Name: in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

著者らは、ヴァル・ミラー博士とソハイブ・ニザミ博士が高内容顕微鏡の支援をしてくれたことに感謝し、ダニエル・エブナー博士が高コンテンツ顕微鏡にアクセスしてくれたことに感謝している。さらに、著者らは、エマ・ミード博士のアッセイ開発アドバイス、キャシー・ブラウン夫人にiPSCサポートに感謝しています。この研究は、オックスフォード・マーティン・スクールLC0910-004のジェームズ・マーティン幹細胞施設オックスフォード(S.A..C.)への追加支援を受けて、アルツハイマー研究英国オックスフォード創薬研究所(ARUK ODDI、助成金参照ARUK-2020DDI-OX)によって支援されました。パーキンソン病英国からのモニュメントトラストディスカバリー賞(J-1403);MRC認知症プラットフォーム英国幹細胞ネットワーク資本設備MC_EX_MR/N50192X/1、パートナーシップMR/N013255/1、モメンタムMC_PC_16034賞。

<ol>
	<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li><li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+in+the+brain:+Homeostasis+and+disease.">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).</li><li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer's+disease:+potential+therapeutic+targets.">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li><li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+live+neurons.">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li><li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia.">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding.">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).</li><li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila.">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li><li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2.">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).</li><li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets.">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li><li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages.">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li><li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Alzheimer's+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout,+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages.">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12, 151 (2020).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer's+disease+not+evident+in+mouse+models.">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li><li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+robust+Z'+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons.">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).</li><li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+&#945;-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson's+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons.">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular &#945;-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li><li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2.">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li><li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease.">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Witting, A., M&#252;ller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia/brain+macrophages+in+vitro:+Involvement+of+lectin-,+integrin-,+and+phosphatidylserine-mediated+recognition.">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li><li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia.">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li><li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease.">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).</li><li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome.">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li><li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells.">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li><li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis.">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

ミクログリアは、アポトーシスニューロンの貪食症を含む神経変性疾患の開始および進行に影響を与える重要な機能を有する。シナプスの微小性貪食症および不適切な貪食症はいずれも神経変性疾患と関連しているが、基礎となるメカニズムおよび因果関係は4,23に十分に理解されていない。本論文では、iPSCマクロファージによるアポトーシス細胞の食細胞を測定する食細胞細胞の測定法を概説し、生細胞タイムラプスイメージング読み出しまたは固定細胞高含有顕微鏡、または単一アッセイ上での組み合わせのいずれかを用いた。この多様性は、アッセイがいくつかのウェルで時間の経過とともに個々の貪食事象を研究するために使用することができるか、または複数の条件または処置の高内容スクリーニングに使用することができることを意味する。高含有アッセイは単一のタイムポイントで固定されるため、複数のアッセイプレートを同時に調製することができました。高含有アッセイは、マクロファージ/ミクログリアを疾患関連遺伝子変異体と特徴付けたり、食作用の変化に対する小分子阻害剤をスクリーニングしたりするための潜在的な有用性を有する。アッセイはまた、他のミクログリアモデル、または潜在的にアストロサイトの貪食症を研究するために容易に適応することができる。この貪食アッセイは、例えば、ミトコンドリア、カルシウム、またはROS指標などの生細胞イメージング染色で多重化され、また、関心のあるタンパク質に対する免疫蛍光染色を後固定することができます。アポトーシス神経細胞を利用する既存の貪食アッセイと比較して、このプロトコルが与える主な利点は、貪食性貨物の調製が比較的簡単かつ迅速であり、均一な製品をもたらすということです。他のアッセイは、2時間25のS-ニトロソ-L-システインを用いたニューロンまたはSH-SY5Ysのアポトーシスを誘導し、3h22のオカダ酸、4-16 h 26、27、28、29または24時間30のUV照射の細胞に生じ得る。さらに、著者が知る限り、ライブセルイメージングおよび高コンテンツイメージング読み出しは、これまで説明されていなかった。パラホルムアルデヒド固定を使用して貪食性貨物を準備する主な制限は、細胞がアポトーシスのプロセスを完全に再現しないことです。固定が食細胞を引き付ける標的細胞からのヌクレオチド「私を見つける」シグナル(例えば、ATP、UDP)の分泌にどのような影響を及ぼすかは分かっていない。アポトーシス細胞と同様に、固定SH-SY5Ysはヨウ化プロピジウムに対して膜透過性を示す。膜透過性は「私を見つける」信号の放出に関連付けられます。しかし、これは固定SH-SY5Ysでは研究されておらず、ヌクレオチドがあまりにも速く放出されると、SH-SY5YsがiPSCマクロファージに添加される前に洗い流されるであろう。
プロトコルの最初の重要なステップは、pH感受性赤色蛍光色素のSTPエステルを用いた死んだSH-SY5Ysの染色です。この染料は、死んだSH-SY5Ysの表面上の遊離一次アミンと迅速かつ共有的に反応する。染色の期間を最適化する必要はありません。ただし、ラベルを付ける前に染料の取り扱いに注意する必要があります。遊離アミンを含むバッファーでは、標識反応を行ってはなりません。さらに、DMSOストックが冷水バッファーまたは高い最終濃度で希釈された場合、沈殿のリスクがあります。沈殿物は、顕微鏡下で密な暗い物体として表示されます。さらに、pHに敏感な色素の溶液は規則的なプラスチック遠心管に付着し、ゆっくりと流し落とす;したがって、ラベル付け工程には低結合のチューブが推奨されます。永久蛍光色素の代わりにpH感受性染料を使用すると、細胞膜に隣接する粒子に対して、巻き込まれた粒子の同定に役立ちます。中性pHでは蛍光がいくらかあるため、貪食性貨物とiPSCマクロファージの密度は、正確なセグメンテーションのために十分低く保つ必要がありますが、多くの貪食事象が捉えられるほど高い。高含有顕微鏡検査では、ウェル内の中密度の貨物(iPSCマクロファージあたり2 SH-SY5Ys以上)で貪食を正確に同定することができた。逆に、深紅のスペクトルにおける顕微鏡の感度が弱いため、生細胞のタイムラプス画像データにおけるiPSCマクロファージのセグメンテーションは信頼性が低く、偽陽性の可能性を減らすために非常に低密度の貨物を使用する必要がありました(2つのiPSCマクロファージごとに1 SH-SY5Y)。適切なセグメンテーションと貨物密度の検証は、未処理のウェルとサイトカラシンD処理されたウェルとの比較で行う必要があります。十分に最適化されたアッセイでは、サイトカラシンDは未処理サンプルに対して細胞当たりの平均スポット数を90%削減する必要があります。
プロトコルのもう一つの重要なステップは、iPSCマクロファージ染色であり、細胞を識別し、画像解析でセグメント化して、外部SH-SY5Yがカウントから除外されるようにします。推奨染料は細胞透過性であり、細胞質内の不溶性蛍光産物に変換され、固定性、無毒である( 材料表を参照)。染色工程は、高含有イメージング食細胞化アッセイによるiPSCマクロファージの使用に最適化されており、他の細胞タイプを用いる場合は再最適化を推奨する。細胞染色の持続時間を増加させ、細胞内の不溶性蛍光生成物の沈着を改善することができる。色素濃度が最適化されている場合は、有機溶剤車両の有毒なレベルを避けるために注意する必要があります。
アッセイの成功に対する第3の重要な要素は、データ分析である。提供される分析パイプラインは、染色強度や細胞形態の違いが書かれたパイプラインのセグメンテーションの有効性を低下させる可能性があるため、規範的ではなくガイダンスを意図しています。そのため、適切な正と負のコントロールでパイプラインをテストして、いくつかの最適化が必要になり、最適化する必要のあるパラメーターがプロトコル テキストに示されます。陰性コントロールには、sh-SY5Ysを添加する前に、iPSCマクロファージがシトカラシンDなどの強力な食作用抑制剤で前処理される状態が含まれるべきです。もう一つの可能な負の制御は、アッセイの最後にiPSCマクロファージの以前に未処理の井戸にSH-SY5Ysを追加することです, これは、貨物のいくつかのセトリングを可能にしますが、ファゴサイトーシスのかなりの量が発生するには短すぎます.食細胞性イベントは、深い赤い蛍光チャネルを用いたソフトウェアアルゴリズムによって定義されるiPSCマクロファージの境界内の赤色蛍光物体として定義される。細胞のセグメンテーションが悪い場合(図2)、iPSCマクロファージに近接した多くの非貪食SH-SY5Ysが誤って分析に含まれる可能性がある、すなわち偽陽性。良好なセグメンテーションを達成する上で最も重要な要素は、iPSCマクロファージの厳格な線引です。両方の解析のセグメンテーションは自動化されているため、すべてのセルに対して完全なセグメンテーションを得ることは不可能です。ただし、いくつかのテストイメージを参照として使用して、セグメンテーションをより最適にするためにいくつかのパラメータを調整することができます。この状態で検出された貪食性イベントの数が多い場合、セグメンテーションが最適ではないことが示されるため、サイトカラシンD制御は最適なセグメンテーションを評価するために重要です。細胞1個あたりの貪食事象の数がシトカラシンD条件で80%〜90%低くなるまで、データ分析パイプラインの最適化を繰り返す必要があります。
起こりがちな貪食アッセイの問題は、(1)陽性制御における弱いpH感受性蛍光、(2)アッセイ終了時のマクロファージのまばらまたは不均一な分布、または(3)非貪食SH-SY5Ysからの分析における偽陽性の数が多い。弱いpH感受性蛍光のトラブルシューティングは、まずSH-SY5Ysの染色が強いマゼンタ色の細胞ペレットをもたらしたことを確認する必要があります。色が弱い場合は、新鮮な染料ストックが使用されていることを確認し、標識バッファーがアミンフリーであることを確認し、染色前にSH-SY5Ysに余分な洗浄を加え、SH-SY5Ysの正しい数が染色されたかどうかを確認し、染料の標識濃度を最適化します。SH-SY5Ysが強く染色されている場合は、アッセイプレートに加えた濃度が正しいかどうかを確認し、iPSCマクロファージが健康で古すぎないことを確認します。第2のタイプの問題、不均一なマクロファージ分布は、ピペッティング中の細胞の喪失から生じる可能性があり、狭孔先端を避けて細胞が経験するピペット力を減らすためのステップを取る必要があります。問題が残る場合は、細胞透過色素でiPSCマクロファージをロードするインキュベーション時間を短縮します。第3の問題は、分析における非貪食性粒子の誤った包含に関して、分析パイプラインのより多くの最適化が必要であることを示している。トラブルシューティングでは、まず、セルのセグメンテーションと、ソフトウェアに隣接するオブジェクトが含まれているかどうかに焦点を当てる必要があります。調整できる特定のパラメータは、関連ステップの下の注記で提案されています(ライブセルタイムラプス分析のステップ6.1.11-6.1.15、ハイコンテンツ分析の場合はステップ6.2.4-6.2.8)。細胞のセグメンテーションをさらに改善できない場合、高含有分析には、不適切にセグメント化されたiPSCマクロファージを除外する追加のステップ(ステップ6.2.8)があります。さらに、iPSCマクロファージ内のpH感受性蛍光の許容スポットをフィルタリングするモジュールを最適化し、受け入れられたオブジェクトの閾値強度を高め、非貪食性SH-SY5Ysを除外するのに役立つはずです(ライブ細胞タイムラプス分析のステップ6.1.17、および高コンテンツ分析のためのステップ6.2.11)。
我々は、それぞれが利点と限界を有する貪食アッセイのための2種類の顕微鏡読み出しを開発した。ライブ細胞のタイムラプスイメージングは、貪食動態に関する追加情報を提供するメリットがあり、高コンテンツイメージングプラットフォームよりも広く利用可能です。推奨されるオープンソースソフトウェアは、顕微鏡の供給源に依存せず、生細胞のタイムラプス機能の有無にかかわらず、良質の蛍光顕微鏡で使用することができます。ライブセルイメージングの主な制限は、感度と光学系が限られているため、iPSCマクロファージの良好なセグメンテーションを検出して実行することがより困難になります。この制限は、iPSC マクロファージ染色の持続時間を長くするか、より敏感な顕微鏡に切り替えることによって軽減することができます。高含有イメージングファゴサイトーシスアッセイは、高含有イメージングシステムが利用可能な場合に推奨される読み出しです。高コンテンツイメージングシステムは、より高いスループットとより信頼性の高いデータを可能にし、このアッセイをスクリーニングに使用することを可能にし、このアッセイは、≥0.7の堅牢なZ'出力20に対して期待されるであろう。ライブセルのタイムラプス法と比較して、高コンテンツ顕微鏡読み出しは、より高い感度、より高い自動化と速度、より多くのウェルおよびイメージングフィールドを処理することができ、高解像度の共焦点画像が生成されます。細胞セグメンテーションは良好な画像でより効果的であり、セグメンテーションは、高い不規則な形状の細胞に適したより多くの細胞セグメンテーション方法を提供する高コンテンツイメージング解析ソフトウェアによってさらに助けられます。高含有イメージング解析ソフトウェアは、食細胞の割合などのオープンソースソフトウェアと比較して、貪食のパラメータも多く計算した。高含有食細胞性アッセイの主な制限は、イメージングシステムと解析ソフトウェアのコストとアクセシビリティの1つです。
結論として、本論文で提示された定量食細胞化アッセイは、インビトロで死んだニューロンのミクログリア貪食症をモデル化するための有用なツールである。ミクログリアはiPSCマクロファージによってモデル化され、死んだニューロンはパラホルムアルデヒド固定SH-SY5Ysによってモデル化される。公開されている最も本格的なミクログリアと死んだ/アポトーシスニューロンモデルではありませんが、これらは簡単に準備でき、スケーラブルです。アッセイ自体は非常に汎用性が高く、2種類のイメージング読み出しが詳細で、異なるミクログリア/マクロファージ単培養モデル、または食細胞性貨物として機能する異なる細胞タイプでの使用に適応する可能性があります。高含有イメージング読み出しは、定量的データを得るのに有利であり、iPSCマクロファージにおける貪食症の小分子モジュレーター、またはスクリーニング遺伝的変異体をアッセイするためにスケールアップすることができる。しかし、高含有イメージングシステムは高価でデータが多いため、必要に応じて高品質の従来の蛍光顕微鏡に置き換えることができるライブセルタイムラプス顕微鏡を使用して、代替イメージング読み出しがプロトコルに含まれています。

ミクログリアは脳組織に居住するマクロファージであり、その機能には免疫監視、傷害/感染に対する炎症反応の調整、シナプスリモデリング、死んだ細胞、ミエリン、タンパク質凝集体、病原体の貪食作用が含まれる。食道は、ミクログリアが表面受容体を持つ貨物を認識し、細胞骨格を再編成して物体をファゴソームに巻き込み、リソソームと融合して貨物を分解するプロセスです。健康なミクログリア貪食アポトーシスアポトーシス脳細胞は、壊死性1になる前にそれらを除去する。アポトーシス細胞の貪食症は、また、エフェロサイトーシスとして知られており、そして、死にかけている細胞2によるホスファチジルセリン「eat-me」シグナルの表示を必要とする。多数のミクログリア受容体は、直接ホスファチジルセリンに結合します, TIM-4を含みます, BAI1, スタビリン-2, およびTREM2.ミクログリアTAM受容体(例えば、MERTK)およびインテグリンは、間接的にホスファチジルセリンに結合し、それぞれ、補助タンパク質GAS6またはMFG-E8を用いた。他の「eat-me」シグナルは、死にかけている細胞の認識に必要であり、これらはグリコシル化または表面タンパク質の電荷の変化を含む。細胞内タンパク質ICAM3、カレチコン、アネキシン-Iの細胞表面での発現;酸化されたLDL;または、ミクログリア生成補体C1q1,2によるアポトーシス細胞のコーティング。
パーキンソン病、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患は、死細胞、ミエリン断片、タンパク質凝集体などの脳内細菌の蓄積を含むミクログリア機能の障害と関連しており、これらの刺激に対する炎症性反応を誇張した3。食道症は、老化、炎症、または特異的な遺伝的リスク変異体4、5の組み合わせのために、神経変性疾患において障害され、病理に寄与する可能性がある。一方、ミクログリアが不適切に貪食可能なニューロンまたはシナプス6、7、8を食い込む可能性があるという神経変性疾患の動物モデルからの証拠もある。この機構は、微小性貪食受容体TREM2またはGPR56によって直接感知される損傷した神経突起のホスファチジルセリンディスプレイによって扇動される可能性が高く、または可溶性C1qコーティングを補体C1qで間接的に感知し、CR3媒性アゴサイスを導く。
食作用機能のインビトロアッセイは、例えば、ミクログリアにおける遺伝的リスク変異体の表現型の影響を評価するために、ラテックスビーズ4などの非生理学的なカルゴを用いて頻繁に行われる。蛍光標識細菌やザイモサンも使用され、生理学的であるが神経変性疾患には関係ない。非生理的食細胞性の貨物は、貪食性の巻き込みの基本的な機械の欠陥を検出するために使用することができますが、正確にアポトーシスニューロンの貪食における最初の「認識」ステップをモデル化することができません。大きさ、形状、剛性、および貨物の種類はまた、活性化される細胞内シグナル伝達経路を決定し、ミクログリア活性化状態の異なる結果をもたらす。例えば、大腸菌は、ヒト細胞とは異なり、小さく硬直しており、その表面のリポ多糖類は、食細胞細胞および炎症促進シグナル経路を活性化するToll様受容体4(TLR4)によって認識される2,12である。
神経変性疾患研究の文脈では、より関連性の高い貪食性貨物は哺乳類の形質素膜にホスファチジルセリンディスプレイを有し、理想的にはヒトおよび神経細胞であり、ミクログリアが遭遇する可能性が高い信号を含むであろう。この貪食プロトコルについては、ヒト神経芽細胞株SH-SY5Yを培養しやすいニューロンモデルとして選んだ。永久表面ホスファチジルセリンディスプレイはパラホルムアルデヒドによって人工的に誘導され、これは以前に血小板13のホスファチジルセリンディスプレイを引き起こすことが示されている。ミクログリア細胞モデルについては、ヒトiPSCマクロファージが用いられ、ヒトミクログリアの上生及び転写プロファイルを模倣し、貪食的に有能である14、15、16、17である。iPSCマクロファージは、最も本格的なミクログリアモデルではなく、例えば、ミクログリア形態を模倣していません。しかし、必要に応じて、より本格的な単一培養iPSCモデルのミクログリア(15.15など)に置き換えることができます。ヒトiPSCモデルは、神経変性を研究するための一次げっ歯類ミクログリアよりも好ましいが、ヒト対マウス神経変性疾患組織18において観察されるミクログリア転写モジュールの限られた重複に対する懸念に起因する。死んだSH-SY5Ysは、中性pHで弱く、貪食後のiPSCマクロファージの貪食ソームの中でより強く蛍光を発する酸感受性色素で染色される。酸感受性色素を使用すると、貪食事象を検出する精度が向上し、生きたマクロファージと固定マクロファージの異なる読み出しに対する汎用性が向上します。このプロトコルは、貪食の生細胞タイムラプスイメージングと、読み出し前の同じ細胞調製ステップを有する貪食に対する固定高含有イメージングアッセイの両方を概説する(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> 図1: 方法論の概略図SH-SY5Ysの調製とiPSCマクロファージの染色が並行して行われ、SH-SY5YsがiPSCマクロファージにピペット化される貪食アッセイの概要。ライブ細胞のタイムラプスイメージングをすぐに行うか、または細胞を必要な期間、37°C/5%CO2でインキュベートし、高内容顕微鏡を行う前に固定します。PFA:パラホルムアルデヒド、HBM:フェノール赤自由HEPES緩衝培地、pHr:pH感受性赤色蛍光色素STPエステル溶液、PRFMM:フェノール赤色遊離マクロファージ培地。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>For centrifugation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L, 20-200 &#181;L, 100-1000 &#181;L single-channel micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Component of Factory media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>For fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell-800 24-well plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34815</td>
			<td>Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14085</td>
			<td>Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 &#956;M, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 laminar air flow safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, set to 37&#176;C and 5 % CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image Data Storage and Analysis System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11330</td>
			<td>Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20&#176;C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320074</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for CellTracker and pHrodo dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>Live-cell time-lapse imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube CY5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4656</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4650</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube RFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 10-547F</td>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant BMP4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-3</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC0033</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant VEGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein binding 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108.132</td>
			<td>For staining SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC9501</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel 20-200 uL pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For liquid handling of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td>High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36011</td>
			<td>pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 &#956;L (12.5 &#956;g) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette filler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as &#34;Factories&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for SH-SY5Y culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealers</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676001</td>
			<td>For assay plate storage and transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, set to 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418F</td>
			<td>Component of Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-744Q</td>
			<td>Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages

ミクログリアは、パーキンソン病やアルツハイマー病を含むいくつかの神経変性疾患における神経免疫応答を調整します。ミクログリアは、食細胞性の特殊な形態である食細胞性のプロセスを通じて、死んで死んでいるニューロンをクリアします。貪食機能は、ミクログリアに影響を与える環境または遺伝的危険因子によって破壊される可能性があります。本論文は、過食性貨物に対してpH感受性色素を標識したヒト神経芽細胞細胞株(SH-SY5Y)を用いて、ミクログリアの人工多能性幹細胞(iPSC)モデルにおける微小性分胸細胞症を研究するための迅速かつ簡単なインビトロ顕微鏡プロトコルを提示する。この手順は、食細胞によって「eat-me」シグナルとして認識される表面ホスファチジルセリンを表示する死んだ神経芽細胞細胞の高い収率をもたらす。96ウェルプレートアッセイは、ライブセルタイムラプスイメージングに適しているか、またはプレートをさらなる処理の前に正常に固定し、高含有顕微鏡で定量することができます。固定細胞高含有顕微鏡検査により、アッセイをスケールアップして、小分子阻害剤のスクリーニングや、遺伝的変異型iPSCラインの貪食機能を評価することができます。このアッセイは、iPSCマクロファージによる全死神経芽細胞細胞の貪食を研究するために開発されたが、シナプトソームやミエリン、その他の貪食細胞タイプなどの神経変性疾患に関連する他のカルゴに容易に適応させることができる。

ライブセルタイムラプスイメージングは、以前に概説されたプロトコルを使用して行われ、野生型iPSCマクロファージはウェルあたり20,000細胞に播種されました。異なる量のSH-SY5Yが適用され(10,000-30,000分およびステップ3.1の細胞数から推定される)、および食作用抑制剤サイトカラシンDがいくつかのウェルで前培養(1h)され、SH-SY5Ysの各量に対する食細胞化を抑制する制御として作用した。画像撮影はSH-SY5Ysの添加後40分に開始し、画像は次の3時間の5分間隔で撮影された(データは最初の40分遅延を含む)。補足 データには代表的なタイムラプス ビデオが含まれており、 図 3に示す定量的データを分析します。ウェル当たり10,000個のSH-SY5Ysの量で、細胞当たりの食細胞粒子(スポット)の数は時間とともに直線的に増加し、サイトカラシンDによって約50%阻害された。サイトカラシンDによる阻害は予想よりも弱く、3つの画像フィールドで1つの条件が画像化されたため、技術的または生物学的複製が不十分であった可能性が最も高かった。1ウェル当たりのSH-SY5Ysの量が多く(20,000と30,000)、貪食症は、より混雑した視野でiPSCマクロファージとSH-SY5Ysのセグメント化が悪いため、直線性が悪かった。
固定細胞高含有イメージングは、以前に概説されたプロトコルを使用して行われ、野生型iPSCマクロファージはウェルあたり20,000細胞、数種類のSH-SY5Ys(1ウェルあたり10,000-80,000)、アッセイプレートを固定し、5時間後にイメージングしました。食道細胞症の代表的な画像を図4Aに示し、分析データを図4B17に示す。SH-SY5Ysの量を増やすと、細胞当たりの貪食性粒子(斑点)の数が多くなりました。しかし、SH-SY5Y量の倍増は、セルあたりのスポット数が1.5倍に増加するだけです。これは、テストされた量が食細胞化に対するレート制限ではないことを示しています。続いて高含有イメージング食作用アッセイは、いくつかの貪食抑制剤を用いて検証した(図4C)17.このアクチン重合阻害剤であるサイトカラシンDおよびジャスプラキノリドは、貪食前に1時間前に予時インキュベートした場合、それぞれ91%および90%の顕著に食作用を阻害した。細胞カラシンDまたはジャスプラキノリドが陰性制御として使用される場合のアッセイの堅牢なZ'は、それぞれ0.7および0.8として計算され、それぞれ20。リソソーム酸性化阻害剤であるバフィロマイシンA1は、貪食の前に1時間培養した場合に、食作用を31%有意に減少させた。リソソーム酸性化阻害剤とアクチン阻害剤の弱い効果は、内在化された貨物の検出がファゴソームの完全な酸性化を必要としないかもしれないことを示唆している。組換えアネキシンVは、SH-SY5Ysの表面に露出したホスファチジルセリンを特異的に遮断するコントロールとして使用され、食細胞受容体がリガンドにアクセスするのを防ぎ、重要な「eat-me」シグナルである。組換えアネキシンVの添加は、SH-SY5Y添加の直前にウェルに添加した場合、30%減少した。固定SH-SY5Ysはホスファチジルセリンを露出することが確認され、蛍光アネキシンVプローブを使用し、一方、生のSH-SY5YsはアネキシンV染色に対して陰性であった(図4D)。
この微小貪食受容体TREM2は、アポトーシスニューロン21の貪食に重要であることが以前に示されている。TREM2のR47H変異は、アルツハイマー病の遅発発症のリスク遺伝子であり、TREM223のリガンド結合を減少させると仮定される。R47H TREM2およびTREM2 KOの貪食機能評価を目的として、固定細胞高含有食作用アッセイをWT/R47H/KO TREM217でアイソジェニックiPSCマクロファージラインを用いて実施した。1〜5時間の貪食期間のいくつかの長さをテストし、貪食性貨物(40,000 SH-SY5Ys)の驚異的な添加を使用してテストした。結果として得られる信号は直線的に4hに増加し、5h(図5)17でわずかにオフにした。減少した食細胞化率および容量(%スポット陽性細胞)は、WTと比較してTREM2 KOで明らかであったが、R47H TREM2変異体は変わった食細胞化を示さなかった。TREM2 KO細胞における食細胞性欠損は、R47H TREM2突然変異によってフェノコピーされず、TREM2機能が正常な食細胞化を支えるのに十分であるために見える。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> 図3:生細胞時間経過貪食アッセイのデータ例 野生型iPSCマクロファージBIONi010-C(ECACC ID:66540023)による死んだSH-SY5Ysの取り込みは、3時間5分間隔で画像化した。グラフに表示される時間は、測定なしで最初の40分を含む貪食の開始からである。3つの複製ウェルからのセルあたりの平均スポット数がプロットされます。10,000のSH-SY5Ysの貪食は1時間前処理の10 μMのサイトカラシンDで阻害され、SH-SY5Ys(20,000および30,000)のより高い量は、食細胞化の最適でない定量化を有する。標準偏差(SD)±平均値、N= 1実験。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> 図4:固定細胞高含有貪食アッセイの最適化と検証(A)野生型iPSCマクロファージBIONi010-C(ECACC ID:66540023)によるSH-SY5Ys貪食の代表的な高含有顕微鏡画像。40,000 SH-SY5Ys の 3 時間のタイムポイントを示します。蛍光チャネルは、iPSCマクロファージ染色が赤、核が青色、SH-SY5Ysが黄色で示され、結合されます。インセットパネルは、画像拡大3xのセクションである(B)5時間後に食細胞細胞死SH-SY5Ysの細胞当たりのスポット数を、野生型iPSCマクロファージに異なる量の貨物添加を使用する。平均±平均の標準誤差(SEM)、N = 3収穫の場合。(C)食道(3h)は、10 μMのサイトカラシンD(Cyt)、1 μMバフィロマイシンA1(Baf)、1 μMジャスプラキノリド(1時間前処理付き)で阻害される。Jas)、および13 μg/mL組換えアネキシンV(死んだSH-SY5Ysに同時に加える;アン)。SH-SY5Yを追加していないiPSCマクロファージは陰性コントロール(-ve)として使用され、SH-SY5Ysを追加した陽性(+ve)コントロールは未処理のiPSCマクロファージです。データは、実験の繰り返しの平均に正規化されました。SEM±、N=3-6の収穫および2つの野生型細胞株(SFC840-03-03)について、この行の特徴付けは(フェルナンデスら21およびBIONi010-C)ダネットのポストテストホックとの1ウェイANOVAに記載されている。*p<0.05、***< p00000000.(D)新たに固定されたSH-SY5Ysは、ホスファチジルセリンディスプレイ(アネキシンV-FITC)用に均一に染色し、細胞透過性(ヨウ化プロピジウム)が限られている。生きたSH-SY5Ysは、培養中の少数の死細胞に存在する焦点染色を除いて、アネキシンV-FITCまたはヨウ化プロピジウムに染色しない。フィギュアはアルツハイマーの研究&治療17の許可を得て再現されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> 図5:TREM2 KOでは食細胞化は減少するが、R47H TREM2 iPSCマクロファージでは減少していない。高含有食細胞性アッセイは、驚異的な添加物を備えた1井戸あたり40,000 SH-SY5Ysで行われます。各パラメータについて、細胞あたりのスポット数、細胞当たりのスポット領域の合計(μm2)、および細胞ごとに食細胞細胞化粒子を含む細胞の割合を定量化しました。データは、実験ごとに各遺伝子型の平均値に正規化した。平均±SEM、N = 3収穫の場合。ダネットのポストホックテストである2ウェイANOVAの繰り返し測定は、毎回WTと対方向比較します:*p < 0.05、**p <0.01、***p <0.001です。フィギュアはアルツハイマーの研究&治療17の許可を得て再現されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補助図 S1: SH-SY5Ys調製のための QC の例。 解約したSH-SY5Ysを、0%(生細胞)、1%、パラホルムアルデヒド(PFA)の2%で10分間固定し、次いで洗浄した。細胞をアネキシンV-FITCとヨウ化プロピジウム(PI)で染色し、すぐにフローサイトメトリーで測定した。色密度ドットプロットは、単染色された非染色コントロールを使用して象限ゲートを配置するフローサイトメトリー解析ソフトウェアで作成されました。象限には、その象限内のイベントの割合が付きます。生細胞は主に第4四半期で、固定細胞は主に第2四半期です。Q1 = アネキシン V/PI-, Q2 = アネキシン V+/PI+, Q3 = アネキシン V+/PI-、 Q4 = アネキシン V/PI- (生細胞) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオ:ライブ細胞のタイムラプス食道。 野生型iPSCマクロファージBIONi010-C(ECACC ID:66540023)によって食細胞化SH-SY5Ysの代表的なタイムラプスビデオ。画像は3時間5分ごとに撮影した。ビデオはトリミングされ、毎秒3フレームで実行され、アッセイの最後の1.5時間を示しています。酸感受性染料染色SH-SY5Ysは、貪食酸性化に伴って増加する赤色のシグナル強度で示されている。Hoechst 33342で染色された細胞核は青色で示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

神経変性疾患は、調節不変のミクログリア機能に関連付けられている。本稿では、iPSCマクロファージによる神経芽細胞細胞の貪食のインビトロアッセイについて概説する。量的顕微鏡読み出しは、ライブ細胞タイムラプスイメージングと固定細胞高含有イメージングの両方について説明されています。

iPSCマクロファージによる死んだ神経芽細胞の食細胞に対するインビトロ定量イメージングアッセイ

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

このインビトロイメージングアッセイは、異なる細胞処理または異なる遺伝子型が微小グリア貪食症に及ぼす影響を定量化することを可能にする。神経変性疾患に関連する2つの細胞タイプを使用して、我々は大きな高含有画像画面によって容易かつ安価にスケールアップすることができる方法で調製される貪食性貨物に死んだ神経芽細胞細胞を使用する。クラス2の生物学的安全キャビネットにおいて、培地を吸引することによってSH-SY5Ysを解負する。4mlの細胞解離バッファーを加え、細胞をコーティングする薄膜として1ml未満となるように直ちにバッファーを取り出します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜3分間インキュベートします。その後、10mlのHBSSでT-75フラスコに。そして、SH-SY5Ysを15ml円錐形遠心分離管にピペットします。400xGで5分間遠心分離機。上清を吸引し、2mlのフェノールを赤く含まないHEPES緩衝培地で細胞を再懸濁し、固定前に塊を分解することを確認する。2mlの4%パワーホルムアルデヒドをチューブに加え、時折穏やかな攪拌で室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。チューブに10mlのHBSSを加えます。その後、1200xGで遠心分離機を7分間行う。上清を吸引し、2mlのフェノールを赤含まないHEPES緩衝培地中で細胞ペレットを再懸濁させた。2 ml の低タンパク質結合チューブに 100 万の HS-SY5Y 細胞を数え、除去します。総容量をフェノールを赤く含まないHEPES緩衝媒体で300~500マイクロリットルにします。その後、37°Cの水浴でチューブを簡単に温めます。メーカーの指示に従って、pHに敏感な赤色蛍光色素STPエステルを再構成します。その後、100万個のSH-SY5Y細胞あたり12.5マイクログラムの染料を添加します。チューブをフリックしてやさしく混ぜます。そして、光から保護された30分間室温でチューブをインキュベートします。1200xGでHBSSと遠心分離機を1ml加え、7分4度で摂氏4度。上清を捨てます。そして、HBSSの2 mlで洗浄します。フェノール赤自由マクロファージ培地中の細胞ペレットを1ml当たり0.2〜120万細胞の濃度に再懸濁し、50マイクロリットルが10,000〜60,000細胞を含むことになります。生物学的安全キャビネットにおいて、マクロファージ培地中のコシニミジルエステル反応性色素を意味する深赤色蛍光細胞の溶液を調製する。Hoechst 33342を追加し、水浴で37°Cに作業溶液を温めます。iPSCマクロファージ培地を優しく吸引し、マルチチャネルピペットを用いて細胞上清を無菌貯留槽にピペット化する。マルチチャンネルピペットを使用して、色素溶液のウェルあたり70マイクロリットルをiPSCマクロファージに加えます。摂氏37度と5%の二酸化炭素で1時間インキュベートします。フェノール赤自由マクロファージ培地での実験的治療を修復する。インキュベーション後、iPSCマクロファージ培地をマルチチャンネルピペットで非常に穏やかに吸引し、ウェルあたり100マイクロリットルのHBSSを加える。穏やかなピペットによってすぐにHBSSを取除く。次に、100マイクロリットルのフェノールを赤自由マクロファージ培地に加え、別々のウェルで実験的な処理を加えます。摂氏37度と5%の二酸化炭素で10分から1時間インキュベートします。マルチチャンネルピペットを使用して、液体の端にある各ウェルの側面からウェルあたり50マイクロリットルのSH-SY5Ysを追加します。その後、摂氏37度、炭酸ガス5%で3~5時間インキュベートします。食細胞化後、マルチチャネルピペットでピペット処理して細胞上清を軽く吸引し廃棄する。PBS 100マイクロリットルで1回洗浄します。その後、2%のパワーホルムアルデヒドの100マイクロリットルを加え、室温で15分間インキュベートして細胞を固定します。井戸を吸引し、PBSの100マイクロリットルを追加します。高含有顕微鏡で直接撮像を進めるか、またはプレートシーラーとホイルで覆い、必要になるまでプレートを摂氏4度で保存します。高コンテンツイメージング顕微鏡をオンにし、画像キャプチャソフトウェアを開きます。画面の上部にある「LOAD」アイコンをクリックして、アッセイプレートを顕微鏡にセットします。[セットアップ]タブを選択します。左上のボックスのドロップダウンメニューで、適切なプレートタイプを選択します。オートフォーカスオプション:2つのピーク「目的:40x水、NA 1.1"共焦点"モード、およびビニング1。設定メニューから使用する前に、40x Waterの目的をフラッシュします。チャンネル選択ボックスで、プラスアイコンを使用してチャンネルDAPI、Alexa 647、Alexa 568を追加します。1マイクロメートルの単一平面で測定するためにこれらを設定します。アッセイプレートの染色効率に関する時間と電力設定を最適化します。チャンネルシーケンスをクリックしてチャンネルを分離し、チャンネルを同時に測定しないようにします。ナビゲーションとレイアウトを定義する下で、測定のウェルを選択し、ウェルごとに 9 ~ 12 のフィールドを選択します。セットアップ中に、プレート マップの代表フィールドをクリックします。また、各測定チャンネルを順番に確認して、染色が存在し、チャンネルオフセットを調整して画像が焦点を合わせられるようにします。リモート分析のためにデータをサーバーにアップロードするには、オンラインジョブのボックスと関連する画面名をクリックします。「保存」ボタンをクリックしてアッセイプロトコルを保存し、上部にある実行実験」タブをクリックします。実験プレートに名前を付け、開始をクリックしてください"生細胞の時間が貪食アッセイは、10で、 1ウェル当たり000 SH-SY5Ysは、細胞当たりの食細胞粒子の数は時間とともに直線的に増加し、サイトカラシンD.1井戸当たりのSH-SY5Ysの量が多いほど、iPSCのセグメント化不良のために、食作用が悪い直線性を示し、 マクロファージ、およびSH-SY5Ysは、より混雑した視野で。以下の結果は、この代表的な食細胞細胞化の画像を含む、固定細胞高含有物イメージングを行った。SH-SY5Ysの量を増加させると、細胞当たりの貪食細胞粒子の数が増加した。貪食アッセイは、いくつかの貪食抑制剤を用いて検証した。サイトカラシンDおよびジャスプラキノリドは、それぞれ91%および90%の顕著な食前細胞化を阻害した。バフィロマイシンA1は、食細胞化前に1時間前培養した場合に食細胞化を31%有意に減少させた。組換えアネキシン5の添加はSH-SY5Y添加の直前にウェルに添加すると食細胞性を30%有意に減少させた。固定SH-SY5Ys蛍光アネキシン5プローブを使用してホスファチジルセリンを暴露することが確認されています。一方、生きたSH-SY5Ysはアネキシン5染色に対して陰性であった。幾つかの長さの貪食持続時間は、1〜5時間、貪食性貨物の驚異的な添加を用いて試験した。このプロトコールの全長は、貪食性貨物を調製し、iPSCマクロファージを並行して染色することによって短縮することができる。これを行う場合は、事前にタイミングを考え出し、インキュベーションを使用して今後のステップに向けたソリューションを準備してください。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

マウス腸の神経前駆細胞の定量細胞遊走アッセイ

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

エレクトロポレーションによる齧歯類坐骨神経内のシュワン細胞へのインビボ遺伝子導入で

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

体外骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

貪食能アッセイのアストロ サイトを介した新規体外ライブ イメージングを使用して pH インジケーター共役シナプトソーム

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

体外タウ蛋白と創薬スクリーニングの集計を勉強するための試金

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...