Name: in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

Gli autori ringraziano il Dr. Val Millar e il Dr. Sohaib Nizami per la loro assistenza con la microscopia ad alto contenuto e il Dr. Daniel Ebner per l'accesso ai microscopi ad alto contenuto. Inoltre, gli autori ringraziano la dottoressa Emma Mead per i consigli sullo sviluppo del test e la signora Cathy Browne per il supporto iPSC. Questo lavoro è stato supportato dall'Alzheimer's Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, grant reference ARUK-2020DDI-OX), con ulteriore supporto alla James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) della Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award dal Parkinson's UK (J-1403); MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 e Momentum MC_PC_16034 Awards.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le microglia hanno importanti funzioni che influenzano l'inizio e la progressione delle malattie neurodegenerative, compresa la fagocitosi dei neuroni apoptotici. La fagocitosi microgliale compromessa e la fagocitosi inappropriata delle sinapsi sono state entrambe associate a malattie neurodegenerative, sebbene i meccanismi sottostanti e la causalità non siano ben compresi4,23. Questo documento delinea un test di fagocitosi per misurare la fagocitosi delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi iPSC, con una lettura di imaging time-lapse a cellule vive o una microscopia ad alto contenuto a cellule fisse, o una combinazione di entrambi su un singolo test. Questa versatilità significa che il test può essere utilizzato per studiare singoli eventi fagocitici nel tempo in pochi pozzeggi o utilizzato per screening ad alto contenuto con più condizioni o trattamenti. Poiché il saggio ad alto contenuto è fissato in un singolo punto temporale, è possibile preparare più piastre di analisi contemporaneamente. Il test ad alto contenuto ha una potenziale utilità per caratterizzare macrofagi / microglia con varianti genetiche associate alla malattia o per lo screening di inibitori di piccole molecole per le modifiche alla fagocitosi. Il test può anche essere facilmente adattato per studiare la fagocitosi di altri modelli di microglia o potenzialmente astrociti. Il test della fagocitosi può potenzialmente essere multiplexato con macchie di imaging di cellule vive, ad esempio mitocondri, calcio o indicatori ROS e può essere eseguita una colorazione immunofluorescente post-fissazione per proteine di interesse. Rispetto ai saggi di fagocitosi esistenti che utilizzano cellule neuronali apoptotiche, i principali vantaggi che questo protocollo conferisce è che la preparazione del carico fagocitico è relativamente semplice e rapida e si traduce in un prodotto uniforme. Altri saggi inducono apoptosi di neuroni o SH-SY5Ys con S-nitroso-L-cisteina per 2 h25, acido okadaico per 3 h22, staurosporina per 4-16 h26,27,28,29 o irradiazione UV per 24 h30e possono provocare cellule in diversi stadi di apoptosi. Inoltre, l'imaging di cellule vive e le lettura di immagini ad alto contenuto non sono state precedentemente descritte, per quanto ne sanno gli autori. Il principale limite dell'uso della fissazione della paraformaldeide per preparare il carico fagocitico è che non ricapitola completamente il processo di apoptosi, poiché la fissazione impedisce alle cellule di dividersi in corpi apoptotici, che probabilmente saranno fagocitosi più rapidamente a causa delle loro dimensioni più piccole. Non è noto quale effetto abbia la fissazione sulla secrezione di segnali nucleotidici "trovami" (ad esempio, ATP, UDP) dalla cellula bersaglio che attirano i fagociti. Simile alle cellule apoptotiche, le SH-SY5Y fisse mostrano una certa permeabilità della membrana allo ioduro di propidio. La permeabilità della membrana è associata al rilascio di segnali "trovami"; tuttavia, questo non è stato studiato negli SH-SY5Y fissi e, se il nucleotide viene rilasciato troppo rapidamente, verrebbe lavato via prima che gli SH-SY5Y vengano aggiunti ai macrofagi iPSC.
Il primo passo critico nel protocollo è la colorazione di SH-SY5Y morti con un estere STP di un colorante fluorescente rosso sensibile al pH. Questo colorante reagisce rapidamente e covalentemente con ammine primarie libere sulla superficie delle SH-SY5Y morte. La durata della colorazione non ha bisogno di essere ottimizzata; tuttavia, è necessario prestare attenzione con la manipolazione del colorante prima dell'etichettatura. La reazione di etichettatura non deve essere eseguita in tamponi contenenti ammine libere. Inoltre, vi è il rischio di precipitazioni se lo stock dmSO viene diluito in un tampone acquoso freddo o ad alta concentrazione finale. I precipitati appariranno come oggetti scuri densi al microscopio. Inoltre, la soluzione colorante sensibile al pH si attacca ai normali tubi di centrifuga in plastica e si lava via lentamente; pertanto, i tubi a bassa legatura sono raccomandati per la fase di etichettatura. L'uso di un colorante sensibile al pH, invece di un colorante permanentemente fluorescente, aiuta l'identificazione delle particelle inghiottite, rispetto alle particelle che si trovano vicino alla membrana plasmatica. Poiché c'è una certa fluorescenza a pH neutro, la densità del carico fagocitico e dei macrofagi iPSC deve essere mantenuta abbastanza bassa per una segmentazione accurata, anche se abbastanza alta da catturare numerosi eventi fagocitici. La microscopia ad alto contenuto è stata in grado di identificare con precisione la fagocitosi con una media densità di carico nel pozzo (più di 2 SH-SY5Y per iPSC-macrofago). Al contrario, a causa della minore sensibilità del microscopio nello spettro rosso intenso, la segmentazione dei macrofagi iPSC nei dati di imaging time-lapse delle cellule vive era meno sicura ed era necessario utilizzare una densità di carico molto bassa per ridurre la probabilità di falsi positivi (1 SH-SY5Y per ogni due macrofagi iPSC). La convalida della corretta segmentazione e densità del carico deve essere eseguita con confronti tra pozzi non trattati e citocalasina trattati con D. In un test ben ottimizzato, la citocalasina D dovrebbe ridurre il numero medio di macchie per cellula del 90% rispetto ai campioni non trattati.
Un altro passo critico nel protocollo è la colorazione iPSC-macrofagica, che consente di identificare e segmentare la cellula nell'analisi delle immagini in modo che eventuali SH-SY5Y esterni siano esclusi dal conteggio. Il colorante raccomandato è permeante cellulare, convertito in un prodotto fluorescente insolubile all'interno del citoplasma, fissabile e non tossico (vedi Tabella dei materiali). La fase di colorazione è stata ottimizzata per l'uso di macrofagi iPSC con il test di fagocitosi di imaging ad alto contenuto e suggeriamo che dovrebbe essere ri-ottimizzato se vengono utilizzati altri tipi di cellule. La durata della colorazione cellulare può essere aumentata per migliorare la deposizione del prodotto fluorescente insolubile all'interno delle cellule. Se la concentrazione del colorante è ottimizzata, è necessario prestare attenzione per evitare livelli tossici del veicolo solvente organico.
Il terzo fattore critico per il successo del test è l'analisi dei dati. Le pipeline di analisi fornite sono destinate ad essere di orientamento piuttosto che prescrittive, poiché le differenze nell'intensità della colorazione o nella morfologia cellulare possono ridurre l'efficacia della segmentazione delle tubazioni come scritto. Saranno quindi necessarie alcune ottimizzazioni, con test della pipeline su opportuni controlli positivi e negativi, e i parametri che dovrebbero essere ottimizzati sono indicati nel testo del protocollo. I controlli negativi dovrebbero includere una condizione in cui i macrofagi iPSC sono pre-trattati con un potente inibitore della fagocitosi come la citocalasina D prima dell'aggiunta di SH-SY5Ys. Un altro possibile controllo negativo è l'aggiunta degli SH-SY5Y a pozzezze precedentemente non trattati di macrofagi iPSC alla fine del test, 10 minuti prima della fissazione, che consente un certo assestamento del carico ma è troppo breve per una quantità apprezzabile di fagocitosi. Un evento di fagocitosi è definito come un oggetto rosso-fluorescente all'interno dei bordi di un macrofago iPSC, definito dall'algoritmo software che utilizza il canale di fluorescenza rosso profondo. Se la segmentazione delle cellule è scarsa (Figura 2), molti SH-SY5Y non fagocitosi in prossimità di iPSC-macrofagi possono essere erroneamente inclusi nell'analisi, cioè falsi positivi. Il fattore più importante per ottenere una buona segmentazione è la delineazione rigorosa dei macrofagi iPSC. La segmentazione per entrambe le analisi è automatizzata, quindi non è possibile ottenere una segmentazione perfetta per ogni cellula; tuttavia, alcuni parametri possono essere regolati per rendere la segmentazione più ottimale, utilizzando alcune immagini di prova come riferimento. Il controllo della citocalasina D è importante per valutare la segmentazione ottimale perché un numero elevato di eventi fagocitici rilevati in questa condizione indica che la segmentazione è sub-ottimale. L'ottimizzazione della pipeline di analisi dei dati dovrebbe idealmente essere ripetuta fino a quando il numero di eventi fagocitici per cellula è inferiore dell'80%-90% nella condizione di citocalasina D rispetto a nessun inibitore.
I problemi con il test della fagocitosi che hanno maggiori probabilità di verificarsi sono: (1) debole fluorescenza sensibile al pH nei controlli positivi, (2) distribuzione sparsa o irregolare dei macrofagi alla fine del test o (3) un numero elevato di falsi positivi nell'analisi da SH-SY5Y non fagocitosi. La risoluzione dei problemi di debole fluorescenza sensibile al pH dovrebbe in primo luogo verificare che la colorazione degli SH-SY5Ys abbia provocato un pellet cellulare con un forte colore magenta. Se il colore è debole, assicurarsi che venga utilizzato un colorante fresco, assicurarsi che il tampone di etichettatura sia privo di ammine, aggiungere un lavaggio extra agli SH-SY5Y prima della colorazione, verificare se il numero corretto di SH-SY5Y è stato colorato, assicurarsi che non siano presenti precipitati di colorante e ottimizzare la concentrazione di etichettatura del colorante. Se gli SH-SY5Y sono fortemente macchiati, controllare se la concentrazione aggiunta alla piastra del saggio è corretta e assicurarsi che i macrofagi iPSC siano sani e non troppo vecchi. Il secondo tipo di problema, la distribuzione irregolare dei macrofagi, può derivare dalla perdita di cellule durante il pipettaggio e dovrebbero essere prese misure per ridurre le forze di pipettaggio sperimentate dalle cellule, evitando punte a foro stretto. Se il problema persiste, ridurre il tempo di incubazione del caricamento dei macrofagi iPSC con colorante cell-permeante. Il terzo problema, riguardante l'errata inclusione di particelle non fagocitose nell'analisi, indica che è necessaria una maggiore ottimizzazione della pipeline di analisi. La risoluzione dei problemi dovrebbe concentrarsi in primo luogo sulla segmentazione delle celle e sul fatto che il software includa oggetti adiacenti. I parametri specifici che possono essere regolati sono suggeriti nelle note sottostanti i passaggi pertinenti (passaggi 6.1.11-6.1.15 per l'analisi time-lapse live-cell e passaggi 6.2.4-6.2.8 per l'analisi ad alto contenuto). Se la segmentazione cellulare non può essere ulteriormente migliorata, l'analisi ad alto contenuto ha un passo in più (passo 6.2.8) che esclude i macrofagi iPSC segmentati in modo improprio. Inoltre, il modulo che filtra le macchie accettate di fluorescenza sensibile al pH all'interno dei macrofagi iPSC può essere ottimizzato, aumentando l'intensità di soglia degli oggetti accettati, il che dovrebbe aiutare a escludere SH-SY5Y non fagocito (passo 6.1.17 per l'analisi time-lapse delle cellule vive e passo 6.2.11 per l'analisi ad alto contenuto).
Abbiamo sviluppato due tipi di lettura al microscopio per il test della fagocitosi che presentano vantaggi e limitazioni. L'imaging time-lapse a cellule vive ha il merito di fornire informazioni aggiuntive sulla cinetica della fagocitosi ed è più ampiamente disponibile rispetto alle piattaforme di imaging ad alto contenuto. Il software open source consigliato è agnostico rispetto alla sorgente del microscopio e potrebbe essere utilizzato con qualsiasi microscopio fluorescente di buona qualità, con o senza capacità di time-lapse di cellule vive. Il principale limite dell'imaging delle cellule vive è la sensibilità e l'ottica limitate, che rendono più difficile rilevare ed eseguire una buona segmentazione dei macrofagi iPSC. Questa limitazione potrebbe essere mitigata aumentando la durata della colorazione dei macrofagi iPSC o passando a un microscopio più sensibile, se disponibile. Il test di fagocitosi di imaging ad alto contenuto è la lettura raccomandata se è disponibile un sistema di imaging ad alto contenuto. I sistemi di imaging ad alto contenuto consentono un throughput più elevato e dati più affidabili, consentendo di utilizzare questo test per lo screening, in cui ci si aspetterebbe un robusto Z' di ≥0,7 per l'uscita "numero di punti per cella"20. Rispetto al metodo time-lapse live-cell, la lettura al microscopio ad alto contenuto ha una maggiore sensibilità, un maggiore grado di automazione e velocità, è possibile elaborare più pozzi e campi di imaging e produrre immagini confocali ad alta risoluzione. La segmentazione cellulare è più efficace con buone immagini e la segmentazione è inoltre aiutata dal software di analisi di imaging ad alto contenuto che fornisce più metodi di segmentazione cellulare adatti a cellule di forma altamente irregolare. Il software di analisi di imaging ad alto contenuto ha anche calcolato più parametri di fagocitosi, rispetto al software open source, come la percentuale di cellule fagocitiche. Il principale limite del test di fagocitosi ad alto contenuto è quello del costo e dell'accessibilità del sistema di imaging e del software di analisi.
In conclusione, il saggio quantitativo di fagocitosi presentato in questo articolo è uno strumento utile per modellare la fagocitosi delle microglia dei neuroni morti in vitro. Le microglia sono modellate da iPSC-macrofagi e i neuroni morti sono modellati da SH-SY5Y fissati alla paraformaldeide. Sebbene non siano i modelli di microglia e neuroni morti / apoptotici più autentici pubblicati, questi sono facili da preparare e scalabili. Il test stesso è altamente versatile, con due tipi di lettura dell'imaging dettagliati, e ha il potenziale per essere adattato per l'uso con diversi modelli di monocoltura di microglia / macrofagi o un diverso tipo di cellula per agire come carico fagocitico. La lettura di immagini ad alto contenuto è vantaggiosa per ottenere dati quantitativi e può essere scalata fino a saggiare modulatori di piccole molecole di fagocitosi o varianti genetiche di screening nei macrofagi iPSC. Tuttavia, poiché i sistemi di imaging ad alto contenuto sono costosi e pesanti per i dati, una lettura di imaging alternativa è stata inclusa nel protocollo utilizzando un microscopio time-lapse a cellule vive, che potrebbe essere sostituito da qualsiasi microscopio a fluorescenza convenzionale di buona qualità, se necessario.

Le microglia sono macrofagi residenti nei tessuti cerebrali e le loro funzioni includono la sorveglianza immunitaria, il coordinamento delle risposte infiammatorie a lesioni / infezioni, il rimodellamento sinaptico e la fagocitosi di cellule morte, mielina, aggregati proteici e agenti patogeni. La fagocitosi è il processo attraverso il quale le microglia riconoscono il carico con i recettori di superficie e riorganizzano il loro citoscheletro per inghiottire l'oggetto in un fagosoma, che poi si fonde con i lisosomi per la degradazione del carico. Microglia sane fagocitosi apoptotiche cellule cerebrali per rimuoverle prima che diventino necrotiche1. La fagocitosi delle cellule apoptotiche è anche nota come efferocitosi e richiede la visualizzazione di un segnale "eat-me" di fosfatidilserina da parte della cellula morente2. Numerosi recettori della microglia si legano direttamente alla fosfatidilserina, tra cui TIM-4, BAI1, Stabilin-2 e TREM2. I recettori TAM microgliali (ad esempio, MERTK) e le integrine si legano indirettamente alla fosfatidilserina, utilizzando rispettivamente le proteine accessorie GAS6 o MFG-E8. Altri segnali "eat-me" possono essere necessari per il riconoscimento delle cellule morenti, questi includono cambiamenti nella glicosilazione o nella carica delle proteine di superficie; espressione di proteine intracellulari ICAM3, calreticulina, annessina-I sulla superficie cellulare; LDL ossidato; o rivestimento della cellula apoptotica da parte del complemento prodotto dalla microglia C1q1,2.
Le malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, la demenza frontotemporale e la sclerosi laterale amiotrofica sono state associate a compromissione della funzione della microglia, tra cui un accumulo di prodotti di scarto del cervello come cellule morte, frammenti di mielina e aggregati proteici e risposte infiammatorie esagerate a questi stimoli3. La fagocitosi può essere compromessa nelle malattie neurodegenerative e contribuire alla patologia, a causa di una combinazione di invecchiamento, infiammazione o specifiche varianti di rischio genetico4,5. D'altra parte, ci sono anche prove da modelli animali di malattie neurodegenerative che la microglia può inappropriatamente fagocitosi neuroni vitali o sinapsi6,7,8. È probabile che il meccanismo sia istigato dalla visualizzazione di fosfatidilserina di neuriti danneggiati, che viene direttamente rilevata dai recettori della fagocitosi microgliale TREM2 o GPR56, o indirettamente percepita dal complemento solubile C1q che riveste la membrana arricchita di fosfatidilserina, portando alla fagocitosi mediata da CR39,10,11.
I saggi in vitro della funzione di fagocitosi, ad esempio per valutare l'impatto fenotipico di una variante a rischio genetico nella microglia, vengono spesso eseguiti utilizzando carichi non fisiologici come le perle di lattice4. Vengono utilizzati anche batteri e zimosan etichettati fluorescentemente, che sono fisiologici ma non rilevanti per le malattie neurodegenerative. I carichi fagocitici non fisiologici possono essere utilizzati per rilevare difetti nel meccanismo di base dell'inghiottimento fagocitico, ma non riescono a modellare con precisione il primo passaggio di "riconoscimento" nella fagocitosi dei neuroni apoptotici. Le dimensioni, la forma, la rigidità e il tipo di carico dettano anche le vie di segnalazione intracellulare che vengono attivate, portando a diversi esiti dello stato di attivazione della microglia. Ad esempio, i batteri E.coli sono piccoli e rigidi, a differenza delle cellule umane, e i lipopolisaccaridi sulla loro superficie sono riconosciuti dal recettore Toll-like 4 (TLR4) che attiva la fagocitosi e le vie di segnalazione pro-infiammatorie2,12.
Nel contesto degli studi sulle malattie neurodegenerative, un carico fagocitico più rilevante avrebbe una visualizzazione di fosfatidilserina sulle membrane plasmatiche dei mammiferi e, idealmente, sarebbe umano e neuronale, per includere segnali che le microglia potrebbero incontrare. Per questo protocollo di fagocitosi, la linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y è stata scelta come modello di neurone facile da coltura. La visualizzazione permanente della fosfatidilserina superficiale è stata indotta artificialmente dalla paraformaldeide, che in precedenza ha dimostrato di causare la visualizzazione della fosfatidilserina delle piastrine13. Per il modello di cellule della microglia sono stati utilizzati iPSC-macrofagi umani, che imitano l'ontogenesi e il profilo trascrizionale della microglia umana e sono fagociticamente competenti14,15,16,17. i macrofagi iPSC non sono il modello di microglia più autentico disponibile, ad esempio, non imitano la morfologia della microglia; tuttavia, si può sostituirlo con un modello di microglia iPSC monocoltura più autentico, se lo si desidera, come Haenseler et al.15. I modelli iPSC umani sono preferibili alla microglia primaria dei roditori per lo studio della neurodegenerazione, a causa delle preoccupazioni sulla limitata sovrapposizione dei moduli trascrizionali della microglia osservati nei tessuti delle malattie neurodegenerative umane rispetto a quelle dei topi18. Gli SH-SY5Y morti sono colorati con un colorante acido-sensibile che fluoresce debolmente a pH neutro e più fortemente all'interno dei fagolisiosomi dei macrofagi iPSC dopo la fagocitosi. L'utilizzo di un colorante acido-sensibile migliora l'accuratezza del rilevamento di eventi fagocitici, con versatilità per diverse lettura di macrofagi vivi e fissi19. Questo protocollo delinea sia l'imaging time-lapse a cellule vive della fagocitosi, sia un test di imaging fisso ad alto contenuto per la fagocitosi, con le stesse fasi di preparazione cellulare prima della lettura (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Figura 1: Diagramma schematico della metodologia. Schema del test di fagocitosi, in cui la preparazione degli SH-SY5Y e la colorazione dei macrofagi iPSC vengono eseguite in parallelo, e quindi gli SH-SY5Y vengono pipettati sui macrofagi iPSC. L'imaging time-lapse delle cellule vive viene eseguito immediatamente o le cellule vengono incubate a 37 ° C / 5% CO2 per la durata richiesta e fissate prima di eseguire la microscopia ad alto contenuto. PFA: paraformaldeide, HBM: fenolo red-free HEPES-buffered media, pHr: pH-sensitive red fluorescent dye STP Ester solution, PRFMM: phenol red-free macrophage media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>For centrifugation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L, 20-200 &#181;L, 100-1000 &#181;L single-channel micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Component of Factory media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>For fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell-800 24-well plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34815</td>
			<td>Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14085</td>
			<td>Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 &#956;M, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 laminar air flow safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, set to 37&#176;C and 5 % CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image Data Storage and Analysis System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11330</td>
			<td>Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20&#176;C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320074</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for CellTracker and pHrodo dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>Live-cell time-lapse imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube CY5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4656</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4650</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube RFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 10-547F</td>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant BMP4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-3</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC0033</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant VEGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein binding 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108.132</td>
			<td>For staining SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC9501</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel 20-200 uL pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For liquid handling of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td>High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36011</td>
			<td>pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 &#956;L (12.5 &#956;g) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette filler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as &#34;Factories&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for SH-SY5Y culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealers</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676001</td>
			<td>For assay plate storage and transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, set to 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418F</td>
			<td>Component of Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-744Q</td>
			<td>Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages

Le microglia orchestrano le risposte neuroimmmune in diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer. Le microglia eliminano i neuroni morti e morenti attraverso il processo di efferocitosi, una forma specializzata di fagocitosi. La funzione di fagocitosi può essere interrotta da fattori di rischio ambientali o genetici che influenzano la microglia. Questo documento presenta un protocollo di microscopia in vitro rapido e semplice per lo studio dell'efferocitosi microgliale in un modello di microglia a cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), utilizzando una linea cellulare di neuroblastoma umano (SH-SY5Y) etichettata con un colorante sensibile al pH per il carico fagocitico. La procedura si traduce in un alto rendimento di cellule di neuroblastoma morto, che mostrano fosfatidilserina di superficie, riconosciuta come un segnale "mangia-me" dai fagociti. Il test della piastra a 96 pozzetti è adatto per l'imaging time-lapse di cellule vive, oppure la piastra può essere fissata con successo prima di un'ulteriore elaborazione e quantificata mediante microscopia ad alto contenuto. La microscopia ad alto contenuto a cellule fisse consente di scalare il saggio per lo screening di inibitori di piccole molecole o per valutare la funzione fagocitica delle linee iPSC delle varianti genetiche. Mentre questo test è stato sviluppato per studiare la fagocitosi di cellule di neuroblastoma morte intere da iPSC-macrofagi, il test può essere facilmente adattato per altri carichi rilevanti per malattie neurodegenerative, come sinaptosomi e mielina e altri tipi di cellule fagocitiche.

L'imaging time-lapse delle cellule vive è stato eseguito utilizzando il protocollo precedentemente delineato, con macrofagi iPSC di tipo selvatico seminati a 20.000 cellule per pozzedo. Sono state applicate diverse quantità di SH-SY5Y (10.000-30.000 per bene come stimato dal conteggio cellulare nel passaggio 3.1) e l'inibitore della fagocitosi citocalasina D è stato pre-incubato (1 ora) con alcuni pozzezze, agendo come controllo per inibire la fagocitosi per ogni quantità di SH-SY5Ys. L'imaging è iniziato 40 minuti dopo l'aggiunta di SH-SY5Y e le immagini sono state acquisite a intervalli di 5 minuti per le successive 3 ore (i dati includono il ritardo iniziale di 40 minuti). Un video time-lapse rappresentativo è incluso nei dati supplementarie i dati quantitativi analizzati mostrati nella Figura 3. Con la quantità di 10.000 SH-SY5Y per pozzo, il numero di particelle fagocitose (macchie) per cellula è aumentato linearmente con il tempo ed è stato inibito di circa il 50% dalla citocalasina D. L'inibizione da parte della citocalasina D è stata più debole del previsto, molto probabilmente causata da repliche tecniche o biologiche insufficienti, poiché è stato ripreso un solo pozzo per condizione con tre campi immagine. Con quantità più elevate di SH-SY5Y per pozzetto (20.000 e 30.000), la fagocitosi ha mostrato una scarsa linearità, probabilmente a causa della scarsa segmentazione di iPSC-macrofagi e SH-SY5Y in un campo visivo più affollato.
L'imaging ad alto contenuto a cellule fisse è stato eseguito utilizzando il protocollo precedentemente delineato, con macrofagi iPSC di tipo selvaggio a 20.000 cellule per pozzetti, diverse quantità di SH-SY5Y (10.000-80.000 per pozzetti) e la piastra di analisi è stata fissata e grafata dopo 5 ore. Un'immagine rappresentativa della fagocitosi è presentata in Figura 4Ae i dati analizzati mostrati in Figura 4B17. L'aumento della quantità di SH-SY5Y ha comportato un numero maggiore di particelle fagocitose (macchie) per cellula; tuttavia, un raddoppio della quantità di SH-SY5Y porta solo ad un aumento di 1,5 volte del numero di punti per cella. Ciò indica che le quantità testate non sono limitanti alla fagocitosi. Successivamente il saggio di fagocitosi di imaging ad alto contenuto è stato validato utilizzando diversi inibitori della fagocitosi (Figura 4C)17. Gli inibitori della polimerizzazione dell'actina citocalasina D e jasplakinolide hanno inibito significativamente la fagocitosi del 91% e del 90%, rispettivamente, quando pre-incubati per 1 ora prima della fagocitosi. Il robusto Z' del saggio quando la citocalasina D o il jasplakinolide sono usati come controlli negativi è calcolato come 0,7 e 0,8, rispettivamente20. L'inibitore dell'acidificazione del lisosoma bafilomicina A1 ha ridotto significativamente la fagocitosi del 31%, quando incubato 1 ora prima della fagocitosi. L'effetto più debole dell'inibitore dell'acidificazione del lisosoma rispetto agli inibitori dell'actina suggerisce che il rilevamento del carico internalizzato potrebbe non richiedere la completa acidificazione del fagosoma. L'annessina V ricombinante è stata utilizzata come controllo per bloccare specificamente la fosfatidilserina esposta sulla superficie di SH-SY5Ys, impedendo ai recettori fagocitici di accedere al ligando, un importante segnale "mangia-me". L'aggiunta di annessina V ricombinante ha ridotto significativamente la fagocitosi del 30%, se aggiunta ai pozzi immediatamente prima dell'aggiunta di SH-SY5Y. È stato confermato che gli SH-SY5Y fissi esponevano la fosfatidilserina, utilizzando una sonda fluorescente di annessina V, mentre gli SH-SY5Y vivi erano negativi per la colorazione dell'annessina V (Figura 4D).
Il recettore della fagocitosi microgliale TREM2 ha precedentemente dimostrato di essere importante per la fagocitosi dei neuroni apoptotici21. La mutazione R47H di TREM2 è un gene di rischio per l'insorgenza tardiva della malattia di Alzheimer e si ipotizza di ridurre il legame del ligando di TREM223. Con l'obiettivo di valutare la funzione fagocitica di R47H TREM2 e TREM2 KO, il test di fagocitosi ad alto contenuto a cellule fisse è stato eseguito utilizzando linee iPSC-macrofagi isogeniche con WT/R47H/KO TREM217. Sono state testate diverse lunghezze di durata della fagocitosi da 1 a 5 ore, utilizzando un'aggiunta scagliona di carico fagocitico (40.000 SH-SY5Y). Il segnale risultante aumenta linearmente a 4 h, livellandosi leggermente a 5 h (Figura 5)17. La riduzione del tasso e della capacità di fagocitosi (% di cellule spot positive) era evidente nel KO TREM2 rispetto al WT, mentre il mutante R47H TREM2 non mostrava fagocitosi alterata. Il difetto fagocitico nelle cellule TREM2 KO non è fenocopiato dalla mutazione R47H TREM2, apparentemente perché la funzione TREM2 è sufficiente a supportare la normale fagocitosi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Figura 3: Dati di esempio per il saggio di fagocitosi time-lapse a cellule vive. Assorbimento di SH-SY5Y morti da parte di macrofagi iPSC di tipo selvatico BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) ripreso a intervalli di 5 minuti per 3 ore. I tempi visualizzati sul grafico sono dall'inizio della fagocitosi, compresi i primi 40 minuti senza misurazione. Viene tracciato il numero medio di punti per cella da tre pozzi replicati. La fagocitosi di 10.000 SH-SY5Ys è inibita con 10 μM di citocalasina D con 1 ora di pre-trattamento, mentre quantità più elevate di SH-SY5Y (20.000 e 30.000) hanno una quantificazione subottimale della fagocitosi. Deviazione standard media ± (SD), N = 1 esperimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Figura 4: Ottimizzazione e validazione del saggio di fagocitosi ad alto contenuto a cellule fisse. (A) Immagine rappresentativa al microscopio ad alto contenuto di FAGOCITO SH-SY5YS da iPSC-macrofagi wild-type BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Viene mostrato un time-point di 3 ore con 40.000 SH-SY5Y. I canali di fluorescenza sono uniti, con la macchia iPSC-macrofagica mostrata come rossa, i nuclei come blu e SH-SY5Ys come giallo. Il pannello dell'inserto è una sezione dell'immagine ingrandita 3x. (B) Il numero di macchie per cellula di SH-SY5Ys morti fagocitosi dopo 5 ore, utilizzando diverse quantità di carico oltre ai macrofagi iPSC di tipo selvaggio. Media ± errore standard della media (SEM), per N = 3 raccolti. (C) La fagocitosi (3 h) è inibita con 10 μM di citocalasina D (Cyt), 1 μM di bafilomicina A1 (Baf), 1 μM di jasplakinolide (con 1 ora di pretrattamento; Jas) e 13 μg/mL di annessina V ricombinante (aggiunta simultaneamente agli SH-SY5Y morti; Anna). i macrofagi iPSC senza SH-SY5Y aggiunti sono stati usati come controllo negativo (-ve), e il controllo positivo (+ve) è ipsc-macrofagi non trattati con SH-SY5Ys aggiunti. I dati sono stati normalizzati alla media per la ripetizione dell'esperimento. Mezzi ± SEM, per N = 3-6 raccolti e con due linee cellulari wild-type (SFC840-03-03, la caratterizzazione di questa linea è descritta in (Fernandes et al.21 e BIONi010-C). ANOVA a 1 via con test post-hoc di Dunnett, confronti con cellule non trattate. *p < 0,05, ***p < 0,001. (D) Gli SH-SY5Y appena fissati si colorano uniformemente per la visualizzazione della fosfatidilserina (annessina V-FITC) e hanno una permeabilità cellulare limitata (ioduro di propidio). Gli SH-SY5Y vivi non si macchiano per l'annessina V-FITC o lo ioduro di propidio, ad eccezione della colorazione focale presente sulle poche cellule morte in coltura. Le figure sono riprodotte con il permesso di Alzheimer's Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Figura 5: La fagocitosi è ridotta in TREM2 KO ma non in R47H TREM2 iPSC-macrofagi. Saggio di fagocitosi ad alto contenuto eseguito con 40.000 SH-SY5Y per pozzo con aggiunte sfalsate. I mezzi sono stati quantificati per i parametri: numero di punti per cellula, somma di aree spot (μm2) per cellula e percentuale di cellule contenenti particelle fagocitose per campo. I dati sono stati normalizzati in modo da significare per ogni genotipo per esperimento. Media ± SEM, per N = 3 raccolti. ANOVA a 2 vie a misure ripetute, il test post-hoc di Dunnett, confronti a coppie con il WT per ogni volta: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Le figure sono riprodotte con il permesso di Alzheimer's Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare S1: Esempio qc per la preparazione sh-SY5Ys. Gli SH-SY5Y dissociati sono stati fissati per 10 minuti con lo 0% (cellule vive), l'1% e il 2% di paraformaldeide (PFA), quindi lavati. Le cellule sono state colorate con annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI) e immediatamente misurate mediante citometria a flusso. I dot plot di densità di colore sono stati creati nel software di analisi della citometria a flusso, utilizzando i controlli a macchia singola e non macchiata per posizionare un cancello a quadrante. I quadranti sono annotati con la percentuale di eventi all'interno di quel quadrante. Le cellule vive sono principalmente in Q4 e le cellule fisse sono principalmente in Q2. Q1 = annessina V-/PI-, Q2 = annessina V+/PI+, Q3 = annessina V+/PI-, Q4 = annessina V-/PI- (cellule vive). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Video supplementare: Fagocitosi time-lapse live-cell. Video time-lapse rappresentativo di FAGOCI DI SH-SY5Ys da iPSC-macrofagi di tipo selvaggio BIONi010-C (ID ECACC: 66540023). Le immagini sono state scattate ogni 5 minuti per 3 ore. Il video viene ritagliato e viene eseguito a 3 fotogrammi al secondo, mostrando le ultime 1,5 ore del test. Gli SH-SY5Ys colorati con coloranti sensibili agli acidi sono mostrati in rosso, l'intensità del segnale aumenta con l'acidificazione dei fagosomi. I nuclei cellulari colorati con Hoechst 33342 sono mostrati in blu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>

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In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Le malattie neurodegenerative sono associate a funzioni microglia disregolate. Questo articolo delinea un test in vitro della fagocitosi delle cellule di neuroblastoma da parte dei macrofagi iPSC. Le lettura quantitative al microscopio sono descritte sia per l'imaging time-lapse a cellule vive che per l'imaging ad alto contenuto a cellule fisse.

Test di imaging quantitativo in vitro per la fagocitosi delle cellule morte del neuroblastoma da parte di iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Questo test di imaging in vitro consente di quantificare l'effetto di diversi trattamenti cellulari o diversi genotipi sulla fagocitosi microgliale. Utilizzando due tipi di cellule che sono rilevanti per le malattie neurodegenerative, utilizziamo cellule morte di neuroblastoma per il carico fagocitico, che sono preparate in un modo che può essere facilmente ed economicamente scalato da grandi schermi di imaging ad alto contenuto. In un armadio di sicurezza biologica di classe 2, dissociare SH-SY5Y aspirando il mezzo.Aggiungere 4 ml di tampone di dissociazione cellulare e rimuovere immediatamente il tampone in modo che rimanga meno di 1 ml come un film sottile che ricopre le cellule. Incubare per 2 o 3 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi a 10 ml di HBSS al pallone T-75.E pipettare gli SH-SY5Ys in un tubo conico centrifugo da 15 ml. Centrifugare a 400xG per 5 minuti. Aspirare il surnatante e sospendere di sospendere le cellule in 2 ml di mezzo tamponato HEPES privo di fenolo rosso, assicurandosi di rompere i grumi prima della fissazione.Fissare le cellule aggiungendo 2 ml di formaldeide al 4% di potenza al tubo e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente con occasionale agitazione delicata. Aggiungere 10 ml di HBSS al tubo. Quindi, centrifugare a 1200xG per 7 minuti.Aspirare il surnatante e sospendere di frequente il pellet cellulare in 2 ml di mezzo tamponato HEPES privo di fenolo rosso. Contare e rimuovere 1 milione di cellule HS-SY5Y in un tubo a basso legame proteico da 2 ml. Portare il volume totale a 300-500 microlitri con supporti tamponati HEPES privi di fenolo rosso.Quindi riscaldare brevemente il tubo a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Ricostituire l'estere STP del colorante fluorescente rosso sensibile al pH secondo le istruzioni del produttore. Quindi aggiungere 12,5 microgrammi di colorante per milione di cellule SH-SY5Y.Mescolare delicatamente facendo scorrere il tubo. E incubare il tubo a temperatura ambiente per 30 minuti, al riparo dalla luce. Aggiungere 1 ml di HBSS e centrifugare a 1200xG per 7 minuti e 4 gradi Celsius.Scartare il surnatante. E lavare con 2 ml di HBSS. Sospendere di nuovo il pellet cellulare in mezzi macrofagi privi di fenolo rosso ad una concentrazione da 0,2 a 1,2 milioni di cellule per ml, in modo che 50 microlitri contengano da 10.000 a 60.000 cellule.In un armadio di sicurezza biologica, preparare una soluzione di colorante reattivo reattivo all'estere succinimidyl permeante a cellule fluorescenti rosso intenso nei mezzi macrofagi. Aggiungere Hoechst 33342 e riscaldare la soluzione di lavoro a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Aspirare delicatamente il mezzo macrofagico iPSC, pipettando il surnatante cellulare con una pipetta multicanale in un serbatoio sterile.Aggiungere 70 microlitri per pozzetta della soluzione colorante ai macrofagi iPSC utilizzando una pipetta multicanale. Incubare per 1 ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Riparare trattamenti sperimentali in mezzi macrofagici privi di fenolo rosso.Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo macrofagico iPSC molto delicatamente con una pipetta multicanale e aggiungere 100 microlitri di HBSS per pozzetti. Rimuovere immediatamente HBSS mediante un leggero pipettaggio. Quindi aggiungere 100 microlitri di mezzi macrofagi privi di fenolo rosso, oltre a trattamenti sperimentali in pozzeggi separati.Incubare per 10 minuti a 1 ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri dell'SH-SY5Ys etichettato per pozzetti dai lati di ciascun pozzettino sul bordo del liquido. Quindi incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 3-5 ore.Dopo l'incubazione della fagocitosi, aspirare delicatamente i supernatanti cellulari pipettando con una pipetta multicanale e scartare. Lavare una volta con 100 microlitri di PBS. Quindi fissare le cellule aggiungendo 100 microlitri di formaldeide di potenza al 2% e incubando per 15 minuti a temperatura ambiente.Aspirare i pozzi e aggiungere 100 microlitri di PBS. Procedere direttamente all'imaging con il microscopio ad alto contenuto, o coprire con sigillante a piastre e lamina, e conservare la piastra a 4 gradi Celsius, fino a quando necessario. Accendere il microscopio di imaging ad alto contenuto e aprire il software di acquisizione delle immagini.Caricare la piastra di analisi nel microscopio facendo clic sull'icona LOAD nella parte superiore dello schermo. Selezionare la scheda SETUP". Nei menu a discesa nella casella in alto a sinistra, selezionare il tipo di piastra appropriato.L'opzione di messa a fuoco automatica: due picchi "L'obiettivo: 40x Acqua, NA 1.1 "Confocal" modalità e Binning di 1. Lavare l'obiettivo Acqua 40x prima dell'uso tramite il menu delle impostazioni. Nella casella di selezione dei canali, utilizza l'icona più per aggiungere i canali DAPI, Alexa 647 e Alexa 568.Impostare questi per misurare su un singolo piano di un micrometro. Ottimizzare le impostazioni di tempo e potenza per l'efficienza di colorazione della piastra di dosaggio. Assicurarsi che i canali non vengano misurati contemporaneamente, facendo clic sulla sequenza di canali per separare i canali.Sotto la navigazione e definisci il layout, seleziona i pozzi di misurazione e seleziona da 9 a 12 campi per pozzo. Durante l'installazione, fare clic su un campo rappresentativo sulla mappa della piastra. E controlla ogni canale di misurazione a turno per assicurarti che la colorazione sia presente e che le immagini siano focalizzate regolando l'offset del canale.Per caricare i dati su un server per l'analisi remota, fare clic sulla casella "lavori online" e sul relativo nome utente. Salva il protocollo di analisi facendo clic sul pulsante Salva e fai clic sulla scheda Esegui esperimento" in alto. Un test di fagocitosi della vita delle cellule vive ha mostrato che con 10.000 SH-SY5Ys per pozzetto, il numero di particelle di fagocitosi per cellula è aumentato linearmente con il tempo ed è stato inibito di circa il 50% dalla citocalasina D.Con quantità più elevate di SH-SY5Ys per pozzetto, la fagocitosi ha mostrato scarsa linearità, probabilmente a causa della scarsa segmentazione di iPSC, macrofagi e SH-SY5Y in un campo visivo più affollato.I seguenti risultati sono stati ottenuti eseguendo un imaging ad alto contenuto a cellule fisse, inclusa questa immagine rappresentativa della fagocitosi. L'aumento della quantità di SH-SY5Ys ha comportato un numero maggiore di particelle fagocitose per cellula. Il test della fagocitosi è stato convalidato utilizzando diversi inibitori della fagocitosi.La citocalasina D e Jasplakinolide hanno inibito significativamente la fagocitosi rispettivamente del 91 e del 90%. E la bafilomicina A1 ha ridotto significativamente la fagocitosi del 31% quando pre-incubata per 1 ora prima della fagocitosi. L'aggiunta di Annexin 5 ricombinante ha ridotto significativamente la fagocitosi del 30% se aggiunta ai pozzi immediatamente prima dell'aggiunta di SH-SY5Y.Risolto SH-SY5Ys siamo confermati per esporre fosfatidilserina utilizzando una sonda fluorescente Annexin 5. Mentre gli SH-SY5Y vivi erano negativi per la colorazione annexin 5. Diverse lunghezze della durata della fagocitosi, da 1 a 5 ore, sono state testate utilizzando l'aggiunta scagliona di carico fagocitico.La lunghezza complessiva di questo protocall può essere ridotta preparando il carico fagocitico e macchiando i macrofagi iPSC in parallelo. Se vuoi farlo, elabora i tempi in anticipo e usa le tue incubazioni per preparare soluzioni per i passaggi futuri.

Research

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