Name: in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

המחברים מודים לד"ר ואל מילר ולד"ר סוהייב ניזאמי על עזרתם במיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה, ולד"ר דניאל אבנר על הגישה למיקרוסקופים בעלי התוכן הגבוה. יתר על כן, המחברים מודים לד"ר אמה מיד על עצת הפיתוח של אסאי, ולגברת קאתי בראון על תמיכת IPSC. עבודה זו נתמכה על ידי מכון גילוי התרופות של בריטניה מחקר אלצהיימר בבריטניה (ARUK ODDI, מענק התייחסות ARUK-2020DDI-OX), עם תמיכה נוספת למתקן תאי הגזע ג'יימס מרטין אוקספורד (S.A.C.) מבית הספר אוקספורד מרטין LC0910-004; פרס דיסקברי אמון אנדרטה מבריטניה פרקינסון (J-1403); MRC דמנציה פלטפורמה בבריטניה גזע רשת רשת קפיטל ציוד MC_EX_MR / N50192X/1, שותפות MR / N013255/1, ו מומנטום MC_PC_16034 פרסים.

<ol>
	<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li><li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+in+the+brain:+Homeostasis+and+disease.">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).</li><li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer's+disease:+potential+therapeutic+targets.">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li><li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+live+neurons.">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li><li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia.">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding.">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).</li><li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila.">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li><li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2.">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).</li><li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets.">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li><li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages.">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li><li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Alzheimer's+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout,+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages.">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12, 151 (2020).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer's+disease+not+evident+in+mouse+models.">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li><li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+robust+Z'+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons.">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).</li><li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+&#945;-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson's+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons.">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular &#945;-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li><li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2.">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li><li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease.">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Witting, A., M&#252;ller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia/brain+macrophages+in+vitro:+Involvement+of+lectin-,+integrin-,+and+phosphatidylserine-mediated+recognition.">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li><li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia.">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li><li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease.">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).</li><li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome.">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li><li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells.">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li><li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis.">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

למיקרוגליה יש פונקציות חשובות המשפיעות על ייזום והתקדמות של מחלות ניווניות, כולל פאגוציטוזיס של נוירונים אפופטוטיים. פגוציטוזיס מיקרוגליאלי לקוי ופגוציטוזיס לא הולם של סינפסות קושרו שניהם למחלות ניווניות, אם כי המנגנונים הבסיסיים והסיבתיות אינם מובנים היטב4,23. מאמר זה מתאר פתגם אסאי כדי למדוד פאגוציטוזיס של תאים אפופטוטיים על ידי iPSC-מקרופאגים, עם קריאת הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים או מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים, או שילוב של שניהם על בסיס אחד. רב-תכליתיות זו פירושה שניתן להשתמש בבדיקה כדי לחקור אירועים פאגוציטיים בודדים לאורך זמן בכמה בארות או לשמש להקרנה בתכולה גבוהה עם תנאים או טיפולים מרובים. מכיוון שההתוכן הגבוה קבוע בנקודת זמן אחת, ניתן להכין לוחות צ'ק מרובים בו זמנית. לבדיקה בעלת התוכן הגבוה יש תועלת פוטנציאלית לאפיון מקרופאגים/מיקרוגליה עם וריאנטים גנטיים הקשורים למחלות או סינון מעכבי מולקולות קטנות לשינויים בפגוציטוזיס. ניתן גם להתאים את הבחינה בקלות לחקר פאגוציטוזיס של מודלים אחרים של מיקרוגליה, או אסטרוציטים פוטנציאליים. ניתן לבצע את ההבחנה של פאגוציטוזיס עם כתמי הדמיה של תאים חיים, למשל, מיטוכונדריה, סידן או ROS, וניתן לבצע כתמים אימונופלואורסצנטיים לאחר קיבעון לחלבונים בעלי עניין. בהשוואה לתפיסות פאגוציטוזיס קיימות המשתמשות בתאים עצביים אפופטוטיים, היתרונות העיקריים שפרוטוקול זה מעניק הם שהכנת המטען הפאגוציטי היא פשוטה ומהירה יחסית, ותוצאותיה מוצר אחיד. הבדיקות האחרות גורמות לאפופטוזיס של נוירונים או SH-SY5Ys עם S-nitroso-L-ציסטאין עבור 2 h25, חומצה אוקדאית עבור 3 שעות22, staurosporine עבור 4-16 שעות26,27,28,29 או UV-הקרנה עבור 24 שעות30, והוא יכול לגרום לתאים בשלבים שונים של אפופטוזיס. יתר על כן, הדמיית תאים חיים וקריאות הדמיה בעלות תוכן גבוה לא תוארו בעבר, ככל הידוע למחברים. המגבלה העיקרית של שימוש בתיקון paraformaldehyde כדי להכין את המטען הפאגוציטי היא שהוא אינו מסכם באופן מלא את תהליך האפופטוזיס, שכן הקיבעון מונע מהתאים להתפצל לגופים אפופוטוטיים, אשר צפויים להיות phagocytosed מהר יותר בשל גודלם הקטן יותר. לא ידוע איזו השפעה יש קיבעון על הפרשת אותות "מצא אותי" נוקלאוטיד (למשל, ATP, UDP) מתא היעד המושכים פאגוציטים. בדומה לתאים אפופטוטיים, SH-SY5Ys הקבועים מציגים כמה קרום חלחול פרופידיום יודיד. קרום מחלחל קשור לשחרור של אותות "מצא אותי"; עם זאת, זה לא נחקר ב SH-SY5Ys קבוע, ואם הנוקלאוטיד משתחרר מהר מדי, הם יישטפו לפני SH-SY5Ys מתווספים iPSC-מקרופאגים.
השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול הוא כתמים של SH-SY5Ys מת עם אסתר STP של צבע פלואורסצנטי אדום רגיש ל- pH. צבע זה מגיב במהירות ובקובלנטיות עם אמינים ראשוניים בחינם על פני השטח של SH-SY5Ys המת. משך הכתמים לא צריך להיות ממוטב; עם זאת, יש להקפיד על טיפול בצבע לפני התיוג. אין לבצע את תגובת התיוג במאגרים המכילים אמינים בחינם. יתר על כן, קיים סיכון של משקעים אם מניית DMSO מדוללת במאגר מימי קר או בריכוז סופי גבוה. משקעים יופיעו כאובייקטים כהים צפופים מתחת למיקרוסקופ. בנוסף, תמיסת הצבע הרגישה ל-pH נדבקת לצינורות צנטריפוגות פלסטיק רגילים ונשטפת לאט; לכן, צינורות כריכה נמוכה מומלצים עבור שלב התיוג. שימוש בצבע רגיש ל-pH, במקום צבע פלואורסצנטי לצמיתות, מסייע לזיהוי חלקיקים נבלעים, לעומת חלקיקים השכנים לקרום הפלזמה. מכיוון שיש פלואורסצנטיות מסוימת ב- pH נייטרלי, יש לשמור על צפיפות המטען הפגוציטי ו- iPSC-מקרופאגים נמוכים מספיק עבור פילוח מדויק, אם כי גבוה מספיק כי אירועים פאגוציטיים רבים נתפסים. מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה הייתה מסוגלת לזהות במדויק פאגוציטוזיס עם צפיפות בינונית של מטען בבאר (יותר מ-2 SH-SY5Ys ל-iPSC-מקרופאג'). לעומת זאת, בשל רגישות חלשה יותר של המיקרוסקופ בספקטרום האדום העמוק, פילוח iPSC-מקרופאגים בנתוני ההדמיה של זמן לשגות של תאים חיים היה פחות בטוח והיה צורך להשתמש בצפיפות נמוכה מאוד של מטען כדי להפחית את הסבירות לחיוביות שגויות (1 SH-SY5Y עבור כל שני iPSC-מקרופאגים). אימות של פילוח נכון וצפיפות מטען צריך להתבצע עם השוואות בין בארות מטופלות וציטוצ'לאסין D טופלו. בבחינה ממוטבת היטב, ציטוצ'לאסין D אמור להפחית את מספר הנקודות הממוצע לתא ב-90% ביחס לדגימות שלא טופלו.
צעד קריטי נוסף בפרוטוקול הוא כתמי iPSC-מקרופאגים, המאפשר לזהות ולפלח את התא בניתוח תמונה כך שכל SH-SY5Ys חיצוניים לא ייכללו בספירה. הצבע המומלץ הוא חדור לתא, מומר למוצר פלואורסצנטי בלתי מסיס בתוך הציטופלסמה, ניתן לתיקון ולא רעיל (ראה טבלת חומרים). שלב ההכתמה היה ממוטב לשימוש iPSC-מקרופאגים עם phagocytosis הדמיה תוכן גבוה, ואנחנו מציעים שזה צריך להיות אופטימיזציה מחדש אם סוגים אחרים של תאים משמשים. ניתן להגדיל את משך הכתמת התא כדי לשפר את התצהיר של המוצר הפלואורסצנטי המסיס בתוך התאים. אם ריכוז הצבע מותאם, יש לנקוט זהירות כדי למנוע רמות רעילות של רכב ממס אורגני.
הגורם הקריטי השלישי להצלחת הבדיקה הוא ניתוח הנתונים. צינורות הניתוח המסופקים נועדו להיות של הדרכה ולא תיאורית מראש, כמו הבדלים בעוצמה מכתימה או מורפולוגיה של תאים יכול להפחית את האפקטיביות של פילוח של הצינורות כפי שנכתב. לפיכך, יידרשו מיטובים מסוימים, עם בדיקת הצינור בפקדים חיוביים ושליליים מתאימים, והפרמטרים שיש למטב מצוינים בטקסט הפרוטוקול. פקדים שליליים צריכים לכלול מצב שבו iPSC-מקרופאגים מטופלים מראש עם מעכב פאגוציטוזיס חזק כגון ציטוצלסין D לפני תוספת של SH-SY5Ys. שליטה שלילית אפשרית נוספת היא תוספת של SH-SY5Ys לבארות שלא טופלו בעבר של iPSC-מקרופאגים בסוף בדיקה, 10 דקות לפני הקיבעון, המאפשר קצת התיישבות של המטען אבל הוא קצר מדי עבור כמות ניכרת של phagocytosis להתרחש. אירוע פאגוציטוזיס מוגדר כאובייקט פלואורסצנטי אדום בתוך גבולות iPSC-מקרופאג ', המוגדר על ידי אלגוריתם התוכנה באמצעות ערוץ הפלואורסצנטיות האדום העמוק. אם הפילוח של התאים גרוע(איור 2),SH-SY5Ys רבים שאינם פאגוציטוס בסמיכות ל- iPSC-מקרופאגים עשויים להיכלל בטעות בניתוח, כלומר, תוצאות חיוביות שגויות. הגורם החשוב ביותר להשגת פילוח טוב הוא תיוג מחמיר של iPSC-מקרופאגים. פילוח עבור שני ניתוחים הוא אוטומטי, ולכן לא ניתן להשיג פילוח מושלם עבור כל תא; עם זאת, ניתן להתאים מספר פרמטרים כדי להפוך את הפילוח לאופטימלי יותר, תוך שימוש בכמה תמונות בדיקה כהפניה. בקרת Cytochalasin D חשובה להערכת פילוח אופטימלי מכיוון שמספר גבוה של אירועים פאגוציטיים שזוהו במצב זה מצביע על כך שהפילוח הוא תת אופטימלי. אופטימיזציה של צינור ניתוח הנתונים צריך לחזור באופן אידיאלי עד מספר האירועים הפאגוציטיים לתא הוא 80%-90% נמוך יותר במצב ציטוצלסין D לעומת אין מעכב.
הבעיות עם בדיקת phagocytosis כי הם הסבירים ביותר להתרחש הם: (1) פלואורסצנטיות חלשה רגישה ל- pH בבקרות חיוביות, (2) התפלגות דלילה או לא אחידה של מקרופאגים בסוף הבדיקה, או (3) מספרים גבוהים של חיובי שווא בניתוח מ SH-SY5Ys שאינם פאגוציטוס. פתרון בעיות של פלואורסצנטיות חלשה רגישה ל- pH צריך קודם כל לבדוק כי הכתם של SH-SY5Ys הביא גלולה תא עם צבע מגנטה חזק. אם הצבע חלש, ודאו שנעשה שימוש במלאי צבע טרי, ודאו כי מאגר התיוג נקי ממין, הוסיפו שטיפה נוספת ל-SH-SY5Y לפני הכתמים, בדקו אם המספר הנכון של SH-SY5Ys הוכתם, ודאו כי אין משקעים בצבע כראיות, ומיטבו את ריכוז התיוג של הצבע. אם ה-SH-SY5Ys מוכתמים מאוד, בדקו אם הריכוז שנוסף ללוח הבדיקה נכון, וודאו שה-iPSC-מקרופאגים בריאים ולא ישנים מדי. הסוג השני של בעיה, התפלגות מקרופאגים לא אחידה, יכול לנבוע מאובדן תאים במהלך צנרת ויש לנקוט צעדים כדי להפחית את כוחות הצינורות שחווים התאים, הימנעות טיפים צרים נשא. אם הבעיה נשארת, צמצם את זמן הדגירה של טעינת iPSC-מקרופאגים עם צבע מחלחל לתא. הבעיה השלישית, לגבי הכללה שגויה של חלקיקים שאינם phagocytosed בניתוח, עולה כי דרוש אופטימיזציה נוספת של צינור הניתוח. פתרון הבעיות צריך להתמקד תחילה בפילוח תאים ואם התוכנה כוללת אובייקטים סמוכים. פרמטרים ספציפיים שניתן להתאים מוצעים בהערות שמתחת לשלבים הרלוונטיים (שלבים 6.1.11-6.1.15 לניתוח זמן לשגות בתא חי ושלבים 6.2.4-6.2.8 לניתוח תוכן גבוה). אם לא ניתן לשפר עוד יותר את פילוח התאים, לניתוח התוכן הגבוה יש שלב נוסף (שלב 6.2.8) שאינו כולל מקרופאגים iPSC-מקרופאגים מפולחים באופן לא תקין. יתר על כן, ניתן למטב את המודול המסנן כתמים מקובלים של פלואורסצנטיות רגישה ל- pH בתוך iPSC-macrophages, להגדיל את עוצמת הסף של אובייקטים מקובלים, אשר אמור לעזור לא לכלול SH-SY5Ys שאינם phagocytosed (שלב 6.1.17 עבור ניתוח זמן לשגות זמן של תאים חיים, ושלב 6.2.11 לניתוח תוכן גבוה).
פיתחנו שני סוגים של קריאת מיקרוסקופיה לבדיקת הפאגוציטוזיס שלכל אחד מהם יש יתרונות ומגבלות. להדמיה בזמן של תאים חיים יש את היתרונות של מתן מידע נוסף על קינטיקה של פאגוציטוזיס והיא זמינה באופן נרחב יותר מאשר פלטפורמות הדמיה בעלות תוכן גבוה. תוכנת הקוד הפתוח המומלצת היא אגנוסטית למקור המיקרוסקופ וניתן להשתמש בה עם כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי באיכות טובה, עם או בלי יכולת זמן של תאים חיים. המגבלה העיקרית של הדמיית התא החי היא רגישות מוגבלת ואופטיקה, מה להפוך את זה מאתגר יותר לזהות ולבצע פילוח טוב של iPSC-מקרופאגים. ניתן להקל על מגבלה זו על-ידי הגדלת משך הכתמת iPSC-מקרופאגים, או על-ידי מעבר למיקרוסקופ רגיש יותר, אם הוא זמין. בדיקת phagocytosis הדמיה בעלת תוכן גבוה היא הקריאה המומלצת אם קיימת מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה. מערכות הדמיה בעלות תוכן גבוה מאפשרות תפוקה גבוהה יותר ונתונים אמינים יותר, ומאפשרות שימוש בבדיקה זו להקרנה, שבה צפוי Z חזק של ≥0.7 עבור פלט "מספר המקומות לתא"20. בהשוואה לשיטת זמן ההפוגה של התא החי, לקריאת המיקרוסקופיה בעלת התוכן הגבוה יש רגישות גבוהה יותר, רמה גבוהה יותר של אוטומציה ומהירות, ניתן לעבד יותר בארות ושדות הדמיה, ותמונות קונפוקליות ברזולוציה גבוהה מיוצרות. פילוח תאים יעיל יותר עם תמונות טובות, וסגמנטציה נעזרת בנוסף בתוכנת ניתוח הדמיה בעלת תוכן גבוה המספקת שיטות פילוח תאים רבות יותר המתאימות לתאים בעלי צורה חריגה ביותר. תוכנת ניתוח הדמיה בעלת תוכן גבוה חישבה גם פרמטרים נוספים של פאגוציטוזיס, בהשוואה לתוכנת הקוד הפתוח, כגון אחוז התאים הפאגוציטים. המגבלה העיקרית של בדיקת phagocytosis תוכן גבוה היא אחת של עלות ונגישות של מערכת ההדמיה ותוכנת ניתוח.
לסיכום, phagocytosis כמותי assay המוצג במאמר זה הוא כלי שימושי עבור מודל מיקרוגליה phagocytosis של נוירונים מתים במבחנה. המיקרוגליה מעוצבת על ידי iPSC-מקרופאגים והנוירונים המתים מעוצבים על ידי SH-SY5Ys קבוע paraformaldehyde. אמנם לא המיקרוגליה האותנטית ביותר ומודלים נוירונים מתים / אפופטוטיים שפורסמו, אלה קלים להכנה מדרגית. ה- assay עצמו הוא רב-תכליתי ביותר, עם שני סוגים של קריאת הדמיה מפורטת, ויש לו פוטנציאל להיות מותאם לשימוש עם מודלים שונים של מיקרוגליה / מקרופאג 'מונוקולטורה, או סוג תא אחר לשמש כמטען פאגוציטי. קריאת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה מועילה להשגת נתונים כמותיים וניתן להרחיב אותה עד לבדיקת אפננים של מולקולות קטנות של פאגוציטוזיס, או וריאנטים גנטיים של מסך ב- iPSC-מקרופאגים. עם זאת, מכיוון שמערכות הדמיה בעלות תוכן גבוה יקרות וכבדות נתונים, קריאה חלופית להדמיה נכללה בפרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות בתא חי, אשר ניתן להחליף כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי באיכות טובה, במידת הצורך.

מיקרוגליה הם מקרופאגים של רקמת המוח, ותפקודם כולל מעקב חיסוני, תיאום תגובות דלקתיות לפציעה/זיהום, שיפוץ סינפטי ופגוציטוזיס של תאים מתים, מיאלין, אגרגטים של חלבונים ופתוגנים. Phagocytosis הוא התהליך שבו מיקרוגליה לזהות מטען עם קולטני פני השטח ולארגן מחדש את הציטוסקלטון שלהם כדי לבלוע את האובייקט לתוך פאגום, אשר לאחר מכן מתמזג עם ליזוזומים להשפלה של המטען. תאי מוח אפופוטוטיים מיקרוגליה בריאים כדי להסיר אותם לפני שהם הופכים לנמק1. ה phagocytosis של תאים אפופוטוטיים ידוע גם בשם efferocytosis, ודורש תצוגה של אות פוספטידילסרין "לאכול-אותי" על ידי התא הגוסס2. קולטני מיקרוגליה רבים נקשרים ישירות לפוספטידילסרין, כולל TIM-4, BAI1, Stabilin-2 ו- TREM2. קולטני TAM מיקרוגליאליים (למשל, MERTK) ו integrins בעקיפין להיקשר פוספטידילסרין, באמצעות חלבוני אביזר GAS6 או MFG-E8, בהתאמה. אותות "לאכול אותי" אחרים עשויים להיות נחוצים להכרה בתאים גוססים, אלה כוללים שינויים בגליקוסילציה או מטען של חלבוני שטח; ביטוי של חלבונים תאיים ICAM3, calreticulin, annexin-I על פני התא; LDL מחומצן; או ציפוי של התא האפוטוטי על ידי מיקרוגליה המיוצרת C1q1,2.
מחלות ניווניות, כולל מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, דמנציה פרונטוטמפוראלית וטרשת אמיוטרופית לרוחב נקשרו לפגיעה בתפקוד המיקרוגליה, כולל הצטברות של מוצרי פסולת מוחית כגון תאים מתים, שברי מיאלין, אגרגטים של חלבונים, ותגובות דלקתיות מוגזמות לגירויים אלה3. Phagocytosis עלול להיפגע במחלות ניווניות ולתרום לפתולוגיה, בשל שילוב של הזדקנות, דלקת, או וריאנטים סיכון גנטי ספציפי4,5. מצד שני, יש גם עדויות של מודלים בעלי חיים של מחלות ניווניות כי מיקרוגליה עלולה באופן בלתי הולם phagocytose נוירונים קיימא או סינפסות6,7,8. המנגנון צפוי להיות מופעל על ידי תצוגת פוספטידילסרין של נוריטים פגומים, אשר חש ישירות על ידי קולטני פאגוציטוזיס מיקרוגליאלי TREM2 או GPR56, או חש בעקיפין על ידי ציפוי C1q משלים מסיסים הממברנה מועשרת פוספטידילסרין, המובילה לפגוציטוזיס9,10,11.
במבחנה בדיקות של פונקציית פאגוציטוזיס, למשל, כדי להעריך את ההשפעה הפנוטיפית של וריאנט סיכון גנטי במיקרוגליה, מבוצעים לעתים קרובות באמצעות מטענים לא פיזיולוגיים כגון חרוזי לטקס4. חיידקים וזימוסן מתויגים באופן פלואורסצנטי משמשים גם, שהם פיזיולוגיים אך אינם רלוונטיים למחלות ניווניות. מטענים פאגוציטיים לא פיזיולוגיים יכולים לשמש לזיהוי פגמים במכונות הבסיסיות של בלוע פאגוציטי, אך אינם מצליחים לדגמן במדויק את שלב ה"הכרה " הראשון בפגוציטוזיס של נוירונים אפופטוטיים. הגודל, הצורה, הנוקשות וסוג המטען מכתיבים גם את מסלולי האיתות התאיים המופעלים, מה שמוביל לתוצאות שונות של מצב הפעלת מיקרוגליה. לדוגמה, חיידקי E.coli הם קטנים ונוקשים, בניגוד לתאים אנושיים, ואת lipopolysaccharides על פני השטח שלהם מזוהים על ידי קולטן אגרה כמו 4 (TLR4) המפעיל פגוציטוזיס ומסלולי איתות פרו דלקתיים2,12.
בהקשר של מחקרי מחלות ניווניות, מטען פאגוציטי רלוונטי יותר יהיה תצוגת פוספטידילסרין על קרום פלזמה יונקים, ויהיה אידיאלי אנושי נוירוני, לכלול אותות כי מיקרוגליה צפויים להיתקל. עבור פרוטוקול פאגוציטוזיס זה, קו תאי הנוירובלסטומה האנושי SH-SY5Y נבחר כמודל נוירון קל לתרבות. תצוגה קבועה של פוספטידילסרין משטח הושרה באופן מלאכותי על ידי paraformaldehyde, אשר הוכח בעבר לגרום תצוגה פוספטידילסרין של טסיות דם13. עבור מודל התא מיקרוגליה אנושי iPSC-מקרופאגים שימשו, אשר לחקות את הפרופיל ontogeny ותעתיק של מיקרוגליה אנושית, והם phagocyticly מוסמך14,15,16,17. iPSC-מקרופאגים אינם מודל המיקרוגליה האותנטי ביותר הזמין, למשל, הם אינם מחקים מורפולוגיה של מיקרוגליה; עם זאת, ניתן להחליף אותו למודל IPSC מונוקולטורה אותנטי יותר של מיקרוגליה אם תרצה, כגון Haenseler ואח'15. מודלים IPSC אנושיים עדיפים על מיקרוגליה מכרסמים ראשונית לחקר ניוון עצבי, בשל חששות לגבי החפיפה המוגבלת של מודולי מיקרוגליה נצפו ברקמות מחלה נוירודגנרטיבית אנושית לעומת עכבר18. ה-SH-SY5Ys המתים מוכתמים בצבע רגיש לחומצה שנובע חלש ב-pH ניטרלי ובעוצמה רבה יותר בתוך הפגוליסוזומים של iPSC-מקרופאגים לאחר פאגוציטוזיס. שימוש בצבע רגיש לחומצה משפר את הדיוק של זיהוי אירועים פאגוציטיים, עם רב-תכליתיות לקריאות שונות של מקרופאגים חיים וקבועים19. פרוטוקול זה מתאר הן הדמיה בזמן-זמן של פאגוציטוזיס של תאים חיים והן לבדיקת הדמיה קבועה בעלת תוכן גבוה עבור פאגוציטוזיס, עם אותם שלבי הכנת תאים לפני הקריאה (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> איור 1: דיאגרמה סכמטית של מתודולוגיה. קו המתאר של phagocytosis אסאי, שבו הכנת SH-SY5Ys והכתמה של iPSC-מקרופאגים מבוצעים במקביל, ולאחר מכן SH-SY5Ys הם pipetted על iPSC-מקרופאגים. הדמיה בזמן לשגות תא חי מתבצעת באופן מיידי, או שהתאים מדגירים ב-37 °C/5% CO2 למשך הזמן הנדרש ומתוקנים לפני ביצוע מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה. PFA: paraformaldehyde, HBM: פנול ללא אדום ללא חציץ HEPES, pHr: pH רגיש צבע פלואורסצנטי STP אסתר פתרון, PRFMM: פנול אדום חינם מקרופאג מדיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>For centrifugation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L, 20-200 &#181;L, 100-1000 &#181;L single-channel micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Component of Factory media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>For fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell-800 24-well plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34815</td>
			<td>Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14085</td>
			<td>Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 &#956;M, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 laminar air flow safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, set to 37&#176;C and 5 % CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image Data Storage and Analysis System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11330</td>
			<td>Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20&#176;C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320074</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for CellTracker and pHrodo dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>Live-cell time-lapse imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube CY5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4656</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4650</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube RFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 10-547F</td>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant BMP4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-3</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC0033</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant VEGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein binding 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108.132</td>
			<td>For staining SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC9501</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel 20-200 uL pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For liquid handling of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td>High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36011</td>
			<td>pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 &#956;L (12.5 &#956;g) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette filler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as &#34;Factories&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for SH-SY5Y culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealers</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676001</td>
			<td>For assay plate storage and transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, set to 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418F</td>
			<td>Component of Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-744Q</td>
			<td>Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages

מיקרוגליה מתזמרת תגובות נוירואימוניות במספר מחלות ניווניות, כולל מחלת פרקינסון ומחלת אלצהיימר. מיקרוגליה לנקות נוירונים מתים וגוססים בתהליך של efferocytosis, צורה מיוחדת של פאגוציטוזיס. תפקוד הפגוציטוזיס יכול להיות משובש על ידי גורמי סיכון סביבתיים או גנטיים המשפיעים על מיקרוגליה. מאמר זה מציג פרוטוקול מיקרוסקופיה מהיר ופשוט במבחנה לחקר efferocytosis מיקרוגלילי במודל תאי גזע פלוריפוטנטים המושרה (iPSC) של מיקרוגליה, באמצעות קו תאים נוירובלסטומה אנושי (SH-SY5Y) המסומן בצבע רגיש ל- pH למטען הפגוציטי. התוצאה של ההליך היא תשואה גבוהה של תאי נוירובלסטומה מתים, המציגים פני השטח פוספטידילסרין, המוכרים כאות "לאכול אותי" על ידי פאגוציטים. בדיקת הלוח 96-well מתאימה להדמיה בזמן לשגות תא חי, או שניתן לתקן את הצלחת בהצלחה לפני עיבוד נוסף וכימות על ידי מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה. מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים מאפשרת להרחיב את ה- assay לבדיקה לבדיקה של מעכבי מולקולות קטנות או להערכת הפונקציה הפאגוציטית של קווי iPSC וריאנט גנטי. בעוד שביקורת זו פותחה כדי לחקור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים שלמים על ידי iPSC-מקרופאגים, ניתן להתאים את הבחינה בקלות למטענים אחרים הרלוונטיים למחלות ניווניות, כגון סינפטוזומים ומיאלין, וסוגי תאים פאגוציטים אחרים.

הדמיית זמן לשגות של תאים חיים בוצעה באמצעות הפרוטוקול שתויג בעבר, עם מקרופאגים מסוג iPSC מסוג פראי שנזרעו ב-20,000 תאים לבאר. כמויות שונות של SH-SY5Ys הוחלו (10,000-30,000 לבאר, מוערך מספירת התאים בשלב 3.1), ואת מעכב הפגוציטוזיס ציטואצ'אלסין D היה דגירה מראש (1 שעות) עם כמה בארות, מתנהג כמו בקרה כדי לעכב phagocytosis עבור כל כמות של SH-SY5Ys. ההדמיה החלה 40 דקות לאחר הוספת SH-SY5Ys ותמונות נלכדו במרווחים של 5 דקות למשך 3 השעות הבאות (הנתונים כוללים את העיכוב הראשוני של 40 דקות). סרטון ייצוגי של זמן לשגות נכלל בנתונים המשלימיםוניתח נתונים כמותיים המוצגים באיור 3. עם כמות של 10,000 SH-SY5Ys לבאר, מספר החלקיקים phagocytosed (כתמים) לתא גדל ליניארית עם הזמן, היה מעוכב על ידי כ 50% על ידי ציטוצ'אלסין D. העיכוב על ידי cytochalasin D היה חלש מהצפוי, ככל הנראה נגרם על ידי שכפולים טכניים או ביולוגיים מספיקים, כמו רק באר אחת לכל תנאי היה בתמונה עם שלושה שדות תמונה. עם כמויות גבוהות יותר של SH-SY5Ys לבאר (20,000 ו 30,000), phagocytosis הפגין ליניאריות ירודה, ככל הנראה בשל פילוח לקוי של iPSC-מקרופאגים ו SH-SY5Ys בשדה ראייה צפוף יותר.
הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים בוצעה באמצעות הפרוטוקול שתווה בעבר, עם מקרופאגים מסוג iPSC-macrophages מסוג בר ב-20,000 תאים לבאר, מספר כמויות שונות של SH-SY5Ys (10,000-80,000 לבאר), ולוח ה- Assay תוקן וצוות התמונה לאחר 5 שעות. תמונה מייצגת של פאגוציטוזיס מוצגת באיור 4A, והנתונים המנותחים המוצגים באיור 4B17. הגדלת כמות SH-SY5Ys הביאה למספר גבוה יותר של חלקיקים פאגוציטוס (כתמים) לתא; עם זאת, הכפלה של כמות SH-SY5Y מובילה רק לעלייה של פי 1.5 במספר הנקודות לתא. זה מצביע על כך שהסכומים שנבדקו אינם מגבילים את הקצב לפגוציטוזיס. לאחר מכן, בדיקה של פאגוציטוזיס הדמיה בעלת תוכן גבוה אומתה באמצעות מספר מעכבים של פאגוציטוזיס (איור 4C)17. מעכבי פילמור אקטין ציטוצ'לאסין D ו jasplakinolide עכבות באופן משמעותי פאגוציטוזיס על ידי 91% ו 90%, בהתאמה, כאשר דגירה מראש במשך 1 שעה לפני phagocytosis. Z' החזק של ה- assay כאשר ציטוצ'אלסין D או jasplakinolide משמשים פקדים שליליים מחושב כמו 0.7 ו 0.8, בהתאמה20. מעכב החמצת ליזוזום bafilomycin A1 הפחית באופן משמעותי פאגוציטוזיס על ידי 31%, כאשר דגירה 1 שעה לפני phagocytosis. ההשפעה החלשה יותר של מעכב החמצת ליזוזום לעומת מעכבי אקטין מצביעה על כך שזיהוי המטען המופנם עשוי שלא לדרוש החמצה מלאה של הפאגום. סיפוח רקומביננטי V שימש כפקד כדי לחסום במיוחד פוספטידילסרין שנחשף על פני השטח של SH-SY5Ys, מניעת קולטנים פאגוציטים מגישה לליגנד, אות חשוב "לאכול אותי". תוספת של סיפוח רקומביננטי V הפחיתה באופן משמעותי את הפאגוציטוזיס ב -30%, כאשר מוסיפים לבארות מיד לפני תוספת SH-SY5Y. קבוע SH-SY5Ys אושר לחשוף פוספטידילסרין, באמצעות גשושית סיפוח פלואורסצנטי V, ואילו SH-SY5Ys חי היו שליליים עבור כתמי סיפוח V(איור 4D).
קולטן הפגוציטוזיס המיקרוגליאלי TREM2 הוכח בעבר כחשוב עבור פאגוציטוזיס של נוירונים אפופוטוטיים21. מוטציה R47H של TREM2 הוא גן סיכון לתגלה מאוחרת של מחלת אלצהיימר, והוא משוער כדי להפחית את כריכת ליגנד של TREM223. במטרה להעריך את התפקוד הפגוציטי של R47H TREM2 ו- TREM2 KO, בדיקת הפגוציטוזיס בעלת התוכן הגבוה של התא הקבוע בוצעה באמצעות קווי iPSC-מקרופאגים איזוגניים עם WT/ R47H / KO TREM217. נבדקו מספר אורכים של משך הפגוציטוזיס מ 1 עד 5 שעות, באמצעות תוספת מדהימה של מטען פאגוציטי (40,000 SH-SY5Ys). האות המתקבל עולה באופן ליניארי ל-4 שעות, ומתייצב מעט ב-5 שעות(איור 5)17. שיעור phagocytosis מופחת וקיבולת (% תאים חיוביים נקודתיים) ניכר TREM2 KO לעומת WT, בעוד מוטציה R47H TREM2 לא הראה פאגוציטוזיס שונה. הפגוציטי פגוציט בתאי TREM2 KO אינו פנוקופי על ידי מוטציה R47H TREM2, לכאורה משום שתפקוד TREM2 מספיק כדי לתמוך בפגוציטוזיס רגיל.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> איור 3: נתונים לדוגמה לבדיקת פאגוציטוזיס בזמן של תאים חיים. ספיגת SH-SY5Ys מתים על ידי סוג פראי iPSC-מקרופאגים BIONi010-C (מזהה ECACC: 66540023) בתמונה במרווחים של 5 דקות למשך 3 שעות. הזמנים המוצגים בגרף הם מייזום של פאגוציטוזיס, כולל 40 הדקות הראשונות ללא מדידה. המספר הממוצע של כתמים לתא משלוש בארות משוכפלות משורטטים. Phagocytosis של 10,000 SH-SY5Ys מעוכב עם 10 μM ציטוצ'לאסין D עם 1 שעות טרום טיפול, בעוד כמויות גבוהות יותר של SH-SY5Ys (20,000 ו 30,000) יש כימות תת-אופטימלי של פאגוציטוזיס. ממוצע ± סטיית תקן (SD), N = 1 ניסוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> איור 4: אופטימיזציה ואימות של בדיקות פאגוציטוזיס בעלות תוכן גבוה בתאים קבועים. (A)תמונת מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה מייצגת של SH-SY5Ys phagocytos המופקת על ידי BIONi010-C מסוג iPSC-מקרופאגים (מזהה ECACC: 66540023). נקודת זמן של 3 שעות עם 40,000 SH-SY5Ys מוצגת. ערוצי פלואורסצנטיות ממוזגים, עם כתם iPSC-מקרופאג' המוצג כאותום, גרעינים כחולים ו- SH-SY5Ys כצהוב. החלונית inset היא מקטע של התמונה מוגדל 3x. (B) מספר כתמים לכל תא של SH-SY5Ys מת phagocytos לאחר 5 שעות, באמצעות כמויות שונות של תוספת מטען iPSC-מקרופאגים מסוג פראי. ממוצע ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע (SEM), עבור N = 3 קציר. (C)פאגוציטוזיס (3 שעות) מעוכב עם 10 μM ציטוצ'אלסין D (Cyt), 1 μM bafilomycin A1 (Baf), 1 μM jasplakinolide (עם 1 שעות טרום טיפול; Jas), ו 13 מיקרוגרם / מ"ל רקומביננטי נספח V (הוסיף בו זמנית SH-SY5Ys מת; אן). iPSC-מקרופאגים ללא SH-SY5Ys נוספו שימשו כפקד שלילי (-ve), והפקד החיובי (+ve) אינו מטופל iPSC-מקרופאגים עם SH-SY5Ys נוסף. הנתונים נוטרמלו לממוצע לחזרת הניסוי. פירושו ± SEM, עבור N = 3-6 יבולים ועם שני קווי תאים מסוג בר (SFC840-03-03, האפיון של קו זה מתואר ב ( פרננדס ואח'21 ו BIONi010-C). ANOVA בכיוון אחד עם הבדיקה שלאחר הוק של דאנט, השוואות לתאים לא מטופלים. * p < 0.05, ***p < 0.001. (D)כתם SH-SY5Ys קבוע טרי באופן אחיד לתצוגת פוספטידילסרין (annexin V-FITC) ויש להם חדור תאים מוגבל (יודיד פרופידיום). SH-SY5Ys חיים אינם מכתימים עבור נספח V-FITC או פרופידיום יודיד, למעט כתמי מוקד הקיימים על התאים המתים המעטים בתרבית. הנתונים משוחזרים באישור ממחקר אלצהיימר וטיפול17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> איור 5: פאגוציטוזיס מופחתת ב- TREM2 KO אך לא ב- R47H TREM2 iPSC-מקרופאגים. בדיקות פאגוציטוזיס בעלות תוכן גבוה שבוצעו עם 40,000 SH-SY5Ys לבאר עם תוספות מדהימות. האמצעים היו כימותו עבור הפרמטרים: מספר כתמים לתא, סכום אזורי ספוט (μm2) לתא, ואחוז התאים המכילים חלקיקים phagocytosed לכל שדה. הנתונים היו מנורמלים למשמעות של כל גנוטיפ לניסוי. ממוצע ± SEM, עבור N = 3 יבולים. ANOVA דו-כיווני חוזר, המבחן שלאחר ההוק של Dunnett, השוואות זוגיות ל- WT עבור כל פעם: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. הנתונים משוחזרים באישור ממחקר אלצהיימר וטיפול17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים S1: QC לדוגמה להכנת SH-SY5Ys. SH-SY5Ys מנותקים תוקנו במשך 10 דקות עם 0% (תאים חיים), 1%, ו 2% של paraformaldehyde (PFA), ולאחר מכן שטף. התאים הוכתמו באגף V-FITC ו-propidium iodide (PI) ונמדדו מיד על ידי ציטומטריית זרימה. התוויות נקודות צפיפות צבע נוצרו בתוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה, באמצעות הפקדים המוכתמים הבודדים והבלתי מזוהמים כדי להציב שער רבע. לרבעים יש ביאורים עם אחוז האירועים בתוך הרביע הזה. תאים חיים הם בעיקר ברבעון הרביעי, ותאים קבועים הם בעיקר ברבעון השני. Q1 = annexin V-/PI-, Q2 = annexin V+/PI+, Q3 = annexin V+/PI-, Q4 = annexin V-/PI- (תאים חיים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
וידאו משלים: פאגוציטוזיס בזמן-זמן-זמן-תא חי. וידאו מייצג של SH-SY5Ys phagocytosed על ידי סוג פראי iPSC-מקרופאגים BIONi010-C (מזהה ECACC: 66540023). התמונות צולמו כל 5 דקות במשך 3 שעות. הווידאו נחתך ופועל במהירות של 3 פריימים לשנייה, ומראה את 1.5 השעות האחרונות של ה-assay. ה-SH-SY5Ys המוכתמים בצבע רגיש לחומצה מוצגים באדום ועוצמת האות עולה עם החמצה פאגוזום. גרעיני תאים מוכתמים בהוכסט 33342 מוצגים בכחול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

מחלות ניווניות קשורות לתפקודי מיקרוגליה דיסרגטיים. מאמר זה מתאר במבחנה של פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה על ידי iPSC-מקרופאגים. קריאות מיקרוסקופיה כמותית מתוארות הן עבור הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים והן עבור הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים.

במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

בדיקה זו של הדמיית במבחנה מאפשרת לכמת את ההשפעה של טיפולים שונים בתאים או גנוטיפים שונים על פגוציטוזיס מיקרוגליאלי. באמצעות שני סוגי תאים הרלוונטיים למחלות ניווניות, אנו משתמשים בתאי נוירובלסטומה מתים עבור המטען הפגוציטי, אשר מוכנים באופן שניתן להגדיל בקלות ובזול על ידי מסכי הדמיה גדולים בעלי תוכן גבוה. בארון בטיחות ביולוגי מדרגה 2, נתק SH-SY5Ys על ידי שאיפת המדיום.הוסף 4 מ"ל של מאגר דיסוציאציה של תאים, והסר את המאגר באופן מיידי כך שפחות מ- 1 מ"ל יישאר כסרט דק המצפיף את התאים. דגירה במשך 2 עד 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ואז ב 10 מ"ל של HBSS לבקבוק T-75.וצינורות SH-SY5Ys לתוך צינור צנטריפוגה חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-400xG למשך 5 דקות. שאפו את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של פנול ללא אדום HEPES מדיה חוצצת, הקפד לשבור גושים לפני קיבעון.תקן את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של 4% פורמלדהיד כוח לצינור ודגרה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה מדי פעם. הוסף 10 מ"ל של HBSS לצינור. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1200xG במשך 7 דקות.שאפו את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולה התא ב 2 מ"ל של פנול אדום חינם HEPES חוצץ מדיה. לספור ולהסיר 1 מיליון תאי HS-SY5Y לתוך צינור 2 מ"ל חלבון מחייב נמוך. הבא את הנפח הכולל ל- 300 עד 500 מיקרוליטרים עם מדיה חוצצה נטולת פנול HEPES.ואז לחמם לזמן קצר את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לערוך מחדש את אסתר STP צבע פלואורסצנטי אדום רגיש pH בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן הוסיפו 12.5 מיקרוגרם צבע למיליון תאי SH-SY5Y.מערבבים בעדינות על ידי הבהוב הצינור. ודגרת הצינור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, מוגן מפני אור. מוסיפים 1 מ"ל של HBSS וצנטריפוגה ב 1200xG במשך 7 דקות ו 4 מעלות צלזיוס.זרוק את סופר-טבעי. ולשטוף עם 2 מ"ל של HBSS. להשעות מחדש את גלולה התא בפנול אדום חינם מקרופאגים מדיה לריכוז של 0.2 עד 1.2 מיליון תאים למ"ל, כך 50 microliters מכילים 10, 000 עד 60, 000 תאים.בארון בטיחות ביולוגי, להכין פתרון של תא פלואורסצנטי עמוק אדום חלחל צבע אקסטר תגובתי בתקשורת מקרופאגים. הוסף Hoechst 33342, ולחמם את פתרון העבודה ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. שאפו את המקרופאג' של IPSC בעדינות, על ידי הזרקת סופרנט התא עם פיפטה רב ערוצית למאגר סטרילי.הוסף 70 מיקרוליטרים לבאר של פתרון הצבע למקרופאגים של iPSC באמצעות פיפטה רב-ערוצית. דגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. תיקון טיפולים ניסיוניים בתקשורת מקרופאג' נטולת אדום פנול.לאחר הדגירה, שאפו את המדיום מקרופאג' IPSC בעדינות רבה עם פיפטה רב ערוצית, והוסיפו 100 מיקרוליטרים של HBSS לבאר. הסר מיד HBSS על ידי צנרת עדינה. לאחר מכן להוסיף 100 microliters של פנול אדום חינם מקרופאג מדיה, בתוספת טיפולים ניסיוניים בבארות נפרדות.דגירה במשך 10 דקות עד שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. השתמש בצינור רב ערוצי כדי להוסיף 50 מיקרוליטרים של SH-SY5Ys שכותרתו לבאר מצדי כל באר בקצה הנוזל. ואז לדגור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 3 עד 5 שעות.לאחר הדגירה של פאגוציטוזיס, שאפו בעדינות את צינורות-על התאים על ידי צנרת עם פיפטה רב ערוצית והשליכו. לשטוף פעם אחת עם 100 microliters של PBS. לאחר מכן לתקן את התאים על ידי הוספת 100 microliters של 2% פורמלדהיד כוח ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.שאפו בארות והוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS. או להמשיך ישירות להדמיה עם מיקרוסקופ תוכן גבוה, או לכסות עם איטום צלחת רדיד אלומיניום, ולאחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס, עד הצורך. הפעל את מיקרוסקופ ההדמיה בעל התוכן הגבוה ופתח את תוכנת לכידת התמונות.טען את צלחת בדיקת לתוך המיקרוסקופ על ידי לחיצה על סמל LOAD"בחלק העליון של המסך. בחר את הכרטיסיה SETUP". בתפריטים הנפתחים בתיבה הימנית העליונה, בחר את סוג הלוח המתאים.אפשרות המיקוד האוטומטי: שתי שיא"המטרה:40x מים, NA 1.1"קונפוקלי", ו Binning של 1. יש לשטוף את המטרה 40x Water לפני השימוש דרך תפריט ההגדרות. בתיבת הבחירה של הערוץ, השתמש בסמל הפלוס כדי להוסיף את הערוצים DAPI, Alexa 647 ו- Alexa 568.הגדר אלה כדי למדוד במישור אחד של מיקרומטר אחד. מטב את הגדרות הזמן והחשמל ליעילות הכתמים של צלחת ה- assay. ודא הערוצים אינם נמדדים בו זמנית, על ידי לחיצה על רצף הערוצים כדי להפריד את הערוצים.תחת ניווט והגדר פריסה, בחר את בארות המידה ובחר 9 עד 12 שדות לבאר. במהלך ההתקנה, לחץ על שדה מייצג במפת הלוח. ובדוק כל ערוץ מדידה בתורו כדי לוודא שהכתמים קיימים, ושהתמונות ממוקדות על-ידי התאמת היסט הערוץ.כדי להעלות את הנתונים לשרת לניתוח מרחוק, לחץ על התיבה משימות מקוונות ושם המסך הרלוונטי. שמור את פרוטוקול ה- assay על ידי לחיצה על כפתור השמירה, ולחץ על ניסוי הריצה"כרטיסיה בחלק העליון. שם צלחת הניסוי, ולאחר מכן לחץ על start"זמן תא חי חי phagocytosis בדיקה הראה כי עם 10, 000 SH-SY5Ys לכל טוב, מספר חלקיקי פאגוציטוז לתא גדל ליניארית עם הזמן היה מעוכב על ידי כ 50%ידי Cytochalasin D.עם כמויות גבוהות יותר של SH-SY5Ys לבאר, phagocytosis הפגין ליניאריות ירודה, ככל הנראה בשל פילוח לקוי של iPSC, מקרופאגים ו- SH-SY5Y בשדה ראייה צפוף יותר.התוצאות הבאות התקבלו על ידי ביצוע הדמיה של תוכן גבוה של תאים קבועים, כולל תמונה מייצגת זו של פאגוציטוזיס. הגדלת כמות SH-SY5Ys הביאה למספר גבוה יותר של חלקיקי פאגוציטוס לתא. התזווגות אסאי אומתה באמצעות מספר מעכבים של פאגוציטוזיס.ציטוצ'אלסין D ו Jasplakinolide עכבות באופן משמעותי פאגוציטוזיס על ידי 91 ו 90 אחוזים בהתאמה. ו Bafilomycin A1 הפחית באופן משמעותי פאגוציטוזיס על ידי 31%כאשר דגירה מראש במשך שעה אחת לפני phagocytosis. תוספת של נספח רקומביננטי 5 מופחת באופן משמעותי phagocytosis על ידי 30%כאשר נוסף בארות מיד לפני תוספת SH-SY5Y.קבוע SH-SY5Ys אנו אישרו לחשוף פוספטידילסרין באמצעות גשושית אגף פלואורסצנטי 5. בעוד ש-SH-SY5Ys חיים היו שליליים עבור כתמי נספח 5. מספר אורכים של משך פאגוציטוזיס, מ 1 עד 5 שעות, נבדקו באמצעות תוספת מדהימה של מטען פאגוציטי.ניתן לקצר את האורך הכולל של פרוטוקול זה על ידי הכנת המטען הפאגוציטי והכתמת המקרופאגים של IPSC במקביל. אם אתה רוצה לעשות זאת, לעבוד על התזמונים מראש, ולהשתמש הדגירה שלך כדי להכין פתרונות לשלבים העתידיים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

PH הרומן חוץ גופית ב- Live-הדמיה בתיווך וזמינותו של אסטרוציט Phagocytosis-שימוש Synaptosomes מצומדת-מחוון

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

במבחנה שיטת לימוד הצבירה של חלבון טאו, והתרופות הקרנה

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...