Name: in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Val Millar og Dr. Sohaib Nizami for deres hjelp med mikroskopi av høyt innhold, og Dr. Daniel Ebner for tilgang til mikroskopene med høyt innhold. Videre takker forfatterne Dr. Emma Mead for råd om analyseutvikling, og Mrs. Cathy Browne for iPSC-støtte. Dette arbeidet ble støttet av Alzheimers Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, grant reference ARUK-2020DDI-OX), med ytterligere støtte til James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) fra Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award fra Parkinsons Storbritannia (J-1403); MRC Demensplattform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 og Momentum MC_PC_16034 Awards.

<ol>
	<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li><li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+in+the+brain:+Homeostasis+and+disease.">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).</li><li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer's+disease:+potential+therapeutic+targets.">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li><li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+live+neurons.">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li><li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia.">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding.">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).</li><li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila.">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li><li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2.">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).</li><li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets.">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li><li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages.">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li><li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Alzheimer's+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout,+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages.">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12, 151 (2020).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer's+disease+not+evident+in+mouse+models.">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li><li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+robust+Z'+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons.">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).</li><li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+&#945;-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson's+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons.">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular &#945;-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li><li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2.">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li><li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease.">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Witting, A., M&#252;ller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia/brain+macrophages+in+vitro:+Involvement+of+lectin-,+integrin-,+and+phosphatidylserine-mediated+recognition.">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li><li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia.">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li><li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease.">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).</li><li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome.">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li><li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells.">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li><li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis.">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Mikroglia har viktige funksjoner som påvirker initiering og progresjon av nevrodegenerative sykdommer, inkludert fagocytose av apoptotiske nevroner. Nedsatt mikroglial fagocytose og upassende fagocytose av synapser har begge vært forbundet med nevrodegenerative sykdommer, selv om de underliggende mekanismene og årsakssammenheng ikke er godt forstått4,23. Dette dokumentet skisserer en fagocytoseanalyse for å måle fagocytose av apoptotiske celler av iPSC-makrofager, med enten en live-celle tidsforløp avbildningsavlesning eller fastcellet mikroskopi med høyt innhold, eller en kombinasjon av begge deler på en enkelt analyse. Denne allsidigheten betyr at analysen kan brukes til å studere individuelle fagocytiske hendelser over tid i noen få brønner eller brukes til screening med høyt innhold med flere tilstander eller behandlinger. Siden analysen med høyt innhold er festet på ett enkelt tidspunkt, kan flere analyseplater tilberedes samtidig. Analysen med høyt innhold har potensielt verktøy for å karakterisere makrofager/mikroglia med sykdomsrelaterte genetiske varianter eller screening av små molekylhemmere for endringer i fagocytose. Analysen kan også enkelt tilpasses for å studere fagocytose av andre mikrogliamodeller, eller potensielt astrocytter. Fagocytoseanalysen kan potensielt multiplekses med levende celleavbildningsflekker, for eksempel mitokondrier, kalsium- eller ROS-indikatorer, og etterfikseringsimmunofluorescerende farging for proteiner av interesse kan utføres. Sammenlignet med eksisterende fagocytoseanalyser som bruker apoptotiske nevronceller, er de viktigste fordelene som denne protokollen gir at forberedelsen av fagocytisk last er relativt enkel og rask, og resulterer i et ensartet produkt. Andre analyser induserer apoptose av nevroner eller SH-SY5Ys med S-nitroso-L-cystein i 2 t25, okadainsyre i 3 t22, staurosporin i 4-16 h26,27,28,29 eller UV-bestråling i 24 timer30, og kan resultere i celler på forskjellige stadier av apoptose. Videre har live-celle bildebehandling og høy-innhold bildebehandling avlesninger ikke tidligere blitt beskrevet, så vidt forfatterne er klar over. Hovedbegrensningen ved å bruke paraformaldehydfiksering for å forberede den fagocytiske lasten er at den ikke fullt ut rekapitulerer prosessen med apoptose, siden fiksering forhindrer cellene i å dele seg i apoptotiske kropper, som sannsynligvis vil bli fagocytosed raskere på grunn av deres mindre størrelse. Det er ikke kjent hvilken effekt fiksering har på sekresjonen av nukleotid "finn meg" -signaler (f.eks. ATP, UDP) fra målcellen som tiltrekker seg fagocytter. I likhet med apoptotiske celler viser de faste SH-SY5Ys noe membrangjennomtrengelighet for propidiumjodid. Membrangjennomtrengelighet er forbundet med frigjøring av "finn meg" -signaler; Dette har imidlertid ikke blitt studert i de faste SH-SY5Ys, og hvis nukleotidet frigjøres for raskt, vil de bli vasket bort før SH-SY5Ys legges til iPSC-makrofagene.
Det første kritiske trinnet i protokollen er farging av døde SH-SY5Ys med en STP ester av en pH-sensitiv rød fluorescerende fargestoff. Dette fargestoffet reagerer raskt og kovalent med frie primære aminer på overflaten av de døde SH-SY5Ys. Varigheten av farging trenger ikke å optimaliseres; Det må imidlertid utvises forsiktighet ved håndtering av fargestoffet før merking. Merkingsreaksjonen må ikke utføres i buffere som inneholder frie aminer. Videre er det fare for nedbør dersom DMSO-bestanden fortynnes i kald vandig buffer eller ved høy sluttkonsentrasjon. Utfellinger vil vises som tette mørke gjenstander under mikroskopet. I tillegg holder den pH-sensitive fargeløsningen seg til vanlige plastsentrifugerør og vasker sakte av; Derfor anbefales lavbindingsrør for merkingstrinnet. Bruk av et pH-følsomt fargestoff, i stedet for et permanent fluorescerende fargestoff, hjelper identifisering av oppslukte partikler, kontra partikler som nabo plasmamembranen. Siden det er noe fluorescens ved nøytral pH, må tettheten av fagocytisk last og iPSC-makrofager holdes lavt nok til nøyaktig segmentering, selv om det er høyt nok til at mange fagocytiske hendelser fanges. Mikroskopi med høyt innhold var i stand til nøyaktig å identifisere fagocytose med middels tetthet av last i brønnen (mer enn 2 SH-SY5Ys per iPSC-makrofag). På den annen side, på grunn av svakere følsomhet i mikroskopet i det dype røde spekteret, var segmentering av iPSC-makrofager i live-celle tidsforløpavbildningsdata mindre sikre, og det var nødvendig å bruke en svært lav tetthet av last for å redusere sannsynligheten for falske positiver (1 SH-SY5Y for hver to iPSC-makrofager). Validering av riktig segmentering og lastetetthet bør utføres med sammenligninger mellom ubehandlede og cytochalasin D-behandlede brønner. I en godt optimalisert analyse bør cytochalasin D redusere gjennomsnittlig antall flekker per celle med 90% i forhold til ubehandlede prøver.
Et annet kritisk trinn i protokollen er iPSC-makrofagfargingen, som gjør at cellen kan identifiseres og segmenteres i bildeanalyse slik at eventuelle eksterne SH-SY5Ys utelukkes fra tellingen. Det anbefalte fargestoffet er cellepermeant, omdannet til et uoppløselig fluorescerende produkt i cytoplasma, fikserbart og giftfritt (se Materialtabell). Fargingstrinnet ble optimalisert for bruk av iPSC-makrofager med høyinnholdsavbildningsfagocytoseanalysen, og vi foreslår at den bør optimaliseres på nytt hvis andre celletyper brukes. Varigheten av cellefarging kan økes for å forbedre avsetningen av det uoppløselige fluorescerende produktet i celler. Hvis fargekonsentrasjonen er optimalisert, bør det tas hensyn til å unngå giftige nivåer av det organiske løsningsmiddelkjøretøyet.
Den tredje kritiske faktoren for suksessen til analysen er dataanalysen. Analyserørledningene som tilbys er ment å være veiledende i stedet for preskriptive, da forskjeller i fargeintensitet eller cellemorfologi kan redusere effektiviteten av segmentering av rørledningene som skrevet. Noen optimaliseringer vil derfor være nødvendig, med testing av rørledningen på passende positive og negative kontroller, og parametrene som skal optimaliseres er angitt i protokollteksten. Negative kontroller bør inkludere en tilstand der iPSC-makrofager er forhåndsbehandlet med en potent fagocytosehemmer som cytochalasin D før tilsetning av SH-SY5Ys. En annen mulig negativ kontroll er tillegg av SH-SY5Ys til tidligere ubehandlede brønner av iPSC-makrofager på slutten av analysen, 10 min før fiksering, noe som gjør at noe bosetting av lasten, men er for kort for en merkbar mengde fagocytose. En fagocytosehendelse defineres som et rødfluorescerende objekt innenfor grensene til en iPSC-makrofag, definert av programvarealgoritmen ved hjelp av den dype røde fluorescenskanalen. Hvis segmenteringen av cellene er dårlig (figur 2), kan mange ikke-fagocytosed SH-SY5Ys i nærheten av iPSC-makrofager feilaktig inkluderes i analysen, det vil si falske positiver. Den viktigste faktoren for å oppnå god segmentering er streng avgrensning av iPSC-makrofagene. Segmentering for begge analysene er automatisert, så det er ikke mulig å oppnå perfekt segmentering for hver celle; Noen få parametere kan imidlertid justeres for å gjøre segmenteringen mer optimal, ved å bruke noen få testbilder som referanse. Cytochalasin D-kontrollen er viktig for å vurdere optimal segmentering fordi et høyt antall fagocytiske hendelser som oppdages i denne tilstanden indikerer at segmenteringen er sub-optimal. Optimalisering av dataanalyserørledningen bør ideelt sett gjentas til antall fagocytiske hendelser per celle er 80% -90% lavere i cytochalasin D-tilstanden kontra ingen hemmer.
Problemene med fagocytoseanalysen som mest sannsynlig oppstår er: (1) svak pH-sensitiv fluorescens i positive kontroller, (2) sparsom eller ujevn fordeling av makrofager på slutten av analysen, eller (3) høyt antall falske positive i analysen fra ikke-fagocytoserte SH-SY5Ys. Feilsøking av svak pH-sensitiv fluorescens bør først kontrollere at farging av SH-SY5Ys resulterte i en cellepellet med sterk magentafarge. Hvis fargen er svak, sørg for at en fersk fargestoff brukes, sørg for at etikettbufferen er aminfri, legg til en ekstra vask til SH-SY5Ys før farging, kontroller om riktig antall SH-SY5Ys ble farget, sørg for at ingen fargestoffutfellinger er bevist, og optimaliser etikettkonsentrasjonen av fargestoffet. Hvis SH-SY5Ys er sterkt farget, kontroller om konsentrasjonen som legges til analyseplaten er riktig, og sørg for at iPSC-makrofagene er sunne og ikke for gamle. Den andre typen problem, ujevn makrofagfordeling, kan skyldes tap av celler under pipettering, og det bør tas skritt for å redusere pipetteringskreftene som cellene har opplevd, og unngå smale borespisser. Hvis problemet gjenstår, reduser inkubasjonstiden for lasting av iPSC-makrofager med cellepermeantfargestoff. Det tredje problemet, når det gjelder feilaktig inkludering av ikke-fagocytoserte partikler i analysen, indikerer at mer optimalisering av analyserørledningen er nødvendig. Feilsøking bør først fokusere på cellesegmentering og om programvaren inkluderer tilstøtende objekter. Spesifikke parametere som kan justeres, foreslås i notatene nedenfor de relevante trinnene (trinn 6.1.11-6.1.15 for live-cell time-lapse-analysen og trinn 6.2.4-6.2.8 for analysen med høyt innhold). Hvis cellesegmentering ikke kan forbedres ytterligere, har analysen med høyt innhold et ekstra trinn (trinn 6.2.8) som utelukker feil segmenterte iPSC-makrofager. Videre kan modulen som filtrerer aksepterte flekker av pH-sensitiv fluorescens i iPSC-makrofager optimaliseres, noe som øker terskelintensiteten til aksepterte objekter, noe som bør bidra til å utelukke ikke-fagocytosed SH-SY5Ys (trinn 6.1.17 for live-celle time-lapse analyse, og trinn 6.2.11 for høyinnholdsanalysen).
Vi utviklet to typer mikroskopiavlesning for fagocytoseanalysen som hver har fordeler og begrensninger. Live-celle tidsforløp bildebehandling har fordelene ved å gi ekstra informasjon om fagocytose kinetikk og er mer allment tilgjengelig enn høyinnholds bildeplattformer. Den anbefalte åpen kildekode-programvaren er agnostisk for mikroskopkilden og kan brukes med ethvert fluorescerende mikroskop av god kvalitet, med eller uten tidsforløp for levende celler. Hovedbegrensningen i live-celle-avbildningen er begrenset følsomhet og optikk, noe som gjør det mer utfordrende å oppdage og utføre god segmentering av iPSC-makrofager. Denne begrensningen kan reduseres enten ved å øke varigheten av iPSC-makrofagfarging, eller ved å bytte til et mer følsomt mikroskop, hvis tilgjengelig. Bildefilocytoseanalysen med høyt innhold er den anbefalte avlesningen hvis et bildesystem med høyt innhold er tilgjengelig. Bildesystemer med høyt innhold muliggjør høyere gjennomstrømning og mer pålitelige data, slik at denne analysen kan brukes til screening, der en robust Z' på ≥0,7 forventes for "antall plasser per celle" utgang20. Sammenlignet med live-cell time-lapse-metoden, har høyinnholdsmikroskopiavlesning høyere følsomhet, høyere grad av automatisering og hastighet, flere brønner og bildefelt kan behandles, og høyoppløselige konfokale bilder produseres. Cellesegmentering er mer effektiv med gode bilder, og segmentering er i tillegg hjulpet av høyinnholds bildeanalyseprogramvaren som gir flere cellesegmenteringsmetoder som passer for svært uregelmessig formede celler. Den høy-innhold bildebehandling analyse programvare også beregnet flere parametere av fagocytose, sammenlignet med åpen kildekode programvare, for eksempel prosentandelen av fagocytiske celler. Hovedbegrensningen av høyinnholds fagocytoseanalysen er en av kostnadene og tilgjengeligheten til bildesystemet og analyseprogramvaren.
Til slutt er den kvantitative fagocytoseanalysen presentert i dette dokumentet et nyttig verktøy for modellering av mikroglia fagocytose av døde nevroner in vitro. Mikroglia er modellert av iPSC-makrofager og de døde nevronene er modellert av paraformaldehydfaste SH-SY5Ys. Selv om ikke de mest autentiske mikroglia- og død/apoptotiske nevronmodellene er publisert, er disse enkle å forberede og skalerbare. Analysen i seg selv er svært allsidig, med to typer bildeavlesning detaljert, og den har potensial til å bli tilpasset for bruk med forskjellige mikroglia / makrofag monokulturmodeller, eller en annen celletype for å fungere som fagocytisk last. Høyinnholdsavbildningsavlesningen er fordelaktig for å skaffe kvantitative data og kan skaleres opp til analyse av små molekylmodulatorer av fagocytose, eller skjermgenetiske varianter i iPSC-makrofagene. Men siden bildesystemer med høyt innhold er dyre og datatunge, har en alternativ bildebehandlingsavlesning blitt inkludert i protokollen ved hjelp av et live-celle tidsforløpmikroskop, som kan erstattes av ethvert konvensjonelt fluorescensmikroskop av god kvalitet, om nødvendig.

Mikroglia er hjernevevsbeboende makrofager, og deres funksjoner inkluderer immunovervåking, koordinering av inflammatoriske responser på skade / infeksjon, synaptisk ombygging og fagocytose av døde celler, myelin, proteinaggregater og patogener. Fagocytose er prosessen der mikroglia gjenkjenner last med overflatereseptorer og omorganiserer cytoskjelettet for å oppsluke objektet til et fagfelle, som deretter smelter sammen med lysosomer for nedbrytning av lasten. Sunn microglia phagocytose apoptotiske hjerneceller for å fjerne dem før de blir nekrotiske1. Fagocytose av apoptotiske celler er også kjent som efferocytose, og krever visning av et fosfatidylserine "eat-me" -signal av døende celle2. Tallrike mikrogliareseptorer binder seg direkte til fosfatidylserin, inkludert TIM-4, BAI1, Stabilin-2 og TREM2. Mikrogliale TAM-reseptorer (f.eks. MERTK) og integriner binder seg indirekte til fosfatidylserin ved hjelp av henholdsvis tilbehørsproteiner GAS6 eller MFG-E8. Andre "eat-me" signaler kan være nødvendige for anerkjennelse av døende celler, disse inkluderer endringer i glykosylering eller ladning av overflateproteiner; uttrykk for intracellulære proteiner ICAM3, calreticulin, annexin-I på celleoverflaten; oksidert LDL; eller belegg av apoptotisk celle ved hjelp av mikrogliaprodusert komplement C1q1,2.
Nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, frontotemporal demens og amyotrofisk lateral sklerose har vært forbundet med svekkelse av mikrogliafunksjon, inkludert opphopning av hjerneavfallsprodukter som døde celler, myelinfragmenter og proteinmengder, og overdrevne inflammatoriske responser på disse stimuli3. Fagocytose kan svekkes ved nevrodegenerative sykdommer og bidra til patologien, på grunn av en kombinasjon av aldring, betennelse eller spesifikke genetiske risikovarianter4,5. På den annen side er det også bevis fra dyremodeller av nevrodegenerative sykdommer at mikroglia upassende kan fagocytose levedyktige nevroner eller synapser6,7,8. Mekanismen er sannsynlig å bli initiert av fosfatidylserine visning av skadede neuritter, som er direkte følt av mikroglial fagocytose reseptorer TREM2 eller GPR56, eller indirekte følt av løselig komplement C1q belegg fosfatidylserine-beriket membran, noe som fører til CR3-mediert fosinocytose9,10,11.
In vitroanalyser av fagocytosefunksjon, for eksempel for å vurdere fenotypisk effekt av en genetisk risikovariant i mikroglia, utføres ofte ved hjelp av ikke-fysiologiske last som lateksperler4. Fluorescerende merkede bakterier og zymosan brukes også, som er fysiologiske, men ikke relevante for nevrodegenerative sykdommer. Ikke-fysiologiske fagocytiske last kan brukes til å oppdage feil i det grunnleggende maskineriet av fagocytisk engulfment, men unnlater å nøyaktig modellere det første "anerkjennelsestrinnet" i fagocytose av apoptotiske nevroner. Størrelsen, formen, stivheten og typen last dikterer også de intracellulære signalveiene som aktiveres, noe som fører til forskjellige resultater av mikrogliaaktiveringstilstand. For eksempel er E.coli-bakterier små og stive, i motsetning til menneskelige celler, og lipopolysakkaridene på overflaten er anerkjent av Toll-lignende reseptor 4 (TLR4) som aktiverer fagocytose og proinflammatoriske signalveier2,12.
I sammenheng med nevrodegenerative sykdomsstudier vil en mer relevant fagocytisk last ha fosfatidylserinevisning på pattedyrplasmamembraner, og vil ideelt sett være menneskelige og nevronale, for å inkludere signaler som mikroglia sannsynligvis vil møte. For denne fagocytoseprotokollen ble den menneskelige nevroblastomcellelinjen SH-SY5Y valgt som en nevronmodell som er lett å kultur. Permanent overflatefosfatidylserine display ble kunstig indusert av paraformaldehyd, som tidligere har vist seg å forårsake fosfatidylserine visning av blodplater13. For mikroglia cellemodellen ble menneskelige iPSC-makrofager brukt, som etterligner den ongeni og transkripsjonsprofilen til menneskelig mikroglia, og er fagocytiskkompetente 14,15,16,17. iPSC-makrofager er ikke den mest autentiske mikroglia-modellen som er tilgjengelig, for eksempel etterligner de ikke mikrogliamorfologi; Imidlertid kan man erstatte den med en mer autentisk monokultur iPSC-modell av mikroglia om ønskelig, for eksempel Haenseler et al.15. Menneskelige iPSC-modeller er å foretrekke fremfor primær gnagermikroglia for å studere nevrodegenerasjon, på grunn av bekymringer om den begrensede overlappingen av mikrogliatranskripsjonsmodulene som observeres i human versus mus nevrodegenerativ sykdomsvev18. De døde SH-SY5Ys er farget med et syrefølsomt fargestoff som fluoresces svakt ved nøytral pH og sterkere inne i fagocykosomer av iPSC-makrofager etter fagocytose. Bruk av et syrefølsomt fargestoff forbedrer nøyaktigheten av å oppdage fagocytiske hendelser, med allsidighet for forskjellige avlesninger av levende og faste makrofager19. Denne protokollen skisserer både live-celle tidsforløp avbildning av fagocytose, og en fast bildebehandlingsanalyse med høyt innhold for fagocytose, med de samme celleforberedelsestrinnene før avlesning (figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Figur 1: Skjematisk diagram over metodikk. Kontur av fagocytoseanalysen, hvor forberedelse av SH-SY5Ys og farging av iPSC-makrofagene utføres parallelt, og deretter blir SH-SY5Ys pipettert på iPSC-makrofagene. Enten utføres tidsforløpavbildning i sanntid umiddelbart, eller cellene inkuberes ved 37 °C/5 % CO2 for ønsket varighet og festes før de utfører mikroskopi med høyt innhold. PFA: paraformaldehyd, HBM: fenol rødfri HEPES-bufret medium, pHr: pH-sensitiv rød fluorescerende fargestoff STP Ester-løsning, PRFMM: fenol rødfrie makrofagmedier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>For centrifugation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L, 20-200 &#181;L, 100-1000 &#181;L single-channel micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Component of Factory media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>For fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell-800 24-well plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34815</td>
			<td>Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14085</td>
			<td>Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 &#956;M, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 laminar air flow safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, set to 37&#176;C and 5 % CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image Data Storage and Analysis System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11330</td>
			<td>Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20&#176;C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320074</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for CellTracker and pHrodo dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>Live-cell time-lapse imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube CY5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4656</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4650</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube RFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 10-547F</td>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant BMP4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-3</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC0033</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant VEGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein binding 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108.132</td>
			<td>For staining SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC9501</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel 20-200 uL pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For liquid handling of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td>High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36011</td>
			<td>pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 &#956;L (12.5 &#956;g) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette filler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as &#34;Factories&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for SH-SY5Y culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealers</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676001</td>
			<td>For assay plate storage and transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, set to 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418F</td>
			<td>Component of Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-744Q</td>
			<td>Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages

Mikroglia orkestrerer nevroimmuneresponser ved flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom og Alzheimers sykdom. Microglia rydder opp døde og døende nevroner gjennom prosessen med efferocytose, en spesialisert form for fagocytose. Fagocytosefunksjonen kan forstyrres av miljømessige eller genetiske risikofaktorer som påvirker mikroglia. Dette dokumentet presenterer en rask og enkel in vitro mikroskopiprotokoll for å studere mikroglial efferocytose i en indusert pluripotent stamcelle (iPSC) modell av mikroglia, ved hjelp av en menneskelig nevroblastomcellelinje (SH-SY5Y) merket med et pH-følsomt fargestoff for fagocytisk last. Prosedyren resulterer i et høyt utbytte av døde nevroblastomceller, som viser overflatefosfatidylserine, anerkjent som et "eat-me" -signal av fagocytter. 96-brønnsplateanalysen er egnet for tidsforløpavbildning i levende celler, eller platen kan fikses før videre behandling og kvantifiseres ved mikroskopi med høyt innhold. Mikroskopi med fast celleinnhold gjør det mulig å skalere analysen opp for screening av små molekylhemmere eller vurdere den fagocytiske funksjonen til genetisk variant iPSC-linjer. Mens denne analysen ble utviklet for å studere fagocytose av hele døde nevroblastomceller av iPSC-makrofager, kan analysen lett tilpasses andre last som er relevante for nevrodegenerative sykdommer, som synaptosomer og myelin, og andre fagocytiske celletyper.

Live-celle tidsforløpavbildning ble utført ved hjelp av den tidligere skisserte protokollen, med wild-type iPSC-makrofager sådd ved 20.000 celler per brønn. Ulike mengder SH-SY5Ys ble brukt (10.000-30.000 per brønn som estimert fra celleantallet i trinn 3.1), og fagocytosehemmeren cytochalasin D ble pre-inkubert (1 h) med noen brønner, som fungerer som en kontroll for å hemme fagocytose for hver mengde SH-SY5Ys. Imaging startet 40 min etter at SH-SY5Ys ble tillagt, og bilder ble tatt med 5 minutters intervaller for de neste 3 t (data inkluderer den første forsinkelsen på 40 minutter). En representativ intervallvideo er inkludert i tilleggsdataeneog analyserte kvantitative data som vises i figur 3. Med mengden 10.000 SH-SY5Y per brønn økte antall fagocytoserte partikler (flekker) per celle lineært med tiden, og ble hemmet med ca. 50% av cytochalasin D. Hemmingen av cytochalasin D var svakere enn forventet, mest sannsynlig forårsaket av utilstrekkelige tekniske eller biologiske replikeringer, da bare en brønn per tilstand ble avbildet med tre bildefelt. Med høyere mengder SH-SY5Ys per brønn (20.000 og 30.000) viste fagocytose dårlig linearitet, sannsynligvis på grunn av dårlig segmentering av iPSC-makrofager og SH-SY5Ys i et mer overfylt synsfelt.
Avbildning med fast celle med høyt innhold ble utført ved hjelp av den tidligere skisserte protokollen, med wild-type iPSC-makrofager ved 20 000 celler per brønn, flere forskjellige mengder SH-SY5Ys (10 000-80 000 per brønn), og analyseplaten ble festet og avbildet etter 5 timer. Et representativt bilde av fagocytose presenteres i figur 4A, og de analyserte dataene vist i figur 4B17. Økning av mengden SH-SY5Ys resulterte i et høyere antall fagocytoserte partikler (flekker) per celle; En dobling av SH-SY5Y-mengden fører imidlertid bare til en 1,5x økning i antall flekker per celle. Dette indikerer at de testede beløpene ikke er ratebegrensende for fagocytose. Deretter ble bildeocytoseanalysen med høyt innhold validert ved hjelp av flere hemmere av fagocytose (figur 4C)17. Aktinpolymerisasjonshemmerne cytochalasin D og jasplakinolid hemmet signifikant fagocytose med henholdsvis 91% og 90%, når de ble pre-inkubert i 1 time før fagocytose. Den robuste Z'en til analysen når cytochalasin D eller jasplakinolid brukes som negative kontroller, beregnes somhenholdsvis0,7 og 0,8 . Lysosomets forsuringshemmer bafilomycin A1 reduserte fagocytose betydelig med 31%, når den inkuberes 1 time før fagocytose. Den svakere effekten av lysosomets forsuringshemmer versus aktinhemmere tyder på at deteksjon av den internaliserte lasten kanskje ikke krever full forsuring av faget. Rekombinant annexin V ble brukt som en kontroll for å spesifikt blokkere fosfatidylserine eksponert på overflaten av SH-SY5Ys, og forhindret fagocytiske reseptorer fra å få tilgang til liganden, et viktig "eat-me" -signal. Tilsetning av rekombinant anneksin V reduserte fagocytose betydelig med 30%, når det ble tilsatt brønner umiddelbart før SH-SY5Y tillegg. Faste SH-SY5Ys ble bekreftet å eksponere fosfatidylserine, ved hjelp av en fluorescerende annexin V-sonde, mens levende SH-SY5Ys var negative for annexin V farging (Figur 4D).
Den mikrogliale fagocytosereseptoren TREM2 har tidligere vist seg å være viktig for fagocytose av apoptotiske nevroner21. R47H-mutasjonen av TREM2 er et risikogen for sen-utbrudd av Alzheimers sykdom, og er hypoteset for å redusere ligandbinding av TREM223. Med sikte på å vurdere fagocytisk funksjon av R47H TREM2 og TREM2 KO, ble den fastcellede høyinnholds fagocytoseanalysen utført ved hjelp av isogene iPSC-makrofaglinjer med WT / R47H / KO TREM217. Flere lengder av fagocytosevarighet fra 1 til 5 timer ble testet, ved hjelp av et forskjøvet tillegg av fagocytisk last (40.000 SH-SY5Ys). Det resulterende signalet øker lineært til 4 timer, og flater litt ut ved 5 timer (figur 5)17. Redusert fagocytosehastighet og kapasitet (% spot positive celler) var tydelig i TREM2 KO sammenlignet med WT, mens R47H TREM2 mutant ikke viste endret fagocytose. Den fagocytiske defekten i TREM2 KO-celler er ikke fenokopiert av R47H TREM2-mutasjonen, tilsynelatende fordi TREM2-funksjonen er tilstrekkelig til å støtte normal fagocytose.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Figur 3: Eksempeldata for tidsforløp for levende celler, phagocytoseanalyse. Opptak av døde SH-SY5Ys av wild-type iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) avbildet med 5 minutters intervaller i 3 timer. Tidene som vises på grafen er fra initiering av fagocytose, inkludert de første 40 min uten måling. Gjennomsnittlig antall plasser per celle fra tre replikeringsbrønner er plottet inn. Fagocytose på 10.000 SH-SY5Ys hemmes med 10 μM cytochalasin D med 1 t forbehandling, mens høyere mengder SH-SY5Ys (20.000 og 30.000) har suboptimal kvantifisering av fagocytose. Gjennomsnitt ± standardavvik (SD), N = 1 eksperiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Figur 4: Optimalisering og validering av fagocytoseanalyse med fast celleinnhold ( A) Representativt mikroskopibilde av SH-SY5Ys fagocytosed av wild-type iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Et tidspunkt på 3 timer med 40 000 SH-SY5Ys vises. Fluorescenskanaler slås sammen, med iPSC-makrofagflekk vist som rød, kjerner som blå og SH-SY5Ys som gule. Innfelt panel er en del av bildet forstørret 3x. (B) Antall flekker per celle av fagocytoserte døde SH-SY5Ys etter 5 h, ved hjelp av forskjellige mengder last tillegg til wild-type iPSC-makrofager. Gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM), for N = 3 høstinger. (C) Fagocytose (3 h) hemmes med 10 μM cytochalasin D (Cyt), 1 μM bafilomycin A1 (Baf), 1 μM jasplakinolide (med 1 t forbehandling; Jas), og 13 μg/ml rekombinant annexin V (lagt samtidig til de døde SH-SY5Ys; Ann). iPSC-makrofager uten SH-SY5Ys lagt til ble brukt som en negativ kontroll (-ve), og den positive (+ve) kontrollen er ubehandlet iPSC-makrofager med SH-SY5Ys lagt til. Data ble normalisert til gjennomsnittet for eksperimentets repetisjon. Midler ± SEM, for N = 3-6 høstinger og med to wild-type cellelinjer (SFC840-03-03, karakteriseringen av denne linjen er beskrevet i (Fernandes et al.21 og BIONi010-C). 1-veis ANOVA med Dunnetts post-hoc-test, sammenligninger med ubehandlede celler. *p < 0,05, ***p < 0,001. (D) Ferskt fast SH-SY5Ys flekk jevnt for fosfatidylserine display (annexin V-FITC) og har begrenset celle permeabilitet (propidiumjodid). Levende SH-SY5Ys flekker ikke for annexin V-FITC eller propidiumjodid, bortsett fra brennvidde tilstede på de få døde cellene i kulturen. Tallene reproduseres med tillatelse fra Alzheimers Research &Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Figur 5: Fagocytose reduseres i TREM2 KO, men ikke i R47H TREM2 iPSC-makrofager. Høyinnholds fagocytoseanalyse utført med 40.000 SH-SY5Y per brønn med forskjøvet tillegg. Midler ble kvantifisert for parametrene: antall flekker per celle, summen av spotområder (μm2) per celle og prosentandel av celler som inneholder fagocytoserte partikler per felt. Data ble normalisert til middelverdi for hver genotype per eksperiment. Gjennomsnittlig ± SEM, for N = 3 høstinger. Gjentatte tiltak 2-veis ANOVA, Dunnetts post-hoc-test, parvis sammenligninger med WT for hver gang: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Tallene reproduseres med tillatelse fra Alzheimers Research &Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplerende figur S1: Eksempel QC for SH-SY5Ys forberedelse. Dissosierte SH-SY5Ys ble festet i 10 minutter med 0% (levende celler), 1% og 2% av paraformaldehyd (PFA), deretter vasket. Celler ble farget med annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) og umiddelbart målt ved strømningscytometri. Fargetetthetsprikkplott ble opprettet i programvare for flytcytometrianalyse, ved hjelp av enkeltfargede og unstained kontroller for å plassere en kvadrantport. Kvadranter er kommentert med prosentandelen av hendelser i den kvadranten. Levende celler er hovedsakelig i fjerde kvartal, og faste celler er hovedsakelig i andre kvartal. Q1 = annexin V-/PI-, Q2 = annexin V+/PI+, Q3 = annexin V+/PI-, Q4 = annexin V-/PI- (levende celler). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende video: Live-celle tidsforløp fagocytose. Representativ time-lapse video av SH-SY5Ys fagocytosed av wild-type iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Bilder ble tatt hver 5 min i 3 timer. Videoen beskjæres og kjøres med 3 bilder per sekund, og viser de siste 1,5 t av analysen. De syrefølsomme fargestofffargede SH-SY5Ys er vist i rødt, signalintensiteten øker med fagosforsuring. Cellekjerner farget med Hoechst 33342 er vist i blått. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Nevrodegenerative sykdommer er forbundet med dysregulerte mikrogliafunksjoner. Denne artikkelen skisserer en in vitro-analyse av fagocytose av nevroblastomceller av iPSC-makrofager. Kvantitative mikroskopiavlesninger er beskrevet for både tidsforløpavbildning i sanntid og bilder med fast celle med høyt innhold.

In vitro kvantitativ bildeanalyse for fagocytose av døde nevroblastomceller ved iPSC-makrofager

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Denne in vitro-avbildningsanalysen gjør det mulig å kvantifisere effekten av forskjellige cellebehandlinger eller forskjellige genotyper på mikroglial fagocytose. Ved hjelp av to celletyper som er relevante for nevrodegenerativ sykdom, bruker vi døde nevroblastomceller for fagocytisk last, som fremstilles på en måte som enkelt og billig skaleres opp av store bildeskjermer med høyt innhold. I et biologisk sikkerhetsskap i klasse 2, ta avstand fra SH-SY5Ys ved å aspirere mediet.Tilsett 4 ml celledissosiasjonsbuffer, og fjern bufferen umiddelbart slik at mindre enn 1 ml forblir som et tynt filmbelegg cellene. Inkuber i 2 til 3 minutter ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Deretter ved 10 ml HBSS til T-75 kolbe.Og pipette SH-SY5Ys inn i et 15 ml konisk sentrifugerør. Sentrifuge ved 400xG i 5 minutter. Aspirer supernatanten, og re-suspendere cellene i 2 ml fenol rødfri HEPES bufret medium, sørg for å bryte opp klumper før fiksering.Fest cellene ved å legge til 2 ml 4% kraft formaldehyd til røret og inkubere i 10 minutter ved romtemperatur med sporadisk mild agitasjon. Tilsett 10 ml HBSS i røret. Deretter sentrifugerer du på 1200xG i 7 minutter.Aspirer supernatanten, og re-suspendere cellepellet i 2 ml fenol rødfri HEPES bufret media. Tell og fjern 1 million HS-SY5Y celler i et 2 ml lavt proteinbindende rør. Bring det totale volumet til 300 til 500 mikroliter med fenol rødfri HEPES bufret medium.Varm deretter røret kort i et 37 grader Celsius vannbad. Rekonstituer den pH-sensitive røde fluorescerende fargestoff stp ester i henhold til produsentens instruksjoner. Tilsett deretter 12,5 mikrogram fargestoff per million SH-SY5Y-celler.Bland forsiktig ved å flikke røret. Og inkuber røret ved romtemperatur i 30 minutter, beskyttet mot lys. Tilsett 1 ml HBSS og sentrifuge ved 1200xG i 7 minutter og 4 grader Celsius.Kast supernatanten. Og vask med 2 ml HBSS. Re-suspendere cellepellet i fenol rødfrie makrofagmedier til en konsentrasjon på 0,2 til 1,2 millioner celler per ml, slik at 50 mikroliter inneholder 10.000 til 60.000 celler.I et biologisk sikkerhetsskap, lag en løsning av dyprød fluorescerende cellepermeant succinimidyl ester-reaktiv fargestoff i makrofagmedier. Tilsett Hoechst 33342, og varm arbeidsløsningen til 37 grader Celsius i et vannbad. Aspirer iPSC-makrofagmediet forsiktig ved å røre cellen supernatant med en flerkanals pipette inn i et sterilt reservoar.Tilsett 70 mikroliter per brønn av fargestoffløsningen til iPSC-makrofagene ved hjelp av en flerkanals pipette. Inkuber i 1 time ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Reparer eksperimentelle behandlinger i fenol rødfrie makrofagmedier.Etter inkubasjonen aspirerer du iPSC-makrofagmediet veldig forsiktig med en flerkanals pipette, og tilsett 100 mikroliter HBSS per brønn. Fjern HBSS umiddelbart ved skånsom pipettering. Tilsett deretter 100 mikroliter fenol rødfrie makrofagmedier, pluss eksperimentelle behandlinger i separate brønner.Inkuber i 10 minutter til 1 time ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Bruk en flerkanals pipette for å legge til 50 mikroliter av de merkede SH-SY5Ys per brønn fra sidene av hver brønn på kanten av væsken. Deretter inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 3 til 5 timer.Etter fagocytoseinkubasjonen aspirerer forsiktig celle supernatanter ved å pipettere med en flerkanals pipette og kaste bort. Vask en gang med 100 mikroliter PBS. Fest deretter cellene ved å legge til 100 mikroliter med 2% kraft formaldehyd og inkubere i 15 minutter ved romtemperatur.Aspirer brønner og tilsett 100 mikroliter PBS. Fortsett enten direkte til bildebehandling med mikroskopet med høyt innhold, eller dekk med plateforsegler og folie, og lagre platen ved 4 grader Celsius, til det er nødvendig. Slå på bildemikroskopet med høyt innhold, og åpne programvaren for bildeopptak.Last analyseplaten inn i mikroskopet ved å klikke på LOAD"-ikonet øverst på skjermen. Velg SETUP"-fanen. Velg riktig platetype i rullegardinmenyene øverst til venstre.Autofokusalternativet: to topper"Målet: 40x Vann, NA 1.1"Confocal"-modus og Binning av 1. Skyll målsettingen 40x Vann før bruk via innstillingsmenyen. I kanalvalgboksen bruker du plussikonet til å legge til kanalene DAPI, Alexa 647 og Alexa 568.Sett disse til å måle på et enkelt plan på ett mikrometer. Optimaliser tids- og strøminnstillinger for fargeeffektiviteten til analyseplaten. Forsikre deg om at kanalene ikke måles samtidig, ved å klikke på kanalsekvensen for å skille ut kanalene.Velg målebrønnene under navigasjon og definer oppsett, og velg 9 til 12 felt per brønn. Under installasjonen klikker du på et representativt felt på platekartet. Og kontroller hver målekanal i sin tur for å sikre at fargingen er til stede, og at bildene er fokusert ved å justere kanalforskyvningen.For å laste opp dataene til en server for ekstern analyse, klikk på boksen online jobber"og det aktuelle skjermnavnet. Lagre analyseprotokollen ved å klikke på lagre"-knappen, og klikk på kjør eksperimentet"fanen øverst. Navngi eksperimentplaten, og klikk deretter på start"En levende celletid lever fagocytoseanalyse viste at med 10, 000 SH-SY5Y per brønn, antall fagocytosepartikler per celle økte lineært med tiden og ble hemmet av omtrent 50% av Cytochalasin D.Med høyere mengder SH-SY5Ys per brønn viste fagocytose dårlig linearitet, sannsynligvis på grunn av dårlig segmentering av iPSC, makrofager og SH-SY5Ys i et mer overfylt synsfelt.Følgende resultater ble oppnådd ved å utføre en avbildning med fast celle høyt innhold, inkludert dette representative bildet av fagocytose. Økning av mengden SH-SY5Ys resulterte i et høyere antall fagocytoserte partikler per celle. Fagocytoseanalysen ble validert ved hjelp av flere hemmere av fagocytose.Cytochalasin D og Jasplakinolide hemmet signifikant fagocytose med henholdsvis 91 og 90 prosent. Og Bafilomycin A1 reduserte fagocytose betydelig med 31%når den ble pre-inkubert i 1 time før fagocytose. Tilsetning av rekombinant annexin 5 reduserte fagocytose betydelig med 30%når det ble tilsatt brønner umiddelbart før SH-SY5Y tillegg.Fikset SH-SY5Ys vi er bekreftet å utsette Fosfatidylserine ved hjelp av en fluorescerende Annexin 5 sonde. Mens levende SH-SY5Ys var negative for Annexin 5 farging. Flere lengder av fagocytosevarighet, fra 1 til 5 timer, ble testet ved hjelp av forskjøvet tilsetning av fagocytisk last.Den totale lengden på denne protocall kan forkortes ved å forberede fagocytisk last og farging av iPSC makrofager parallelt. Hvis du vil gjøre dette, kan du utarbeide tidspunktene på forhånd og bruke inkubasjonene dine til å forberede løsninger for fremtidige trinn.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

En kvantitativ Cell Migration analysen for Murine resistente Neural stamceller

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM og pH-følsomme GFP-sonder for å evaluere Neurotransmitter Vesikkel Dynamics i SH-SY5Y neuroblastom celler: Cell Imaging og dataanalyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverføring til Schwann celler i gnagere isjiasnerven ved Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Fagocytose av Myelin rusk av Ben margtransplantasjon-avledet makrofager

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Analysen utvikling for høy innhold kvantifisering av Sod1 Mutant Protein samlet formasjon i levende celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

En roman I Vitro Live bildebehandling analysen av astrocytter-mediert fagocytose bruker pH indikator-konjugerte Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Analysen for å studere aggregering av Tau Protein og narkotikarelaterte Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...