Name: in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
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Die Autoren danken Dr. Val Millar und Dr. Sohaib Nizami für ihre Unterstützung bei der High-Content-Mikroskopie und Dr. Daniel Ebner für den Zugang zu den High-Content-Mikroskopen. Darüber hinaus danken die Autoren Dr. Emma Mead für die Beratung zur Assay-Entwicklung und Frau Cathy Browne für die iPSC-Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Alzheimer's Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, Förderreferenz ARUK-2020DDI-OX) unterstützt, mit zusätzlicher Unterstützung für die James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) von der Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award von Parkinson's UK (J-1403); die MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 und Momentum MC_PC_16034 Awards.

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Mikroglia haben wichtige Funktionen, die die Initiierung und das Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen beeinflussen, einschließlich der Phagozytose apoptotischer Neuronen. Beeinträchtigte mikrogliale Phagozytose und unangemessene Phagozytose von Synapsen wurden beide mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen und die Kausalität nicht gut verstanden werden4,23. Dieser Artikel beschreibt einen Phagozytose-Assay zur Messung der Phagozytose apoptotischer Zellen durch iPSC-Makrophagen, entweder mit einer Live-Cell-Zeitraffer-Bildgebungsanzeige oder einer Fixzell-High-Content-Mikroskopie oder einer Kombination aus beidem auf einem einzigen Assay. Diese Vielseitigkeit bedeutet, dass der Assay verwendet werden kann, um einzelne phagozytäre Ereignisse im Laufe der Zeit in wenigen Vertiefungen zu untersuchen oder für high-content Screening mit mehreren Bedingungen oder Behandlungen verwendet zu werden. Da der High-Content-Assay auf einen einzigen Zeitpunkt fixiert ist, können mehrere Assay-Platten gleichzeitig hergestellt werden. Der High-Content-Assay hat potenziellen Nutzen für die Charakterisierung von Makrophagen/Mikroglia mit krankheitsbedingten genetischen Varianten oder das Screening von niedermolekularen Inhibitoren auf Veränderungen der Phagozytose. Der Assay kann auch leicht angepasst werden, um die Phagozytose anderer Mikrogliamodelle oder möglicherweise Astrozyten zu untersuchen. Der Phagozytose-Assay kann möglicherweise mit Lebendzellbildgebungsflecken, z. B. Mitochondrien-, Kalzium- oder ROS-Indikatoren, multiplexed und eine immunfluoreszierende Färbung nach der Fixierung für Proteine von Interesse durchgeführt werden. Im Vergleich zu bestehenden Phagozytose-Assays, die apoptotische neuronale Zellen verwenden, besteht der Hauptvorteile dieses Protokolls darin, dass die Herstellung der phagozyten Ladung relativ einfach und schnell ist und zu einem einheitlichen Produkt führt. Andere Assays induzieren Apoptose von Neuronen oder SH-SY5Ys mit S-Nitroso-L-Cystein für 2 h25, Okadainsäure für 3 h22, Staurosporin für 4-16 h26,27,28,29 oder UV-Bestrahlung für 24 h30und können zu Zellen in verschiedenen Stadien der Apoptose führen. Darüber hinaus wurden die Live-Cell-Imaging- und High-Content-Imaging-Auslesungen bisher nicht beschrieben, soweit den Autoren bekannt ist. Die Haupteinschränkung der Verwendung der Paraformaldehyd-Fixierung zur Herstellung der phagozytischen Ladung besteht darin, dass sie den Prozess der Apoptose nicht vollständig rekapituliert, da die Fixierung verhindert, dass sich die Zellen in apoptotische Körper aufspalten, die aufgrund ihrer geringeren Größe wahrscheinlich schneller phagozytosiert werden. Es ist nicht bekannt, welche Wirkung die Fixierung auf die Sekretion von Nukleotid-"Find me"-Signalen (z. B. ATP, UDP) aus der Zielzelle hat, die Phagozyten anziehen. Ähnlich wie apoptotische Zellen weisen die fixierten SH-SY5Ys eine gewisse Membranpermeabilität gegenüber Propidieniodid auf. Die Membranpermeabilität ist mit der Freisetzung von "Find Me" -Signalen verbunden; Dies wurde jedoch nicht in den fixierten SH-SY5Ys untersucht, und wenn die Nukleotide zu schnell freigesetzt werden, würden sie weggespült, bevor SH-SY5Ys zu den iPSC-Makrophagen hinzugefügt werden.
Der erste kritische Schritt im Protokoll ist die Färbung toter SH-SY5Ys mit einem STP-Ester eines pH-empfindlichen roten Fluoreszenzfarbstoffs. Dieser Farbstoff reagiert schnell und kovalent mit freien primären Aminen auf der Oberfläche der toten SH-SY5Ys. Die Dauer der Färbung muss nicht optimiert werden; Vor der Kennzeichnung ist jedoch vorsichtshalber mit dem Farbstoff umzugehen. Die Markierungsreaktion darf nicht in Puffern durchgeführt werden, die freie Amine enthalten. Weiterhin besteht Niederschlagsgefahr, wenn der DMSO-Stamm in kaltem wässrigem Puffer oder in hoher Endkonzentration verdünnt wird. Ausfällungen erscheinen als dichte dunkle Objekte unter dem Mikroskop. Zusätzlich haftet die pH-empfindliche Farbstofflösung an normalen Kunststoffzentrifugenröhrchen und wäscht sich langsam ab; Daher werden für den Markierungsschritt niedrig bindende Röhrchen empfohlen. Die Verwendung eines pH-empfindlichen Farbstoffs anstelle eines dauerhaft fluoreszierenden Farbstoffs unterstützt die Identifizierung von verschlungenen Partikeln im Vergleich zu Partikeln, die an die Plasmamembran angrenzen. Da es bei neutralem pH-Wert eine gewisse Fluoreszenz gibt, muss die Dichte von phagozytischer Fracht und iPSC-Makrophagen niedrig genug für eine genaue Segmentierung gehalten werden, obwohl sie hoch genug ist, dass zahlreiche phagozytäre Ereignisse erfasst werden. Die Hochgehaltsmikroskopie war in der Lage, Phagozytose mit einer mittleren Ladungsdichte im Bohrraum (mehr als 2 SH-SY5Ys pro iPSC-Makrophagen) genau zu identifizieren. Umgekehrt war aufgrund der schwächeren Empfindlichkeit des Mikroskops im tiefroten Spektrum die Segmentierung von iPSC-Makrophagen in den Live-Cell-Zeitraffer-Bildgebungsdaten weniger sicher und es war notwendig, eine sehr geringe Ladungsdichte zu verwenden, um die Wahrscheinlichkeit von Fehlalarmen zu reduzieren (1 SH-SY5Y für jeweils zwei iPSC-Makrophagen). Die Validierung der richtigen Segmentierung und Ladungsdichte sollte mit Vergleichen zwischen unbehandelten und Cytochalasin D-behandelten Vertiefungen durchgeführt werden. In einem gut optimierten Assay sollte Cytochalasin D die durchschnittliche Anzahl der Flecken pro Zelle um 90% im Vergleich zu unbehandelten Proben reduzieren.
Ein weiterer kritischer Schritt im Protokoll ist die iPSC-Makrophagenfärbung, die es ermöglicht, die Zelle in der Bildanalyse zu identifizieren und zu segmentieren, so dass externe SH-SY5Ys von der Zählung ausgeschlossen werden. Der empfohlene Farbstoff ist zelldurchlässig, im Zytoplasma in ein unlösliches fluoreszierendes Produkt umgewandelt, fixierbar und ungiftig (siehe Materialtabelle). Der Färbeschritt wurde für den Einsatz von iPSC-Makrophagen mit dem high-content imaging phagocytosis assay optimiert und wir schlagen vor, ihn neu zu optimieren, wenn andere Zelltypen verwendet werden. Die Dauer der Zellfärbung kann erhöht werden, um die Ablagerung des unlöslichen fluoreszierenden Produkts in den Zellen zu verbessern. Wenn die Farbstoffkonzentration optimiert ist, sollte darauf geachtet werden, toxische Konzentrationen des organischen Lösungsmittelvehikels zu vermeiden.
Der dritte kritische Faktor für den Erfolg des Assays ist die Datenanalyse. Die bereitgestellten Analysepipelines sollen eher als Orientierungshilfe denn als Vorschrift dienen, da Unterschiede in der Färbeintensität oder Zellmorphologie die Wirksamkeit der Segmentierung der Pipelines wie geschrieben verringern können. Einige Optimierungen sind daher erforderlich, wobei die Pipeline auf geeignete Positiv- und Negativkontrollen getestet wird, und die Parameter, die optimiert werden sollen, sind im Protokolltext angegeben. Negativkontrollen sollten eine Erkrankung umfassen, bei der iPSC-Makrophagen vor der Zugabe von SH-SY5Ys mit einem starken Phagozytosehemmer wie Cytochalasin D vorbehandelt werden. Eine weitere mögliche Negativkontrolle ist die Zugabe der SH-SY5Ys zu zuvor unbehandelten Vertiefungen von iPSC-Makrophagen am Ende des Assays, 10 Minuten vor der Fixierung, was eine gewisse Ablagerung der Ladung ermöglicht, aber zu kurz ist, um eine nennenswerte Menge an Phagozytose aufzutreten. Ein Phagozytoseereignis ist definiert als ein rot fluoreszierendes Objekt innerhalb der Grenzen eines iPSC-Makrophagen, das vom Softwarealgorithmus unter Verwendung des tiefroten Fluoreszenzkanals definiert wird. Bei schlechter Segmentierung der Zellen (Abbildung 2) können viele nicht phagozytosierte SH-SY5Ys in unmittelbarer Nähe zu iPSC-Makrophagen fälschlicherweise in die Analyse einbezogen werden, d.h. falsch positive Ergebnisse. Der wichtigste Faktor für eine gute Segmentierung ist die stringente Abgrenzung der iPSC-Makrophagen. Die Segmentierung für beide Analysen ist automatisiert, so dass es nicht möglich ist, für jede Zelle eine perfekte Segmentierung zu erhalten. Einige Parameter können jedoch angepasst werden, um die Segmentierung optimaler zu gestalten, wobei einige Testbilder als Referenz verwendet werden. Die Cytochalasin-D-Kontrolle ist wichtig für die Beurteilung einer optimalen Segmentierung, da eine hohe Anzahl von phagozyttischen Ereignissen, die in diesem Zustand festgestellt wurden, darauf hindeutet, dass die Segmentierung suboptimal ist. Die Optimierung der Datenanalyse-Pipeline sollte idealerweise wiederholt werden, bis die Anzahl der phagozyten Ereignisse pro Zelle im Cytochalasin-D-Zustand um 80% -90% niedriger ist als ohne Inhibitor.
Die Probleme mit dem Phagozytose-Assay, die am wahrscheinlichsten auftreten, sind: (1) schwache pH-sensitive Fluoreszenz in Positivkontrollen, (2) spärliche oder ungleichmäßige Verteilung von Makrophagen am Ende des Assays oder (3) hohe Anzahl von falsch positiven Ergebnissen in der Analyse von nicht phagozytosierten SH-SY5Ys. Bei der Fehlerbehebung bei schwacher pH-sensitiver Fluoreszenz sollte zunächst überprüft werden, ob die Färbung des SH-SY5Ys zu einem Zellpellet mit einer starken magentafarbenen Farbe führte. Wenn die Farbe schwach ist, stellen Sie sicher, dass ein frischer Farbstoffvorrat verwendet wird, stellen Sie sicher, dass der Etikettierpuffer aminfrei ist, waschen Sie die SH-SY5Ys vor dem Färben zusätzlich, überprüfen Sie, ob die richtige Anzahl von SH-SY5Ys gefärbt wurde, stellen Sie sicher, dass keine Farbstofffällungen nachgewiesen werden, und optimieren Sie die Markierungskonzentration des Farbstoffs. Wenn die SH-SY5Ys stark gefärbt sind, überprüfen Sie, ob die der Assayplatte zugesetzte Konzentration korrekt ist, und stellen Sie sicher, dass die iPSC-Makrophagen gesund und nicht zu alt sind. Die zweite Art von Problem, die ungleichmäßige Makrophagenverteilung, kann durch den Verlust von Zellen während des Pipettierens entstehen, und es sollten Schritte unternommen werden, um die pipettierenden Kräfte der Zellen zu reduzieren und schmale Bohrungsspitzen zu vermeiden. Wenn das Problem weiterhin besteht, reduzieren Sie die Inkubationszeit für die Beladung der iPSC-Makrophagen mit zelldurchlässigem Farbstoff. Das dritte Problem, die fehlerhafte Einbeziehung von nicht phagozytierten Partikeln in die Analyse, deutet darauf hin, dass eine weitere Optimierung der Analysepipeline erforderlich ist. Die Fehlerbehebung sollte sich zunächst auf die Zellsegmentierung konzentrieren und darauf, ob die Software benachbarte Objekte enthält. Spezifische Parameter, die angepasst werden können, werden in den Anmerkungen unter den relevanten Schritten vorgeschlagen (Schritte 6.1.11-6.1.15 für die Lebendzell-Zeitrafferanalyse und Schritte 6.2.4-6.2.8 für die High-Content-Analyse). Wenn die Zellsegmentierung nicht weiter verbessert werden kann, hat die High-Content-Analyse einen zusätzlichen Schritt (Schritt 6.2.8), der falsch segmentierte iPSC-Makrophagen ausschließt. Darüber hinaus kann das Modul, das akzeptierte Flecken pH-sensitiver Fluoreszenz innerhalb von iPSC-Makrophagen filtert, optimiert werden, wodurch die Schwellenwertintensität akzeptierter Objekte erhöht wird, was dazu beitragen soll, nicht phagozytosierte SH-SY5Ys auszuschließen (Schritt 6.1.17 für die Live-Zell-Zeitrafferanalyse und Schritt 6.2.11 für die High-Content-Analyse).
Wir haben zwei Arten der Mikroskopieauslesung für den Phagozytose-Assay entwickelt, die jeweils Vorteile und Grenzen haben. Die Live-Cell-Zeitraffer-Bildgebung hat den Vorteil, zusätzliche Informationen über die Phagozytose-Kinetik zu liefern und ist breiter verfügbar als High-Content-Bildgebungsplattformen. Die empfohlene Open-Source-Software ist unabhängig von der Mikroskopquelle und kann mit jedem hochwertigen Fluoreszenzmikroskop mit oder ohne Live-Cell-Zeitrafferfähigkeit verwendet werden. Die Haupteinschränkung der Lebendzellbildgebung ist die begrenzte Empfindlichkeit und Optik, die es schwieriger machen, eine gute Segmentierung von iPSC-Makrophagen zu erkennen und durchzuführen. Diese Einschränkung könnte entweder durch eine Erhöhung der Dauer der iPSC-Makrophagenfärbung oder durch den Wechsel zu einem empfindlicheren Mikroskop, falls verfügbar, gemildert werden. Der High-Content Imaging Phagozytosis Assay ist die empfohlene Auslesung, wenn ein High-Content Imaging System verfügbar ist. High-Content-Bildgebungssysteme ermöglichen einen höheren Durchsatz und zuverlässigere Daten, so dass dieser Assay für das Screening verwendet werden kann, bei dem ein robustes Z' von ≥0,7 für die Ausgabe "Anzahl der Spots pro Zelle"20erwartet wird. Im Vergleich zur Lebendzell-Zeitraffermethode hat die hochgehaltige Mikroskopieauslesung eine höhere Empfindlichkeit, einen höheren Automatisierungsgrad und eine höhere Geschwindigkeit, mehr Vertiefungen und Bildgebungsfelder können verarbeitet werden und es werden hochauflösende konfokale Bilder erzeugt. Die Zellsegmentierung ist mit guten Bildern effektiver, und die Segmentierung wird zusätzlich durch die high-content-Bildanalysesoftware unterstützt, die mehr Zellsegmentierungsmethoden bietet, die für stark unregelmäßig geformte Zellen geeignet sind. Die High-Content-Imaging-Analysesoftware berechnete im Vergleich zur Open-Source-Software auch mehr Parameter der Phagozytose, wie z.B. den Prozentsatz der phagozyten Zellen. Die Haupteinschränkung des High-Content-Phagozytose-Assays besteht in den Kosten und der Zugänglichkeit des Bildgebungssystems und der Analysesoftware.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der in diesem Artikel vorgestellte quantitative Phagozytose-Assay ein nützliches Werkzeug zur Modellierung der Mikroglia-Phagozytose toter Neuronen in vitro ist. Die Mikroglia werden von iPSC-Makrophagen modelliert und die toten Neuronen von paraformaldehydfixierten SH-SY5Ys. Obwohl nicht die authentischsten Mikroglia- und toten/ apoptotischen Neuronenmodelle veröffentlicht wurden, sind diese einfach zu erstellen und skalierbar. Der Assay selbst ist sehr vielseitig, mit zwei Arten von Bildauslesung detailliert und hat das Potenzial, für die Verwendung mit verschiedenen Mikroglia / Makrophagen-Monokulturmodellen oder einem anderen Zelltyp angepasst zu werden, um als phagozytische Fracht zu fungieren. Die hochauflösende Bildauslesung ist vorteilhaft für die Gewinnung quantitativer Daten und kann skaliert werden, um niedermolekulare Modulatoren der Phagozytose zu testen oder genetische Varianten in den iPSC-Makrophagen zu screenen. Da High-Content-Bildgebungssysteme jedoch teuer und datenintensiv sind, wurde eine alternative Bildauslesung mit einem Lebendzell-Zeitraffermikroskop in das Protokoll aufgenommen, das bei Bedarf jedes herkömmliche Fluoreszenzmikroskop von guter Qualität ersetzen könnte.

Mikroglia sind Makrophagen, die im Gehirngewebe ansässig sind, und ihre Funktionen umfassen Immunüberwachung, Koordination von Entzündungsreaktionen auf Verletzungen / Infektionen, synaptische Umgestaltung und Phagozytose von toten Zellen, Myelin, Proteinaggregaten und Krankheitserregern. Phagozytose ist der Prozess, bei dem Mikroglia Fracht mit Oberflächenrezeptoren erkennen und ihr Zytoskelett reorganisieren, um das Objekt zu einem Phagosom zu verschlingen, das dann mit Lysosomen zum Abbau der Ladung verschmilzt. Gesunde Mikroglia phagozytose apoptotische Gehirnzellen, um sie zu entfernen, bevor sie nekrotisch werden1. Die Phagozytose apoptotischer Zellen wird auch als Efferozytose bezeichnet und erfordert die Anzeige eines Phosphatidylserin-"Eat-me"-Signals durch die sterbende Zelle2. Zahlreiche Mikrogliarezeptoren binden direkt an Phosphatidylserin, darunter TIM-4, BAI1, Stabilin-2 und TREM2. Mikrogliale TAM-Rezeptoren (z. B. MERTK) und Integrine binden indirekt an Phosphatidylserin, wobei die Zusatzproteine GAS6 bzw. MFG-E8 verwendet werden. Andere "Eat-Me" -Signale können für die Erkennung sterbender Zellen notwendig sein, dazu gehören Veränderungen der Glykosylierung oder ladung von Oberflächenproteinen; Expression der intrazellulären Proteine ICAM3, Calreticulin, Annexin-I an der Zelloberfläche; oxidiertes LDL; oder Beschichtung der apoptotischen Zelle durch mikrogliaproduziertes KomplementC1q1,2.
Neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, frontotemporale Demenz und amyotrophe Lateralsklerose, wurden mit einer Beeinträchtigung der Mikrogliafunktion in Verbindung gebracht, einschließlich einer Anhäufung von Hirnabfallprodukten wie toten Zellen, Myelinfragmenten und Proteinaggregaten und übertriebenen Entzündungsreaktionen auf diese Reize3. Phagozytose kann bei neurodegenerativen Erkrankungen beeinträchtigt sein und zur Pathologie beitragen, aufgrund einer Kombination von Alterung, Entzündung oder spezifischen genetischen Risikovarianten4,5. Auf der anderen Seite gibt es auch Hinweise aus Tiermodellen neurodegenerativer Erkrankungen, dass Mikroglia ungeeignet lebensfähige Neuronen oder Synapsen phagozytose können6,7,8. Der Mechanismus wird wahrscheinlich durch die Phosphatidylserin-Anzeige beschädigter Neurite ausgelöst, die direkt von den mikroglialen Phagozytoserezeptoren TREM2 oder GPR56 erfasst wird, oder indirekt durch lösliche Komplement-C1q-Beschichtung der mit Phosphatidylserin angereicherten Membran, was zu CR3-vermittelter Phagozytose9,10,11führt .
In-vitro-Assays der Phagozytosefunktion, z. B. zur Beurteilung der phänotypischen Auswirkungen einer genetischen Risikovariante in Mikroglia, werden häufig mit nicht-physiologischen Ladungen wie Latexperlen durchgeführt4. Fluoreszierend markierte Bakterien und Zymosan werden ebenfalls verwendet, die physiologisch, aber für neurodegenerative Erkrankungen nicht relevant sind. Nicht-physiologische phagozytäre Ladungen können verwendet werden, um Defekte in der grundlegenden Maschinerie der phagozytären Verschlingung zu erkennen, aber nicht den ersten "Erkennungsschritt" in der Phagozytose apoptotischer Neuronen genau zu modellieren. Die Größe, Form, Steifigkeit und Art der Ladung bestimmen auch die intrazellulären Signalwege, die aktiviert werden, was zu unterschiedlichen Ergebnissen des Mikroglia-Aktivierungszustands führt. Zum Beispiel sind E.coli-Bakterien im Gegensatz zu menschlichen Zellen klein und steif, und die Lipopolysaccharide auf ihrer Oberfläche werden vom Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) erkannt, der Phagozytose und entzündungsfördernde Signalwege aktiviert2,12.
Im Rahmen von Neurodegenerativen Krankheitsstudien würde eine relevantere phagozytische Ladung Phosphatidylserin auf Plasmamembranen von Säugetieren aufweisen und wäre idealerweise menschlich und neuronal, um Signale einzubeziehen, auf die Mikroglia wahrscheinlich stoßen werden. Für dieses Phagozytose-Protokoll wurde die humane Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y als leicht zu kulturierendes Neuronenmodell gewählt. Permanente Oberflächen-Phosphatidylserin-Display wurde künstlich durch Paraformaldehyd induziert, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es Phosphatidylserin-Display von Blutplättchen verursacht13. Für das Mikrogliazellmodell wurden humane iPSC-Makrophagen verwendet, die das Ontogen- und Transkriptionsprofil menschlicher Mikroglia nachahmen und phagozytisch kompetent sind14,15,16,17. iPSC-Makrophagen sind nicht das authentischste verfügbare Mikrogliamodell, z. B. ahmen sie keine Mikrogliamorphologie nach; Man kann es jedoch durch ein authentischeres Monokultur-iPSC-Modell von Mikroglia ersetzen, wenn gewünscht, wie Haenseler et al.15. Humane iPSC-Modelle sind primären Nagetiermikroglia für die Untersuchung der Neurodegeneration vorzuziehen, da Bedenken hinsichtlich der begrenzten Überlappung der Mikroglia-Transkriptionsmodule bestehen, die in neurodegenerativen Erkrankungsgeweben von Mensch und Maus beobachtet wurden18. Die toten SH-SY5Ys werden mit einem säureempfindlichen Farbstoff gefärbt, der bei neutralem pH-Wert schwach fluoresziert und nach Phagozytose stärker in den Phagolysosomen von iPSC-Makrophagen fluoresziert. Die Verwendung eines säureempfindlichen Farbstoffs verbessert die Genauigkeit der Erkennung phagozytärer Ereignisse, mit Vielseitigkeit für verschiedene Auslesungen von lebenden und fixierten Makrophagen19. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die Zeitrafferbildgebung von Phagozytose mit Lebendzellen als auch einen festen High-Content-Bildgebungstest für Phagozytose mit den gleichen Zellvorbereitungsschritten vor dem Auslesen (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Methodik. Gliederung des Phagozytose-Assays, bei dem die Herstellung der SH-SY5Ys und die Färbung der iPSC-Makrophagen parallel durchgeführt wird und dann die SH-SY5Ys auf die iPSC-Makrophagen pipettiert werden. Entweder wird sofort eine Live-Cell-Zeitraffer-Bildgebung durchgeführt, oder die Zellen werden bei 37 °C/5% CO2 für die erforderliche Dauer inkubiert und vor der Durchführung einer Hochgehaltsmikroskopie fixiert. PFA: Paraformaldehyd, HBM: phenolrotfreie HEPES-gepufferte Medien, pHr: pH-sensitiver rot fluoreszierender Farbstoff STP Esterlösung, PRFMM: phenolrotfreie Makrophagenmedien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>For centrifugation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L, 20-200 &#181;L, 100-1000 &#181;L single-channel micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Component of Factory media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>For fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell-800 24-well plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34815</td>
			<td>Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14085</td>
			<td>Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 &#956;M, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 laminar air flow safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, set to 37&#176;C and 5 % CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image Data Storage and Analysis System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11330</td>
			<td>Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20&#176;C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320074</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for CellTracker and pHrodo dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>Live-cell time-lapse imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube CY5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4656</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4650</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube RFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 10-547F</td>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant BMP4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-3</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC0033</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant VEGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein binding 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108.132</td>
			<td>For staining SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC9501</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel 20-200 uL pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For liquid handling of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td>High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36011</td>
			<td>pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 &#956;L (12.5 &#956;g) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette filler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as &#34;Factories&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for SH-SY5Y culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealers</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676001</td>
			<td>For assay plate storage and transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, set to 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418F</td>
			<td>Component of Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-744Q</td>
			<td>Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages

Mikroglia orchestrieren Neuroimmunreaktionen bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Parkinson und Alzheimer. Mikroglia klären tote und sterbende Neuronen durch den Prozess der Efferozytose, einer spezialisierten Form der Phagozytose. Die Phagozytosefunktion kann durch umweltbedingte oder genetische Risikofaktoren gestört werden, die Mikroglia beeinflussen. Dieser Artikel stellt ein schnelles und einfaches In-vitro-Mikroskopieprotokoll zur Untersuchung der mikroglialen Efferozytose in einem induzierten pluripotenten Stammzellmodell (iPSC) von Mikroglia unter Verwendung einer humanen Neuroblastomzelllinie (SH-SY5Y) vor, die mit einem pH-sensitiven Farbstoff für die phagozytäre Ladung markiert ist. Das Verfahren führt zu einer hohen Ausbeute an toten Neuroblastomzellen, die Oberflächenphosphatidylserin aufweisen, das von Phagozyten als "Eat-Me" -Signal erkannt wird. Der 96-Well-Plattenassay eignet sich für die Zeitrafferbildgebung von Lebendzellen, oder die Platte kann vor der weiteren Verarbeitung erfolgreich fixiert und durch High-Content-Mikroskopie quantifiziert werden. Die Fixed-Cell-High-Content-Mikroskopie ermöglicht es, den Assay für das Screening von niedermolekularen Inhibitoren oder die Beurteilung der phagozytischen Funktion genetischer Varianten-iPSC-Linien zu skalieren. Während dieser Assay entwickelt wurde, um die Phagozytose ganzer toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen zu untersuchen, kann der Assay leicht für andere Ladungen angepasst werden, die für neurodegenerative Erkrankungen relevant sind, wie Synaptosomen und Myelin und andere phagozytäre Zelltypen.

Die Zeitraffer-Bildgebung von Lebendzellen wurde mit dem zuvor beschriebenen Protokoll durchgeführt, wobei Wildtyp-iPSC-Makrophagen mit 20.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät wurden. Verschiedene Mengen von SH-SY5Ys wurden angewendet (10.000-30.000 pro Well, geschätzt aus der Zellzahl in Schritt 3.1), und der Phagozytosehemmer Cytochalasin D wurde mit einigen Vertiefungen vorinkubiert (1 h), die als Kontrolle zur Hemmung der Phagozytose für jede Menge SH-SY5Ys fungierten. Die Bildgebung begann 40 Minuten nach der Zugabe von SH-SY5Ys und die Bilder wurden in 5-Minuten-Intervallen für die nächsten 3 Stunden aufgenommen (die Daten enthalten die anfängliche Verzögerung von 40 Minuten). Ein repräsentatives Zeitraffervideo ist in den ergänzenden Datenenthalten und analysierte quantitative Daten in Abbildung 3. Mit der Menge von 10.000 SH-SY5Ys pro Vertiefung nahm die Anzahl der phagozytierten Partikel (Flecken) pro Zelle linear mit der Zeit zu und wurde durch Cytochalasin D um etwa 50% gehemmt. Die Hemmung durch Cytochalasin D war schwächer als erwartet, höchstwahrscheinlich verursacht durch unzureichende technische oder biologische Replikate, da nur eine Vertiefung pro Erkrankung mit drei Bildfeldern abgebildet wurde. Bei höheren Mengen an SH-SY5Ys pro Vertiefung (20.000 und 30.000) zeigte die Phagozytose eine schlechte Linearität, wahrscheinlich aufgrund einer schlechten Segmentierung von iPSC-Makrophagen und SH-SY5Ys in einem überfüllteren Sichtfeld.
Die Fixed-Cell-High-Content-Bildgebung wurde mit dem zuvor beschriebenen Protokoll durchgeführt, mit Wildtyp-iPSC-Makrophagen bei 20.000 Zellen pro Vertiefung, mehreren verschiedenen Mengen an SH-SY5Ys (10.000-80.000 pro Bohrung) und der Assay-Platte wurde nach 5 h fixiert und abgebildet. Ein repräsentatives Bild der Phagozytose ist in Abbildung 4Adargestellt, und die analysierten Daten sind in Abbildung 4B17 dargestellt. Die Erhöhung der Menge an SH-SY5Ys führte zu einer höheren Anzahl von phagozytierten Partikeln (Flecken) pro Zelle; Eine Verdoppelung der SH-SY5Y-Menge führt jedoch nur zu einer 1,5-fachen Erhöhung der Anzahl der Spots pro Zelle. Dies deutet darauf hin, dass die getesteten Mengen nicht die Rate für die Phagozytose begrenzen. Anschließend wurde der high-content imaging phagocytosis assay mit mehreren Inhibitoren der Phagozytose validiert (Abbildung 4C)17. Die Aktinpolymerisationshemmer Cytochalasin D und Jasplakinolid hemmten die Phagozytose signifikant um 91% bzw. 90%, wenn sie 1 h vor der Phagozytose vorbebrütet wurden. Das robuste Z' des Assays, wenn Cytochalasin D oder Jasplakinolid als Negativkontrollen verwendet werden, wird mit 0,7 bzw. 0,8 bzw.20berechnet. Der Lysosom-Säuerungshemmer Bafilomycin A1 reduzierte die Phagozytose signifikant um 31%, wenn er 1 h vor der Phagozytose inkubiert wurde. Die schwächere Wirkung des Lysosom-Versauerungsinhibitors im Vergleich zu Aktininhemmern deutet darauf hin, dass der Nachweis der verinnerlichten Ladung möglicherweise keine vollständige Säuerung des Phagosoms erfordert. Rekombinantes Annexin V wurde als Kontrolle verwendet, um Phosphatidylserin, das auf der Oberfläche von SH-SY5Ys exponiert war, spezifisch zu blockieren und zu verhindern, dass phagozytäre Rezeptoren auf den Liganden zugreifen, ein wichtiges "Eat-Me" -Signal. Die Zugabe von rekombinantem Annexin V reduzierte die Phagozytose signifikant um 30%, wenn sie unmittelbar vor der SH-SY5Y-Zugabe zu den Vertiefungen hinzugefügt wurde. Es wurde bestätigt, dass feste SH-SY5Ys Phosphatidylserin unter Verwendung einer fluoreszierenden Annexin-V-Sonde exponierten, während lebende SH-SY5Ys für die Annexin-V-Färbung negativ waren (Abbildung 4D).
Der mikrogliale Phagozytoserezeptor TREM2 hat sich bereits als wichtig für die Phagozytose apoptotischer Neuronen21 erwiesen. Die R47H-Mutation von TREM2 ist ein Risikogen für den späten Ausbruch der Alzheimer-Krankheit und wird angenommen, um die Ligandenbindung von TREM223zu reduzieren. Mit dem Ziel, die phagozytäre Funktion von R47H TREM2 und TREM2 KO zu beurteilen, wurde der fixzellige High-Content-Phagozytose-Assay unter Verwendung isogener iPSC-Makrophagenlinien mit WT/R47H/KO TREM217durchgeführt. Mehrere Längen der Phagozytosedauer von 1 bis 5 h wurden getestet, wobei eine gestaffelte Zugabe von phagozytischer Ladung (40.000 SH-SY5Ys) verwendet wurde. Das resultierende Signal steigt linear auf 4 h an und nivellieren sich bei 5 h leicht (Abbildung 5)17. Eine reduzierte Phagozytoserate und -kapazität (% spotpositive Zellen) zeigte sich bei TREM2 KO im Vergleich zu WT, während die R47H TREM2-Mutante keine veränderte Phagozytose zeigte. Der phagozytäre Defekt in TREM2 KO-Zellen wird durch die R47H TREM2-Mutation nicht phänokopiert, anscheinend weil die TREM2-Funktion ausreicht, um eine normale Phagozytose zu unterstützen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Beispieldaten für den Lebendzell-Zeitraffer-Phagozytose-Assay. Aufnahme toter SH-SY5Ys durch Wildtyp-iPSC-Makrophagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) in 5-Minuten-Intervallen für 3 h. Die auf der Grafik angezeigten Zeiten stammen aus dem Beginn der Phagozytose, einschließlich der ersten 40 Minuten ohne Messung. Die durchschnittliche Anzahl der Flecken pro Zelle aus drei Replikationsbohrungen wird aufgezeichnet. Die Phagozytose von 10.000 SH-SY5Ys wird mit 10 μM Cytochalasin D mit 1 h Vorbehandlung gehemmt, während höhere Mengen an SH-SY5Ys (20.000 und 30.000) eine suboptimale Quantifizierung der Phagozytose aufweisen. Mittelwert ± Standardabweichung (SD), N = 1 Experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Optimierung und Validierung des fixzelligen High-Content-Phagozytose-Assays. (A) Repräsentative High-Content-Mikroskopieaufnahme von SH-SY5Ys Phagozytos, die von Wildtyp-iPSC-Makrophagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) untersucht wurden. Es wird ein 3 h-Zeitpunkt mit 40.000 SH-SY5Ys angezeigt. Fluoreszenzkanäle werden zusammengeführt, wobei der iPSC-Makrophagenfleck rot, die Kerne blau und SH-SY5Ys gelb dargestellt werden. Das Inset-Panel ist ein 3x vergrößerter Ausschnitt des Bildes. (B) Die Anzahl der Flecken pro Zelle von phagozytosierten toten SH-SY5Ys nach 5 h, wobei unterschiedliche Mengen an Fracht zusätzlich zu Wildtyp-iPSC-Makrophagen verwendet werden. Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (REM), für N = 3 Ernten. (C) Phagozytose (3 h) wird mit 10 μM Cytochalasin D (Cyt), 1 μM Bafilomycin A1 (Baf), 1 μM Jasplakinolid (mit 1 h Vorbehandlung; Jas) und 13 μg/ml rekombinantes Annexin V (gleichzeitig zu den toten SH-SY5Ys hinzugefügt; Ann). iPSC-Makrophagen ohne SH-SY5Ys wurden als Negativkontrolle (-ve) verwendet, und die positive (+ve) Kontrolle sind unbehandelte iPSC-Makrophagen mit SH-SY5Ys. Die Daten wurden auf den Mittelwert für die Experimentwiederholung normalisiert. Mittel ± REM, für N = 3-6 Ernten und mit zwei Wildtyp-Zelllinien (SFC840-03-03, die Charakterisierung dieser Linie ist beschrieben in (Fernandes et al.21 und BIONi010-C). 1-Wege-ANOVA mit Dunnetts Post-hoc-Test, Vergleiche mit unbehandelten Zellen. *p < 0,05, ***p < 0,001. (D) Frisch fixierte SH-SY5Ys färben gleichmäßig für die Phosphatidylserin-Anzeige (Annexin V-FITC) und weisen eine begrenzte Zellpermeabilität auf (Propidiiumiodid). Lebende SH-SY5Ys färben sich nicht für Annexin V-FITC oder Propidiumiodid, mit Ausnahme der fokalen Färbung auf den wenigen toten Zellen in Kultur. Die Abbildungen werden mit Genehmigung von Alzheimer's Research & Therapy17reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Abbildung 5: Phagozytose ist bei TREM2 KO reduziert, nicht jedoch bei R47H TREM2 iPSC-Makrophagen. Hochgehalts-Phagozytose-Assay mit 40.000 SH-SY5Ys pro Vertiefung mit gestaffelten Zusätzen. Die Mittelwerte wurden für die Parameter quantifiziert: Anzahl der Flecken pro Zelle, Summe der Fleckenbereiche (μm2)pro Zelle und Prozentsatz der Zellen, die phagozytosierte Partikel pro Feld enthalten. Die Daten wurden normalisiert, um für jeden Genotyp pro Experiment zu bedeuten. Mittelwert ± SEM, für N = 3 Ernten. Wiederholte Messungen 2-Wege-ANOVA, Dunnetts Post-hoc-Test, paarweise Vergleiche mit dem WT für jedes Mal: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Die Abbildungen werden mit Genehmigung von Alzheimer's Research & Therapy17reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Beispiel QC für SH-SY5Ys Vorbereitung. Dissoziierte SH-SY5Ys wurden für 10 min mit 0% (lebende Zellen), 1% und 2% Paraformaldehyd (PFA) fixiert und dann gewaschen. Die Zellen wurden mit Annexin V-FITC und Propidieniodid (PI) gefärbt und sofort mittels Durchflusszytometrie gemessen. Farbdichtepunktdiagramme wurden in einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware erstellt, wobei die einzelngefärbten und nicht gefärbten Steuerelemente verwendet wurden, um ein Quadrantentor zu platzieren. Quadranten werden mit dem Prozentsatz der Ereignisse innerhalb dieses Quadranten kommentiert. Lebende Zellen sind hauptsächlich in Q4 und feste Zellen sind hauptsächlich in Q2. Q1 = Annexin V-/PI-, Q2 = Annexin V+/PI+, Q3 = Annexin V+/PI-, Q4 = Annexin V-/PI- (lebende Zellen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video: Lebendzell-Zeitraffer-Phagozytose. Repräsentatives Zeitraffervideo von SH-SY5Ys Phagozytos, die von Wildtyp-iPSC-Makrophagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) gephässigt wurden. Die Bilder wurden alle 5 Minuten für 3 Stunden aufgenommen. Das Video wird zugeschnitten und läuft mit 3 Bildern pro Sekunde, wobei die letzten 1,5 Stunden des Assays angezeigt werden. Die säureempfindlichen farbstoffgefärbten SH-SY5Ys sind rot dargestellt, wobei die Signalintensität mit der Phagosomversauerung zunimmt. Mit Hoechst 33342 gefärbte Zellkerne sind blau dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>

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In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Neurodegenerative Erkrankungen sind mit dysregulierten Mikrogliafunktionen verbunden. Dieser Artikel beschreibt einen In-vitro-Assay der Phagozytose von Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen. Quantitative Mikroskopie-Auslesungen werden sowohl für die Zeitraffer-Bildgebung mit lebenden Zellen als auch für die High-Content-Bildgebung mit festen Zellen beschrieben.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Dieser in vitro bildgebende Assay ermöglicht es, die Wirkung verschiedener Zellbehandlungen oder verschiedener Genotypen auf die mikrogliale Phagozytose zu quantifizieren. Unter Verwendung von zwei Zelltypen, die für neurodegenerative Erkrankungen relevant sind, verwenden wir tote Neuroblastomzellen für die phagozytäre Ladung, die so vorbereitet werden, dass sie durch große hochauflösende Bildgebungsbildschirme einfach und kostengünstig skaliert werden können. In einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse 2 dissoziieren Sie SH-SY5Ys durch Absaugen des Mediums.Fügen Sie 4 ml Zelldissoziationspuffer hinzu und entfernen Sie den Puffer sofort, so dass weniger als 1 ml als dünner Film übrig bleibt, der die Zellen bedeckt. 2 bis 3 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Dann bei 10 ml HBSS in den T-75-Kolben.Und pipette die SH-SY5Ys in ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 400xG für 5 Minuten. Saugen Sie den Überstand an und suspendieren Sie die Zellen in 2 ml phenolrotfreiem HEPES-gepufferten Medium, um sicherzustellen, dass Klumpen vor der Fixierung aufgebrechen werden.Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 2 ml 4% Power-Formaldehyd in das Röhrchen geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur mit gelegentlichem sanftem Rühren inkubieren. Fügen Sie 10 ml HBSS in die Tube hinzu. Dann zentrifugieren Sie bei 1200xG für 7 Minuten.Saugen Sie den Überstand an und suspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml phenolrotfreiem HEPES-gepufferten Medium. Zählen und entfernen Sie 1 Million HS-SY5Y-Zellen in ein 2 ml proteinarmes Röhrchen. Bringen Sie das Gesamtvolumen mit phenolrotfreien HEPES-gepufferten Medien auf 300 bis 500 Mikroliter.Anschließend die Tube in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad kurz erwärmen. Rekonstituieren Sie den pH-empfindlichen roten Fluoreszenzfarbstoff STP-Ester gemäß den Anweisungen des Herstellers. Dann fügen Sie 12,5 Mikrogramm Farbstoff pro Million SH-SY5Y-Zellen hinzu.Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Röhre streichen. Und inkubieren Sie die Röhre bei Raumtemperatur für 30 Minuten, geschützt vor Licht. Fügen Sie 1 ml HBSS und Zentrifuge bei 1200xG für 7 Minuten und 4 Grad Celsius hinzu.Verwerfen Sie den Überstand. Und mit 2 ml HBSS waschen. Suspendieren Sie das Zellpellet in phenolrotfreien Makrophagenmedien auf eine Konzentration von 0,2 bis 1,2 Millionen Zellen pro ml, so dass 50 Mikroliter 10.000 bis 60.000 Zellen enthalten.Bereiten Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank eine Lösung aus tiefroten fluoreszierenden Zelldurchlässigkeitsstoffen Succinimidylester-reaktiven Farbstoffen in Makrophagenmedien vor. Fügen Sie Hoechst 33342 hinzu und erwärmen Sie die Arbeitslösung in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Saugen Sie das iPSC-Makrophagenmedium schonend an, indem Sie den Zellüberstand mit einer Mehrkanalpipette in ein steriles Reservoir pipettieren.70 Mikroliter pro Vertiefung der Farbstofflösung werden den iPSC-Makrophagen mit einer Mehrkanalpipette hinzugefügt. 1 Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Reparieren Sie experimentelle Behandlungen in phenolrotfreien Makrophagenmedien.Nach der Inkubation das iPSC-Makrophagenmedium sehr vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette absaugen und 100 Mikroliter HBSS pro Vertiefung hinzufügen. HBSS sofort durch sanftes Pipettieren entfernen. Dann fügen Sie 100 Mikroliter phenolrotfreie Makrophagenmedien sowie experimentelle Behandlungen in separaten Vertiefungen hinzu.10 Minuten bis 1 Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter der markierten SH-SY5Ys pro Vertiefung von den Seiten jeder Vertiefung am Rand der Flüssigkeit hinzuzufügen. Dann bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 3 bis 5 Stunden inkubieren.Nach der Phagozytose-Inkubation Zellüberstände durch Pipettieren mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig absaugen und entsorgen. Einmal mit 100 Mikrolitern PBS waschen. Dann fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter 2% Power-Formaldehyd hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Saugen Sie Vertiefungen an und fügen Sie 100 Mikroliter PBS hinzu. Fahren Sie entweder direkt mit der Bildgebung mit dem Hochgehaltsmikroskop fort oder decken Sie sie mit Plattenversiegelung und Folie ab und lagern Sie die Platte bei 4 Grad Celsius, bis sie erforderlich ist. Schalten Sie das hochauflösende Bildgebungsmikroskop ein und öffnen Sie die Bilderfassungssoftware.Laden Sie die Assay-Platte in das Mikroskop, indem Sie auf das LOAD"-Symbol oben auf dem Bildschirm klicken. Wählen Sie die Registerkarte SETUP". Wählen Sie in den Dropdown-Menüs oben links den entsprechenden Plattentyp aus.Die Autofokus-Option:zwei Spitze"Das Objektiv:40x Wasser, NA 1.1"Konfokale"Modus und Binning von 1. Spülen Sie das 40x Wasserobjektiv vor Gebrauch über das Einstellungsmenü. Verwenden Sie im Kanalauswahlfeld das Plussymbol, um die Kanäle DAPI, Alexa 647 und Alexa 568 hinzuzufügen.Stellen Sie diese so ein, dass sie auf einer einzigen Ebene von einem Mikrometer messen. Optimieren Sie die Zeit- und Leistungseinstellungen für die Färbeeffizienz der Assay-Platte. Stellen Sie sicher, dass die Kanäle nicht gleichzeitig gemessen werden, indem Sie auf Kanalsequenz klicken, um die Kanäle zu trennen.Wählen Sie unter Navigation und Layout definieren die Messbohrungen und 9 bis 12 Felder pro Vertiefung aus. Klicken Sie während der Einrichtung auf ein repräsentatives Feld auf der Plattenkarte. Und überprüfen Sie jeden Messkanal nacheinander, um sicherzustellen, dass die Flecken vorhanden sind und dass die Bilder durch Anpassen des Kanalversatzs fokussiert werden.Um die Daten zur Fernanalyse auf einen Server hochzuladen, klicken Sie auf das Feld "Online-Jobs" und den entsprechenden Bildschirmnamen. Speichern Sie das Assay-Protokoll, indem Sie auf die Schaltfläche "Speichern" klicken und oben auf die Registerkarte "Experiment ausführen" klicken. Nennen Sie die Experimentplatte, dann klicken Sie auf Start"Ein Phagozytose-Assay zeigte, dass mit 10.000 SH-SY5Ys pro Vertiefung die Anzahl der Phagozytosepartikel pro Zelle linear mit der Zeit anstieg und durch Cytochalasin D um etwa 50% gehemmt wurde.Bei höheren Mengen an SH-SY5Ys pro Vertiefung zeigte die Phagozytose eine schlechte Linearität, wahrscheinlich aufgrund einer schlechten Segmentierung von iPSC. Makrophagen und SH-SY5Ys in einem überfüllten Sichtfeld.Die folgenden Ergebnisse wurden durch die Durchführung einer festzelligen Bildgebung mit hohem Gehalt, einschließlich dieses repräsentativen Bildes der Phagozytose, erzielt. Die Erhöhung der Menge an SH-SY5Ys führte zu einer höheren Anzahl von phagozytierten Partikeln pro Zelle. Der Phagozytose-Assay wurde mit mehreren Phagozytose-Inhibitoren validiert.Cytochalasin D und Jasplakinolid hemmten die Phagozytose signifikant um 91 bzw. 90 Prozent. Und Bafilomycin A1 reduzierte die Phagozytose signifikant um 31%, wenn es 1 Stunde vor der Phagozytose vorinkubiert wurde. Die Zugabe von rekombinantem Annexin 5 reduzierte die Phagozytose signifikant um 30%, wenn sie den Vertiefungen unmittelbar vor der SH-SY5Y-Zugabe zugesetzt wurde.Fix SH-SY5Ys wir haben bestätigt, Phosphatidylserin mit einer fluoreszierenden Annexin 5-Sonde freizulegen. Während lebende SH-SY5Ys für die Färbung nach Anhang 5 negativ waren. Mehrere Längen der Phagozytosedauer, von 1 bis 5 Stunden, wurden mit gestaffelter Zugabe von phagozytischer Ladung getestet.Die Gesamtlänge dieses Protocalls kann verkürzt werden, indem die phagozytische Ladung vorbereitet und die iPSC-Makrophagen parallel gefärbt werden. Wenn Sie dies tun möchten, erarbeiten Sie die Timings im Voraus und verwenden Sie Ihre Inkubationen, um Lösungen für die zukünftigen Schritte vorzubereiten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Forschung

Neurowissenschaften

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

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Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

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Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

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In-vitro- Test zur Untersuchung der Aggregation von Tau-Protein und Drogen-Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...