lading. De procedure resulteert in een hoge opbrengst van dode neuroblastoomcellen, die oppervlaktefosfatidylserine vertonen, herkend als een "eet-me" -signaal door fagocyten. De 96-well plaattest is geschikt voor live-cell time-lapse imaging, of de plaat kan met succes worden gefixeerd voorafgaand aan verdere verwerking en gekwantificeerd door microscopie met een hoog gehalte. Fixed-cell high-content microscopie maakt het mogelijk om de test op te schalen voor screening van kleine molecuulremmers of het beoordelen van de fagocytische functie van genetische variant iPSC-lijnen. Hoewel deze test is ontwikkeld om fagocytose van hele dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen te bestuderen, kan de test gemakkelijk worden aangepast voor andere ladingen die relevant zijn voor neurodegeneratieve ziekten, zoals synaptosomen en myeline, en andere fagocytische celtypen.

Live-cell time-lapse beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van het eerder geschetste protocol, met wild-type iPSC-macrofagen gezaaid op 20.000 cellen per put. Verschillende hoeveelheden SH-SY5Ys werden toegepast (10.000-30.000 per put zoals geschat op basis van het celgetal in stap 3.1), en de fagocytoseremmer cytochalasine D werd voorgeïncubeerd (1 uur) met enkele putten, die fungocytose voor elke hoeveelheid SH-SY5Ys fungocytose. Beeldvorming begon 40 minuten na de toevoeging van SH-SY5Ys en beelden werden vastgelegd met intervallen van 5 minuten voor de volgende 3 uur (gegevens omvatten de initiële vertraging van 40 minuten). Een representatieve time-lapse video is opgenomen in de aanvullende gegevensen geanalyseerd kwantitatieve gegevens weergegeven in figuur 3. Met de hoeveelheid van 10.000 SH-SY5Ys per put nam het aantal fagocytosed deeltjes (vlekken) per cel lineair toe met de tijd en werd het met ongeveer 50% geremd door cytochalasine D. De remming door cytochalasine D was zwakker dan verwacht, hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt door onvoldoende technische of biologische replicaties, aangezien slechts één put per aandoening in beeld werd gesteld met drie beeldvelden. Met hogere hoeveelheden SH-SY5Ys per put (20.000 en 30.000) vertoonde fagocytose een slechte lineariteit, waarschijnlijk als gevolg van slechte segmentatie van iPSC-macrofagen en SH-SY5Ys in een drukker gezichtsveld.
Fixed-cell high-content imaging werd uitgevoerd met behulp van het eerder geschetste protocol, met wild-type iPSC-macrofagen bij 20.000 cellen per put, verschillende hoeveelheden SH-SY5Ys (10.000-80.000 per put), en de testplaat werd na 5 uur gefixeerd en in beeld gebracht. Een representatief beeld van fagocytose wordt weergegeven in figuur 4Aen de geanalyseerde gegevens in figuur 4B17. Het verhogen van de hoeveelheid SH-SY5Ys resulteerde in een hoger aantal fagocytosed deeltjes (vlekken) per cel; een verdubbeling van de SH-SY5Y-hoeveelheid leidt echter slechts tot een toename van 1,5x van het aantal vlekken per cel. Dit geeft aan dat de geteste hoeveelheden niet snelheidsbeperkend zijn voor fagocytose. Vervolgens werd de high-content imaging fagocytose assay gevalideerd met behulp van verschillende remmers van fagocytose (Figuur 4C)17. De actinepolymerisatieremmers cytochalasine D en jasplakinolide remden fagocytose significant met respectievelijk 91% en 90% wanneer ze gedurende 1 uur voorafgaand aan fagocytose werden geprecubeerd. De robuuste Z' van de test wanneer cytochalasine D of jasplakinolide als negatieve controle worden gebruikt, wordt berekend als 0,7 en 0,8, respectievelijk20. De lysosoomverzuringsremmer bafilomycine A1 verminderde fagocytose aanzienlijk met 31%, wanneer geïncubeerd 1 uur voorafgaand aan fagocytose. Het zwakkere effect van de lysosoomverzuringsremmer versus actineremmers suggereert dat detectie van de geïnternaliseerde lading mogelijk geen volledige verzuring van het fagosoom vereist. Recombinant annexine V werd gebruikt als een controle om specifiek fosfatidylserine blootgesteld aan het oppervlak van SH-SY5Ys te blokkeren, waardoor fagocytische receptoren geen toegang krijgt tot het ligand, een belangrijk "eet-me" -signaal. Toevoeging van recombinant annexine V verminderde fagocytose aanzienlijk met 30%, wanneer toegevoegd aan putten onmiddellijk vóór SH-SY5Y-toevoeging. Vaste SH-SY5Y's werden bevestigd om fosfatidylserine bloot te leggen, met behulp van een fluorescerende annexine V-sonde, terwijl levende SH-SY5Y's negatief waren voor annexine V-kleuring(figuur 4D).
De microgliale fagocytosereceptor TREM2 is eerder belangrijk gebleken voor fagocytose van apoptotische neuronen21. De R47H-mutatie van TREM2 is een risicogen voor het late begin van de ziekte van Alzheimer en wordt verondersteld ligandbinding van TREM223te verminderen. Met het oog op de beoordeling van de fagocytische functie van R47H TREM2 en TREM2 KO, werd de fagocytosetest met een vast celgehalte uitgevoerd met behulp van isogene iPSC-macrofaaglijnen met WT / R47H / KO TREM217. Verschillende lengtes van fagocytoseduur van 1 tot 5 uur werden getest, met behulp van een gespreide toevoeging van fagocytische lading (40.000 SH-SY5Ys). Het resulterende signaal neemt lineair toe tot 4 uur en vlakt iets af bij 5 uur (figuur 5)17. Verminderde fagocytosesnelheid en -capaciteit (% spotpositieve cellen) was duidelijk in de TREM2 KO in vergelijking met WT, terwijl de R47H TREM2-mutant geen veranderde fagocytose vertoonde. Het fagocytische defect in TREM2 KO-cellen wordt niet gefenocopieerd door de R47H TREM2-mutatie, schijnbaar omdat de TREM2-functie voldoende is om normale fagocytose te ondersteunen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Figuur 3: Voorbeeldgegevens voor live-cell time-lapse fagocytose assay. Opname van dode SH-SY5Ys door wild-type iPSC-macrofagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) afgebeeld met intervallen van 5 minuten gedurende 3 uur. De tijden die op de grafiek worden weergegeven, zijn vanaf het begin van fagocytose, inclusief de eerste 40 minuten zonder meting. Het gemiddelde aantal vlekken per cel uit drie repliceerputten wordt uitgezet. Fagocytose van 10.000 SH-SY5Ys wordt geremd met 10 μM cytochalasine D met 1 uur voorbehandeling, terwijl hogere hoeveelheden SH-SY5Ys (20.000 en 30.000) suboptimale kwantificering van fagocytose hebben. Gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), N = 1 experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Figuur 4: Optimalisatie en validatie van fagocytosetest met een vast celgehalte met een hoog gehalte. (A) Representatief microscopiebeeld met hoog gehalte van SH-SY5Ys fagocytosed door wild-type iPSC-macrofagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Een 3 uur tijdspunt met 40.000 SH-SY5Ys wordt getoond. Fluorescentiekanalen worden samengevoegd, waarbij iPSC-macrofaagvlek als rood wordt weergegeven, kernen als blauw en SH-SY5Ys als geel. Het inzetpaneel is een gedeelte van het beeld dat 3x wordt vergroot. (B) Het aantal vlekken per cel van fagocytosed dode SH-SY5Ys na 5 uur, met behulp van verschillende hoeveelheden ladingtoevoeging aan wild-type iPSC-macrofagen. Gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM), voor N = 3 oogsten. (C)Fagocytose (3 h) wordt geremd met 10 μM cytochalasine D (Cyt), 1 μM bafilomycine A1 (Baf), 1 μM jasplakinolide (met 1 uur voorbehandeling; Jas) en 13 μg/ml recombinant annexine V (gelijktijdig toegevoegd aan de dode SH-SY5Ys; Ann). iPSC-macrofagen zonder toegevoegde SH-SY5Y's werden gebruikt als een negatieve controle (-ve), en de positieve (+ve) controle is onbehandelde iPSC-macrofagen met SH-SY5Ys toegevoegd. Gegevens werden genormaliseerd tot het gemiddelde voor de herhaling van het experiment. Betekent ± SEM, voor N = 3-6 oogsten en met twee wild-type cellijnen (SFC840-03-03, de karakterisering van deze lijn wordt beschreven in (Fernandes et al.21 en BIONi010-C). 1-weg ANOVA met Dunnett's post-hoc test, vergelijkingen met onbehandelde cellen. *p < 0,05, ***p < 0,001. (D) Vers gefixeerde SH-SY5Ys kleuren gelijkmatig voor fosfatidylserineweergave (annexine V-FITC) en hebben een beperkte celdoorlaatbaarheid (propidiumjodide). Levende SH-SY5Y's vlekken niet op annexine V-FITC of propidiumjodide, behalve focale kleuring die aanwezig is op de weinige dode cellen in cultuur. Cijfers zijn gereproduceerd met toestemming van Alzheimer's Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Figuur 5: Fagocytose is verminderd in TREM2 KO maar niet in R47H TREM2 iPSC-macrofagen. Fagocytosetest met hoog gehalte uitgevoerd met 40.000 SH-SY5Ys per put met gespreide toevoegingen. Voor de parameters werden middelen gekwantificeerd: aantal vlekken per cel, som van de spotgebieden(μm 2) per cel en percentage cellen dat fagocytosed deeltjes per veld bevat. Gegevens werden genormaliseerd tot gemiddelde voor elk genotype per experiment. Gemiddelde ± SEM, voor N = 3 oogsten. Herhaalde metingen 2-weg ANOVA, Dunnett's post-hoc test, paarsgewijze vergelijkingen met de WT voor elke keer: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Cijfers zijn gereproduceerd met toestemming van Alzheimer's Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur S1: Voorbeeld QC voor SH-SY5Ys voorbereiding. Gedissocieerde SH-SY5Y's werden gedurende 10 minuten gefixeerd met 0% (levende cellen), 1% en 2% paraformaldehyde (PFA) en vervolgens gewassen. Cellen werden gekleurd met annexine V-FITC en propidiumjodide (PI) en onmiddellijk gemeten met flowcytometrie. Kleurdichtheid dot plots werden gemaakt in flowcytometrie analyse software, met behulp van de single-stained en unstained controles om een kwadrant poort te plaatsen. Kwadranten worden geannoteerd met het percentage gebeurtenissen binnen dat kwadrant. Levende cellen bevinden zich voornamelijk in Q4 en vaste cellen bevinden zich voornamelijk in Q2. Q1 = annexine V-/PI-, Q2 = annexine V+/PI+, Q3 = annexine V+/PI-, Q4 = annexine V-/PI- (levende cellen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende video: Live-cell time-lapse fagocytose. Representatieve time-lapse video van SH-SY5Ys fagocytosed door wild-type iPSC-macrofagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Er werden elke 5 minuten gedurende 3 uur foto's gemaakt. Video wordt bijgesneden en draait met 3 frames per seconde, waarbij de laatste 1,5 uur van de test wordt weergegeven. De zuurgevoelige kleurstof-gekleurde SH-SY5Ys worden weergegeven in rood, signaalintensiteit neemt toe met fagosoomverzuring. Celkernen gekleurd met Hoechst 33342 zijn blauw weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Neurodegeneratieve ziekten worden geassocieerd met ontregelde microgliafuncties. Dit artikel schetst een in vitro test van fagocytose van neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen. Kwantitatieve microscopie-uitleingen worden beschreven voor zowel live-cell time-lapse imaging als fixed-cell high-content imaging.

In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Deze in vitro imaging assay maakt het mogelijk om het effect van verschillende celbehandelingen of verschillende genotypen op microgliale fagocytose te kwantificeren. Met behulp van twee celtypen die relevant zijn voor neurodegeneratieve ziekten, gebruiken we dode neuroblastoomcellen voor de fagocytische lading, die worden bereid op een manier die gemakkelijk en goedkoop kan worden opgeschaald door grote beeldvormingsschermen met een hoog gehalte. Dissociëer SH-SY5Ys in een biologische veiligheidskast van klasse 2 door het medium aan te zuigen.Voeg 4 ml celdissociatiebuffer toe en verwijder de buffer onmiddellijk, zodat er minder dan 1 ml overblijft als een dunne film die de cellen bedekt. Incubeer gedurende 2 tot 3 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vervolgens bij 10 ml HBSS in de T-75 kolf.En pipetteer de SH-SY5Ys in een conische centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer op 400xG gedurende 5 minuten. Aspirateer het supernatant en suspensie de cellen opnieuw in 2 ml fenol roodvrije HEPES gebufferde media, zorg ervoor dat klonten worden gebroken voordat ze worden gefixeerd.Fixeer de cellen door 2 ml 4% power formaldehyde aan de buis toe te voegen en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te broeden met af en toe zacht roeren. Voeg 10 ml HBSS toe aan de tube. Centrifugeer vervolgens gedurende 7 minuten bij 1200xG.Aspirateer het supernatant en suspensie de celkorrel opnieuw in 2 ml fenol roodvrije HEPES gebufferde media. Tel en verwijder 1 miljoen HS-SY5Y-cellen in een 2 ml laag eiwitbindende buis. Breng het totale volume op 300 tot 500 microliter met fenolrode HEPES gebufferde media.Verwarm de buis vervolgens kort in een waterbad van 37 graden Celsius. Reconstitueer de pH-gevoelige rode fluorescerende kleurstof STP-ester volgens de instructies van de fabrikant. Voeg vervolgens 12,5 microgram kleurstof per miljoen SH-SY5Y-cellen toe.Meng zachtjes door op de buis te vegen. En incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht. Voeg 1 ml HBSS toe en centrifugeer bij 1200xG gedurende 7 minuten en 4 graden Celsius.Gooi het supernatant weg. En wassen met 2 ml HBSS. Suspensie van de celkorrel in fenolrode macrofaagmedia opnieuw tot een concentratie van 0,2 tot 1,2 miljoen cellen per ml, zodat 50 microliter 10.000 tot 60.000 cellen bevat.Bereid in een biologische veiligheidskast een oplossing van dieprood fluorescerende celpermeant succinimidylester-reactieve kleurstof in macrofaagmedia. Voeg Hoechst 33342 toe en verwarm de werkoplossing tot 37 graden Celsius in een waterbad. Aspirateer het iPSC macrofaagmedium voorzichtig op door het celsupernatant met een meerkanaalspipet in een steriel reservoir te pipetteren.Voeg 70 microliter per putje van de kleurstofoplossing toe aan de iPSC-macrofagen met behulp van een meerkanaalspipet. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Herstel experimentele behandelingen in fenolrode macrofaagmedia.Adem na de incubatie het iPSC-macrofaagmedium heel voorzichtig op met een meerkanaalspipet en voeg 100 microliter HBSS per put toe. Verwijder HBSS onmiddellijk door zachtjes te pipetteren. Voeg vervolgens 100 microliter fenol roodvrije macrofaagmedia toe, plus experimentele behandelingen in afzonderlijke putten.Incubeer gedurende 10 minuten tot 1 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Gebruik een meerkanaalspipet om 50 microliter van de gelabelde SH-SY5Ys per put toe te voegen vanaf de zijkanten van elke put aan de rand van de vloeistof. Incubeer vervolgens bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 3 tot 5 uur.Na de fagocytose-incubatie, aspirateer voorzichtig celsupernatanten door pipetteren met een meerkanaalspipet en weggooien. Eén keer wassen met 100 microliter PBS. Fixeer vervolgens de cellen door 100 microliter 2% formaldehyde toe te voegen en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te broeden.Aspirateer putten en voeg 100 microliter PBS toe. Ga direct over tot beeldvorming met de microscoop met een hoog gehalte, of dek af met plaatsealer en folie en bewaar de plaat bij 4 graden Celsius, totdat deze nodig is. Schakel de beeldmicroscoop met hoog gehalte in en open de software voor het vastleggen van afbeeldingen.Laad de testplaat in de microscoop door op het load-pictogram boven aan het scherm te klikken. Selecteer het tabblad SETUP. Selecteer in de vervolgkeuzemenu's linksboven het juiste plaattype.De autofocus optie: twee piek "Het objectief: 40x Water, NA 1.1 "Confocal"-modus en Binning van 1. Spoel de 40x Water objective voor gebruik door via het instellingenmenu. Gebruik in het kanaalselectievak het pluspictogram om de kanalen DAPI, Alexa 647 en Alexa 568 toe te voegen.Stel deze in op een enkel vlak van één micrometer. Optimaliseer tijd- en vermogensinstellingen voor de kleurefficiëntie van de testplaat. Zorg ervoor dat de kanalen niet tegelijkertijd worden gemeten door op kanaalvolgorde te klikken om de kanalen te scheiden.Selecteer onder navigatie en lay-out definiëren de meetputten en selecteer 9 tot 12 velden per put. Klik tijdens het instellen op een representatief veld op de plaatkaart. En controleer elk meetkanaal op zijn beurt om er zeker van te zijn dat de kleuring aanwezig is en dat de beelden worden scherpgesteld door de kanaalverschuiving aan te passen.Om de gegevens naar een server te uploaden voor analyse op afstand, klikt u op het vak online vacatures en de relevante schermnaam. Sla het testprotocol op door op de knop Opslaan te klikken en klik bovenaan op het tabblad Experiment uitvoeren. Noem de experimentplaat en klik vervolgens op start"Een live cell time lives fagocytose-test toonde aan dat met 10.000 SH-SY5Ys per put het aantal fagocytosedeeltjes per cel lineair toenam met de tijd en met ongeveer 50% werd geremd door Cytochalasine D.Met hogere hoeveelheden SH-SY5Ys per put vertoonde fagocytose een slechte lineariteit, waarschijnlijk als gevolg van slechte segmentatie van iPSC, macrofagen en SH-SY5Ys in een drukker gezichtsveld.De volgende resultaten werden verkregen door het uitvoeren van een beeldvorming met een hoog gehalte aan vaste cellen, inclusief dit representatieve beeld van fagocytose. Het verhogen van de hoeveelheid SH-SY5Ys resulteerde in een hoger aantal fagocytosed deeltjes per cel. De fagocytosetest werd gevalideerd met behulp van verschillende remmers van fagocytose.Cytochalasine D en Jasplakinolide remden fagocytose significant met respectievelijk 91 en 90 procent. En Bafilomycine A1 verminderde fagocytose aanzienlijk met 31% wanneer het gedurende 1 uur voorafgaand aan fagocytose werd voorgebrokt. Toevoeging van recombinant Annexin 5 verminderde fagocytose aanzienlijk met 30% wanneer toegevoegd aan putten onmiddellijk vóór SH-SY5Y-toevoeging.Vaste SH-SY5Ys we zijn bevestigd om fosfatidylserine bloot te stellen met behulp van een fluorescerende Annexin 5-sonde. Terwijl levende SH-SY5Y's negatief waren voor Annexin 5-kleuring. Verschillende lengtes van fagocytoseduur, van 1 tot 5 uur, werden getest met behulp van gespreide toevoeging van fagocytische lading.De totale lengte van deze protocall kan worden verkort door de fagocytische lading voor te bereiden en de iPSC-macrofagen parallel te kleuren. Als u dit wilt doen, werkt u de timing van tevoren uit en gebruikt u uw incubaties om oplossingen voor de toekomstige stappen voor te bereiden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverdracht naar Schwann cellen in het knaagdier heupzenuw door elektroporatie

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay ontwikkeling voor hoge inhoud kwantificering van Sod1 Mutant eiwit statistische vorming in levende cellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay voor het bestuderen van de aggregatie van eiwitten Tau en Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...