Name: in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

Os autores agradecem ao Dr. Val Millar e ao Dr. Sohaib Nizami por sua assistência com microscopia de alto conteúdo, e o Dr. Daniel Ebner pelo acesso aos microscópios de alto conteúdo. Além disso, os autores agradecem à Dra. Este trabalho foi apoiado pelo Alzheimer's Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, referência de subvenção ARUK-2020DDI-OX), com apoio adicional à James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) da Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award do Reino Unido de Parkinson (J-1403); a MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 e Momentum MC_PC_16034 Awards.

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	<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li><li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+in+the+brain:+Homeostasis+and+disease.">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).</li><li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer's+disease:+potential+therapeutic+targets.">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li><li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+live+neurons.">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li><li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia.">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding.">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).</li><li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila.">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li><li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2.">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).</li><li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets.">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li><li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages.">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li><li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Alzheimer's+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout,+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages.">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12, 151 (2020).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer's+disease+not+evident+in+mouse+models.">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li><li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+robust+Z'+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons.">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).</li><li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+&#945;-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson's+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons.">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular &#945;-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li><li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2.">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li><li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease.">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Witting, A., M&#252;ller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia/brain+macrophages+in+vitro:+Involvement+of+lectin-,+integrin-,+and+phosphatidylserine-mediated+recognition.">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li><li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia.">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li><li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease.">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).</li><li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome.">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li><li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells.">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li><li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis.">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A microglia tem funções importantes que afetam a iniciação e progressão de doenças neurodegenerativas, incluindo fagocitose de neurônios apoptóticos. A fagocitose microglial prejudicada e a fagocitose inadequada das sinapses têm sido associadas a doenças neurodegenerativas, embora os mecanismos e causalidades subjacentes não sejam bem compreendidos4,23. Este artigo descreve um ensaio de fagocitose para medir a fagocitose de células apoptóticas por macrófagos iPSC, com uma leitura de imagem de lapso de tempo de células vivas ou microscopia de alto conteúdo de células fixas, ou uma combinação de ambos em um único ensaio. Essa versatilidade significa que o ensaio pode ser usado para estudar eventos fagácticos individuais ao longo do tempo em alguns poços ou usado para triagem de alto conteúdo com múltiplas condições ou tratamentos. Uma vez que o ensaio de alto teor é fixado em um único ponto de tempo, várias placas de ensaio podem ser preparadas simultaneamente. O ensaio de alto teor tem utilidade potencial para caracterizar macrófagos/microglia com variantes genéticas associadas à doença ou triagem de inibidores de pequenas moléculas para alterações na fagocitose. O ensaio também pode ser facilmente adaptado para estudar fagocitose de outros modelos de microglia, ou potencialmente astrócitos. O ensaio de fagocitose pode potencialmente ser multiplexado com manchas de imagem de células vivas, por exemplo, mitocôndrias, cálcio ou indicadores ROS, e coloração imunofluorescente pós-fixação para proteínas de interesse pode ser realizada. Em comparação com os ensaios de fagocitose existentes que utilizam células neuronais apoptóticas, as principais vantagens que este protocolo confere é que a preparação da carga fagocítica é relativamente simples e rápida, e resulta em um produto uniforme. Outros ensaios induzem apoptose de neurônios ou SH-SY5Ys com S-nitroso-L-cisteína por 2 h25, ácido okadaico para 3 h22, staurospor para 4-16 h26,27,28,29 ou UV-irradiação para 24 h30, e pode resultar em células em diferentes estágios da apoptose. Além disso, as imagens de células vivas e leituras de imagens de alto conteúdo não foram descritas anteriormente, tanto quanto os autores sabem. A principal limitação do uso da fixação do paraformaldeído para preparar a carga fagocítica é que ela não recapitule totalmente o processo de apoptose, uma vez que a fixação impede que as células separem em corpos apoptóticos, que provavelmente serão fagocitados mais rapidamente devido ao seu tamanho menor. Não se sabe qual efeito a fixação tem sobre a secreção de sinais nucleotídeos de "me encontre" (por exemplo, ATP, UDP) da célula alvo que atraem fagocitos. Semelhante às células apoptóticas, os SH-SY5Ys fixos exibem alguma permeabilidade de membrana ao iodeto propidium. A permeabilidade da membrana está associada à liberação de sinais de "encontre-me"; no entanto, isso não foi estudado nos SH-SY5Ys fixos, e se o nucleotídeo for liberado muito rapidamente, eles serão lavados antes que os SH-SY5Ys sejam adicionados aos macrófagos iPSC.
O primeiro passo crítico no protocolo é a coloração de SH-SY5Ys mortos com um éster STP de um corante fluorescente vermelho sensível ao pH. Este corante reage rapidamente e covalentemente com aminas primárias livres na superfície dos SH-SY5Ys mortos. A duração da coloração não precisa ser otimizada; no entanto, deve-se tomar cuidado com o manuseio do corante antes da rotulagem. A reação de rotulagem não deve ser realizada em buffers contendo aminas livres. Além disso, há risco de precipitação se o estoque de DMSO for diluído em tampão aquoso frio ou em alta concentração final. Precipitados aparecerão como objetos escuros densos sob o microscópio. Além disso, a solução de corante sensível ao pH gruda em tubos regulares de centrífugas plásticas e lava lentamente; portanto, são recomendados tubos de baixa ligação para a etapa de rotulagem. O uso de um corante sensível ao pH, em vez de um corante permanentemente fluorescente, auxilia na identificação de partículas engolfadas, contra partículas que vizinhos à membrana plasmática. Uma vez que há alguma fluorescência no pH neutro, a densidade da carga fagocítica e dos macrófagos iPSC precisam ser mantidos baixos o suficiente para uma segmentação precisa, embora alto o suficiente para que numerosos eventos fagocíticos sejam capturados. A microscopia de alto teor foi capaz de identificar com precisão a fagocitose com uma densidade média de carga no poço (mais de 2 SH-SY5Ys por iPSC-macrófago). Por outro lado, devido à sensibilidade mais fraca do microscópio no espectro vermelho profundo, a segmentação de macrófagos iPSC nos dados de imagem de lapso de tempo de células vivas foi menos confiante e foi necessário usar uma densidade muito baixa de carga para reduzir a probabilidade de falsos positivos (1 SH-SY5Y para cada dois macrófagos iPSC). A validação da segmentação adequada e da densidade da carga deve ser realizada com comparações entre poços não tratados e citochalasin D tratados. Em um ensaio bem otimizado, a citochalasina D deve reduzir o número médio de manchas por célula em 90% em relação a amostras não tratadas.
Outro passo crítico no protocolo é a coloração iPSC-macrófago, que permite que a célula seja identificada e segmentada na análise de imagens para que quaisquer SH-SY5Ys externos sejam excluídos da contagem. O corante recomendado é permeante celular, convertido em um produto fluorescente insolúvel dentro do citoplasma, fixável e não tóxico (ver Tabela de Materiais). A etapa de coloração foi otimizada para o uso de macrófagos iPSC com o ensaio de fagocitose de imagem de alto teor, e sugerimos que ele deve ser retim otimizado se outros tipos de células forem usados. A duração da coloração celular pode ser aumentada para melhorar a deposição do produto fluorescente insolúvel dentro das células. Se a concentração de corante for otimizada, deve-se tomar cuidado para evitar níveis tóxicos do veículo solvente orgânico.
O terceiro fator crítico para o sucesso do ensaio é a análise dos dados. Os gasodutos de análise fornecidos destinam-se a ser de orientação e não prescritivo, pois diferenças na intensidade de coloração ou morfologia celular podem reduzir a eficácia da segmentação dos gasodutos conforme escrito. Algumas otimizações serão, portanto, necessárias, com testes do pipeline sobre controles positivos e negativos adequados, e os parâmetros que devem ser otimizados estão indicados no texto do protocolo. Os controles negativos devem incluir uma condição em que os macrófagos iPSC são pré-tratados com um potente inibidor de fagocitose, como a citochalasina D antes da adição de SH-SY5Ys. Outro possível controle negativo é a adição dos SH-SY5Ys a poços não tratados anteriormente de macrófagos iPSC no final do ensaio, 10 minutos antes da fixação, o que permite algum ajuste da carga, mas é muito curto para que ocorra uma quantidade considerável de fagocitose. Um evento de fagocitose é definido como um objeto vermelho-fluorescente dentro das bordas de um iPSC-macrophage, definido pelo algoritmo de software usando o canal de fluorescência vermelho profundo. Se a segmentação das células for ruim(Figura 2),muitas SH-SY5Ys não fagocytosed em proximidade com iPSC-macrófagos podem ser erroneamente incluídas na análise, ou seja, falsos positivos. O fator mais importante para alcançar uma boa segmentação é o delineamento rigoroso dos macrófagos iPSC. A segmentação para ambas as análises é automatizada, portanto não é possível obter uma segmentação perfeita para cada célula; no entanto, alguns parâmetros podem ser ajustados para tornar a segmentação mais ideal, usando algumas imagens de teste como referência. O controle de citochalasina D é importante para avaliar a segmentação ideal, pois um alto número de eventos fagocíticos detectados nesta condição indica que a segmentação é sub-ideal. A otimização do pipeline de análise de dados deve ser idealmente repetida até que o número de eventos fagocíticos por célula seja 80%-90% menor na condição de citochalasina D versus nenhum inibidor.
Os problemas com o ensaio de fagocitose que são mais propensos a ocorrer são: (1) fluorescência fraca sensível ao pH em controles positivos, (2) distribuição esparsa ou desigual de macrófagos no final do ensaio, ou (3) alto número de falso-positivos na análise de SH-SY5Ys não fagoctos. A solução de problemas da fluorescência fraca sensível ao pH deve primeiro verificar que a coloração dos SH-SY5Ys resultou em uma pelota celular com uma cor magenta forte. Se a cor for fraca, certifique-se de que um estoque de corante fresco seja usado, certifique-se de que o buffer de rotulagem esteja livre de amina, adicione uma lavagem extra aos SH-SY5Ys antes de colorir, verifique se o número correto de SH-SY5Ys foi manchado, certifique-se de que não há precipitações de corante e otimize a concentração de rotulagem do corante. Se os SH-SY5Ys estiverem fortemente manchados, verifique se a concentração adicionada à placa de ensaio está correta e certifique-se de que os macrófagos iPSC são saudáveis e não muito velhos. O segundo tipo de problema, a distribuição desigual do macrófago, pode resultar da perda de células durante a tubulação e devem ser tomadas medidas para reduzir as forças de tubulação experimentadas pelas células, evitando pontas estreitas. Se o problema permanecer, reduza o tempo de incubação do carregamento dos macrófagos iPSC com corante permeante celular. O terceiro problema, em relação à inclusão errônea de partículas não fagocitas na análise, indica que é necessária mais otimização do pipeline de análise. A solução de problemas deve se concentrar em primeiro lugar na segmentação celular e se o software está incluindo objetos adjacentes. Parâmetros específicos que podem ser ajustados são sugeridos nas notas abaixo das etapas relevantes (etapas 6.1.11-6.1.15 para a análise de lapso de tempo de célula viva e etapas 6.2.4-6.2.8 para a análise de alto teor de conteúdo). Se a segmentação celular não puder ser melhorada, a análise de alto teor tem um passo extra (etapa 6.2.8) que exclui macrófagos iPSC segmentados incorretamente. Além disso, o módulo que filtra pontos aceitos de fluorescência sensível ao pH dentro de macrófagos iPSC pode ser otimizado, aumentando a intensidade limiar dos objetos aceitos, o que deve ajudar a excluir sh-SY5Ys não fagocitados (etapa 6.1.17 para a análise de lapso de tempo de células vivas e passo 6.2.11 para a análise de alto teor).
Desenvolvemos dois tipos de leitura de microscopia para o ensaio de fagocitose que cada um tem vantagens e limitações. A imagem de lapso de tempo de células vivas tem o mérito de fornecer informações extras sobre cinética de fagocitose e está mais amplamente disponível do que plataformas de imagem de alto conteúdo. O software de código aberto recomendado é agnóstico para a fonte do microscópio e pode ser usado com qualquer microscópio fluorescente de boa qualidade, com ou sem capacidade de lapso de tempo de célula viva. A principal limitação da imagem de células vivas é a sensibilidade e a óptica limitadas, o que torna mais desafiador detectar e executar uma boa segmentação de macrófagos iPSC. Essa limitação pode ser atenuada, aumentando a duração da coloração iPSC-macrófago, ou mudando para um microscópio mais sensível, se disponível. O ensaio de phagocytosis de imagem de alto conteúdo é a leitura recomendada se um sistema de imagem de alto conteúdo estiver disponível. Sistemas de imagem de alto teor de conteúdo permitem maior rendimento e dados mais confiáveis, permitindo que este ensaio seja usado para triagem, no qual seria esperado um Z' robusto de ≥0,7 para a saída "número de pontos por célula"20. Em comparação com o método de lapso de tempo de células vivas, a leitura de microscopia de alto conteúdo tem maior sensibilidade, maior grau de automação e velocidade, mais poços e campos de imagem podem ser processados e imagens confocal de alta resolução são produzidas. A segmentação celular é mais eficaz com boas imagens, e a segmentação é adicionalmente auxiliada pelo software de análise de imagens de alto conteúdo, fornecendo mais métodos de segmentação celular adequados para células altamente irregulares. O software de análise de imagens de alto teor de conteúdo também calculou mais parâmetros de fagocitose, em comparação com o software de código aberto, como a porcentagem de células fagocíticas. A principal limitação do ensaio de fagocitose de alto teor é de custo e acessibilidade do sistema de imagem e software de análise.
Em conclusão, o ensaio quantitativo de fagocitose apresentado neste artigo é uma ferramenta útil para modelar a fagocitose de microglia de neurônios mortos in vitro. As microglias são modeladas por macrófagos iPSC e os neurônios mortos são modelados por SH-SY5Ys fixos em paraformaldeído. Embora não sejam os modelos de neurônios mais autênticos e mortos/apoptóticos publicados, estes são fáceis de preparar e escaláveis. O ensaio em si é altamente versátil, com dois tipos de leitura de imagem detalhados, e tem potencial para ser adaptado para uso com diferentes modelos de monocultura microglia/macrófago, ou um tipo de célula diferente para atuar como carga fagocítica. A leitura de imagens de alto teor é vantajosa para a obtenção de dados quantitativos e pode ser dimensionada para avaliar pequenos moduladores de moléculas de fagocitose, ou tela variantes genéticas nos macrófagos iPSC. No entanto, uma vez que os sistemas de imagem de alto conteúdo são caros e pesados em dados, uma leitura alternativa de imagem foi incluída no protocolo usando um microscópio de lapso de tempo de células vivas, que poderia ser substituído por qualquer microscópio convencional de fluorescência de boa qualidade, se necessário.

Microglia são macrófagos residentes em tecido cerebral, e suas funções incluem vigilância imunológica, coordenação de respostas inflamatórias a lesões/infecções, remodelação sináptica e fagocitose de células mortas, mielina, agregados de proteínas e patógenos. A fagocitose é o processo pelo qual a microglia reconhece a carga com receptores superficiais e reorganiza seu citoesqueleto para engolir o objeto em um fagosome, que então se funde com lisosomos para degradação da carga. Microglia saudável fagocytose células cerebrais apoptóticas para removê-las antes de se tornarem necrosas1. A fagocitose das células apoptóticas também é conhecida como eferocisose, e requer a exibição de um sinal de fosfatidídeserina "comer-me" pela célulamoribunda 2. Numerosos receptores de microglia se ligam diretamente à fosfatidíserina, incluindo TIM-4, BAI1, Stabilin-2 e TREM2. Receptores TAM microglial (por exemplo, MERTK) e integrinos indiretamente se ligam à fosfatidíserina, utilizando proteínas acessórias GAS6 ou MFG-E8, respectivamente. Outros sinais de "comer-me" podem ser necessários para o reconhecimento de células moribundas, estes incluem alterações na glicoseção ou carga de proteínas superficiais; expressão de proteínas intracelulares ICAM3, calreticulina, anexo-I na superfície celular; LDL oxidado; ou revestimento da célula apoptótica por complemento produzido por microglia C1q1,2.
Doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Parkinson, doença de Alzheimer, demência frontotemporal e esclerose lateral amiotrófica têm sido associadas ao comprometimento da função microglia, incluindo o acúmulo de resíduos cerebrais, como células mortas, fragmentos de mielina e agregados proteicos, e respostas inflamatórias exageradas a esses estímulos3. A fagocitose pode ser prejudicada em doenças neurodegenerativas e contribuir para a patologia, devido a uma combinação de envelhecimento, inflamação ou variantes específicas de risco genético4,5. Por outro lado, há também evidências de modelos animais de doenças neurodegenerativas de que a microglia pode inapropriadamente fagocytose neurônios viáveis ou sinapses6,7,8. É provável que o mecanismo seja instigado pela exibição fosfatidylserina de neurites danificados, que é diretamente sentido pelos receptores de fagocitose microglial TREM2 ou GPR56, ou indiretamente sentido pelo complemento solúvel C1q revestimento da membrana enriquecida com fosfartidylserina, levando à fagocitose mediada por CR39,10,11.
Ensaios in vitro da função fagocitose, por exemplo, para avaliar o impacto fenotípico de uma variante de risco genético na microglia, são frequentemente realizados utilizando cargas não fisiológicas, como contas de látex4. Bactérias fluorescentes e zimosãs também são utilizadas, que são fisiológicas, mas não relevantes para doenças neurodegenerativas. Cargas fagocíticas não fisiológicas podem ser usadas para detectar defeitos no maquinário básico do engolamento fagocítico, mas não modelam com precisão o primeiro passo de "reconhecimento" na fagocitose dos neurônios apoptóticos. O tamanho, a forma, a rigidez e o tipo de carga também ditam as vias de sinalização intracelular que são ativadas, levando a diferentes resultados do estado de ativação da microglia. Por exemplo, as bactérias E.coli são pequenas e rígidas, ao contrário das células humanas, e os lipopólises em sua superfície são reconhecidos pelo receptor Toll-like 4 (TLR4) que ativa a fagocitose e as vias de sinalização pró-inflamatórias2,12.
No contexto de estudos de doenças neurodegenerativas, uma carga fagocítica mais relevante teria exibição de fosfatidylserina em membranas plasmáticas de mamíferos, e seria idealmente humana e neuronal, para incluir sinais que a microglia provavelmente encontrará. Para este protocolo de fagocitose, a linha celular neuroblastoma humana SH-SY5Y foi escolhida como um modelo de neurônio fácil de cultivar. A exposição permanente de fosfatidylserina foi artificialmente induzida por paraformaldeído, que já foi mostrado para causar exibição de fosfatidíserina de plaquetas13. Para o modelo microglia foram utilizados macrófagos humanos iPSC-macrófagos, que imitam o perfil ontogenia e transcricional da microglia humana, e são phagocyticamente competentes14,15,16,17. os macrófagos iPSC não são o modelo de microglia mais autêntico disponível, por exemplo, eles não imitam a morfologia da microglia; no entanto, pode-se substituí-lo por um modelo iPSC de monocultura mais autêntico, se desejar, como Haenseler et al.15. Os modelos humanos de iPSC são preferíveis à microglia de roedores primários para estudar a neurodegeneração, devido a preocupações com a sobreposição limitada dos módulos transcricionais de microglia observados nos tecidos da doença neurodegenerativa humana versuscamundongos 18. Os SH-SY5Ys mortos são manchados com um corante sensível ao ácido que fluoresce fracamente no pH neutro e mais fortemente dentro dos fagolicosomos de iPSC-macrófagos após fagocitose. O uso de um corante sensível ao ácido melhora a precisão da detecção de eventos fagocíticos, com versatilidade para diferentes leituras de macrófagos vivos e fixos19. Este protocolo descreve tanto a imagem de lapso de tempo de célula viva da fagocitose, quanto um ensaio de imagem fixo de alto teor de conteúdo para fagocitose, com as mesmas etapas de preparação celular antes da leitura(Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático da metodologia. O esboço do ensaio de fagocitose, onde a preparação dos SH-SY5Ys e a coloração dos macrófagos iPSC são realizados em paralelo, e então os SH-SY5Ys são pipetados sobre os macrófagos iPSC. Ou a imagem de lapso de tempo de células vivas é realizada imediatamente, ou as células são incubadas a 37 °C/5% de CO2 para a duração necessária e fixadas antes de realizar microscopia de alto conteúdo. PFA: paraformaldeído, HBM: mídia sem fenol sem fenol, pHr: solução de corante fluorescente vermelho sensível ao pH STP Ester, PRFMM: mídia macrófago sem fenol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>For centrifugation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L, 20-200 &#181;L, 100-1000 &#181;L single-channel micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Component of Factory media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>For fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell-800 24-well plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34815</td>
			<td>Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14085</td>
			<td>Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 &#956;M, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 laminar air flow safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, set to 37&#176;C and 5 % CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image Data Storage and Analysis System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11330</td>
			<td>Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20&#176;C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320074</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for CellTracker and pHrodo dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>Live-cell time-lapse imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube CY5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4656</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4650</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube RFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 10-547F</td>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant BMP4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-3</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC0033</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant VEGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein binding 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108.132</td>
			<td>For staining SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC9501</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel 20-200 uL pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For liquid handling of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td>High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36011</td>
			<td>pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 &#956;L (12.5 &#956;g) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette filler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as &#34;Factories&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for SH-SY5Y culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealers</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676001</td>
			<td>For assay plate storage and transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, set to 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418F</td>
			<td>Component of Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-744Q</td>
			<td>Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages

Microglia orquestra respostas neuroimunes em várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Microglia limpa neurônios mortos e moribundos através do processo de eferócitose, uma forma especializada de fagocitose. A função fagocitose pode ser interrompida por fatores de risco ambientais ou genéticos que afetam a microglia. Este artigo apresenta um protocolo de microscopia in vitro rápido e simples para o estudo da equecriose microglial em um modelo de microglia (célula-tronco pluripotente) induzida, utilizando uma linha celular neuroblastoma humana (SH-SY5Y) rotulada com um corante sensível ao pH para a carga fagocítica. O procedimento resulta em um alto rendimento de células neuroblastoma mortas, que exibem fosfartidylserina superficial, reconhecida como um sinal de "comer-me" por fagocitos. O ensaio de placa de 96 poços é adequado para imagens de lapso de tempo de células vivas, ou a placa pode ser corrigida com sucesso antes de processamento adicional e quantificada por microscopia de alto conteúdo. A microscopia de alto teor de células fixas permite que o ensaio seja dimensionado para triagem de inibidores de pequenas moléculas ou avaliando a função fagocítica das linhas iPSC da variante genética. Embora este ensaio tenha sido desenvolvido para estudar fagocitose de células de neuroblastoma mortas por macrófagos iPSC, o ensaio pode ser facilmente adaptado para outras cargas relevantes para doenças neurodegenerativas, como sinapstos e mielina, e outros tipos de células fagocíticas.

A imagem de lapso de tempo de células vivas foi realizada utilizando-se o protocolo previamente delineado, com macrófagos iPSC-macrófagos do tipo selvagem semeados em 20.000 células por poço. Foram aplicadas diferentes quantidades de SH-SY5Ys (10.000-30.000 por bem como estimadas da contagem celular na etapa 3.1), e o inibidor de fagocitose cytochalasin D foi pré-incubado (1 h) com alguns poços, agindo como um controle para inibir a fagocitose para cada quantidade de SH-SY5Ys. A imagem começou 40 minutos após a adição de SH-SY5Ys e as imagens foram capturadas em intervalos de 5 minutos para as próximas 3 horas (os dados incluem o atraso inicial de 40 min). Um vídeo de lapso de tempo representativo é incluído nos Dados Suplementarese analisados dados quantitativos mostrados na Figura 3. Com a quantidade de 10.000 SH-SY5Ys por poço, o número de partículas fagocitas (manchas) por célula aumentou linearmente com o tempo, e foi inibido em aproximadamente 50% por citochalasina D. A inibição por citochalasina D foi mais fraca do que o previsto, provavelmente causada por insuficientes réplicas técnicas ou biológicas, pois apenas um poço por condição foi imageado com três campos de imagem. Com maiores quantidades de SH-SY5Ys por poço (20.000 e 30.000), a fagocitose apresentou baixa linearidade, provavelmente devido à má segmentação de macrófagos iPSC e SH-SY5Ys em um campo de visão mais lotado.
A imagem de alto teor de células fixas foi realizada utilizando-se o protocolo previamente delineado, com macrófagos iPSC-macrófagos do tipo selvagem a 20.000 células por poço, várias quantidades diferentes de SH-SY5Ys (10.000-80.000 por bem), e a placa de ensaio foi fixa e imageda após 5h. Uma imagem representativa da fagocitose é apresentada na Figura 4A, e os dados analisados mostrados na Figura 4B17. O aumento da quantidade de SH-SY5Ys resultou em um maior número de partículas fagocitas (manchas) por célula; no entanto, uma duplicação da quantidade SH-SY5Y leva apenas a um aumento de 1,5x no número de pontos por célula. Isso indica que os valores testados não são limitadores de taxa à fagocitose. Posteriormente, o ensaio de phagocytose por imagem de alto teor foi validado utilizando vários inibidores da fagocitose(Figura 4C)17. Os inibidores de polimerização de actina citochalasin D e jasplakinolide inibiram significativamente a fagocitose em 91% e 90%, respectivamente, quando pré-incubado por 1h antes da fagocitose. O robusto Z' do ensaio quando a citochalasina D ou jasplakinolide são utilizadas como controles negativos é calculada como 0,7 e 0,8, respectivamente20. O inibidor de acidificação lysososome bafilomicina A1 reduziu significativamente a fagocitose em 31%, quando incubado 1h antes da fagocitose. O efeito mais fraco do inibidor de acidificação lisososome versus inibidores de actina sugere que a detecção da carga internalizada pode não exigir acidificação total do fagosome. A anexação recombinante V foi usada como controle para bloquear especificamente a fosfatidíserina exposta na superfície dos SH-SY5Ys, impedindo que receptores fagocíticos acessem o ligante, um importante sinal de "come-me". A adição de anexação recombinante V reduziu significativamente a fagocitose em 30%, quando adicionada a poços imediatamente antes da adição sh-SY5Y. Sh-SY5Ys fixos foram confirmados para expor fosfatidylserine, usando uma sonda fluorescente anexa V, enquanto sh-SY5Ys vivos foram negativos para coloração anexa em V(Figura 4D).
O receptor de fagocitose microglial TREM2 tem sido anteriormente mostrado importante para a fagocitose dos neurônios apoptóticos21. A mutação R47H do TREM2 é um gene de risco para o início tardio da doença de Alzheimer, e é hipótese para reduzir a ligação de ligante de TREM223. Com o objetivo de avaliar a função fagocítica de R47H TREM2 e TREM2 KO, o ensaio de fagocitose de alto teor de célula fixa foi realizado utilizando linhas isogênicas iPSC-macrófagos com WT/R47H/KO TREM217. Vários comprimentos de duração da fagocitose de 1 a 5 h foram testados, utilizando-se uma adição escalonada de carga fagocítica (40.000 SH-SY5Ys). O sinal resultante aumenta linearmente para 4h, nivelando ligeiramente a 5 h(Figura 5)17. A redução da taxa de fagocitose e da capacidade (% das células positivas spot) ficou evidente no KO TREM2 em comparação com a TMC, enquanto o mutante R47H TREM2 não apresentou fagocitose alterada. O defeito fagocítico nas células KO TREM2 não é fenocópido pela mutação R47H TREM2, aparentemente porque a função TREM2 é suficiente para suportar fagocitose normal.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Figura 3: Exemplos de dados para ensaiode fagocitose de lapso de tempo de células vivas. Absorção de SH-SY5Ys mortos por macrófagos iPSC-macrófagos do tipo selvagem BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) imagens em intervalos de 5 minutos por 3 h. Os tempos exibidos no gráfico são do início da fagocitose, incluindo os primeiros 40 minutos sem medição. O número médio de pontos por célula de três poços de réplica são plotados. A fagocitose de 10.000 SH-SY5Ys é inibida com 10 μM de citochalasina D com pré-tratamento de 1 h, enquanto maiores quantidades de SH-SY5Ys (20.000 e 30.000) têm quantificação subotimal de fagocitose. Desvio padrão ± médio (SD), N = 1 experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Figura 4: Otimização e validação de ensaio de fagocitose de alto teor de células fixas. (A) Imagem representativa de microscopia de alto teor de alto conteúdo da SH-SY5Ys phagocytos por iPSC-macrófagos do tipo selvagem BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Um ponto de tempo de 3h com 40.000 SH-SY5Ys é mostrado. Os canais de fluorescência são mesclados, com a mancha iPSC-macrófago mostrada como vermelho, núcleos como azul e SH-SY5Ys como amarelo. O painel de entrada é uma seção da imagem ampliada 3x. (B) O número de pontos por célula de SH-SY5Ys mortos phagocytos após 5h, usando diferentes quantidades de adição de carga para macrófagos do tipo selvagem iPSC. Erro padrão ± médio (SEM), para N = 3 colheitas. (C) A fagocitose (3 h) é inibida com 10 μM cytochalasin D (Cyt), 1 μM bafilomycin A1 (Baf), 1 μM jasplakinolide (com 1 h pré-tratamento; Jas), e 13 μg/mL anexo recombinante V (adicionado simultaneamente aos SH-SY5Ys mortos; Ann). os macrófagos iPSC sem sh-SY5Ys adicionados foram usados como um controle negativo (-ve), e o controle positivo (+ve) é iPSC-macrófagos não tratados com SH-SY5Ys adicionados. Os dados foram normalizados para a média para a repetição do experimento. Significa ± SEM, para N = 3-6 colheitas e com duas linhas celulares de tipo selvagem (SFC840-03-03, a caracterização desta linha é descrita em (Fernandes et al.21 e BIONi010-C). ANOVA de 1 via com o teste pós-hoc de Dunnett, comparações com células não tratadas. *p < 0,05, ***p < 0,001. (D) Mancha sh-SY5Ys recém-fixada uniformemente para exibição de fosfatidylserina (anexo V-FITC) e tem permeabilidade celular limitada (iodeto de propídio). Sh-SY5Ys vivos não mancham para anexar V-FITC ou iodeto de propídio, exceto para coloração focal presente nas poucas células mortas na cultura. Os números são reproduzidos com permissão da Alzheimer's Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Figura 5: A fagocitose é reduzida em KO TREM2, mas não em R47H TREM2 iPSC-macrófagos. Ensaio de fagocitose de alto teor realizado com 40.000 SH-SY5Ys por poço com adições escalonadas. Os meios foram quantificados para os parâmetros: número de manchas por célula, soma de áreas spot (μm2) por célula e percentual de células contendo partículas fagocitas por campo. Os dados foram normalizados para significar para cada genótipo por experimento. Média ± SEM, para N = 3 colheitas. ANOVA de duas formas repetidas, teste pós-hoc de Dunnett, comparações em pares com o WT para cada vez: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Os números são reproduzidos com permissão da Alzheimer's Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar S1: Exemplo QC para preparação sh-SY5Ys. Os SH-SY5Ys dissociados foram fixados por 10 minutos com 0% (células vivas), 1% e 2% de paraformaldeído (PFA), depois lavados. As células foram manchadas com anexo V-FITC e iodeto de propidium (PI) e imediatamente medidas por citometria de fluxo. As parcelas de pontos de densidade de cores foram criadas no software de análise de citometria de fluxo, usando os controles de uma única mancha e sem manutenção para colocar um portão do quadrante. Os quadrantes são anotados com a porcentagem de eventos dentro desse quadrante. As células vivas estão principalmente no 4º trimestre, e as células fixas estão principalmente no 2º trimestre. Q1 = anexo V-/PI-, Q2 = anexo V+/PI+, Q3 = anexo V+/PI-, Q4 = anexo V-/PI- (células vivas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Vídeo suplementar: Fagocitose de lapso de tempo de célula viva. Vídeo de lapso de tempo representativo de SH-SY5Ys phagocytos por iPSC-macrófagos do tipo selvagem BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). As imagens foram tiradas a cada 5 minutos por 3 h. O vídeo é cortado e roda a 3 quadros por segundo, mostrando as últimas 1,5 h do ensaio. Os SH-SY5Ys manchados de corante sensíveis ao ácido são mostrados em vermelho, intensidade de sinal aumentando com acidificação fagosome. Núcleos celulares manchados com Hoechst 33342 são mostrados em azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

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In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Doenças neurodegenerativas estão associadas a funções de microglia disreguladas. Este artigo descreve um ensaio in vitro de fagocitose de células neuroblastoma por macrófagos iPSC. As leituras quantitativas de microscopia são descritas tanto para imagens de lapso de tempo de células vivas quanto para imagens de alto conteúdo de células fixas.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Este ensaio de imagem in vitro permite quantificar o efeito de diferentes tratamentos celulares ou genótipos diferentes sobre a fagocitose microglial. Usando dois tipos de células relevantes para doenças neurodegenerativas, usamos células de neuroblastoma mortas para a carga fagocítica, que são preparadas de uma forma que pode ser facilmente e baratamente dimensionada por grandes telas de imagem de alto conteúdo. Em um gabinete de segurança biológica classe 2, dissociar SH-SY5Ys aspirando o meio.Adicione 4 ml de tampão de dissociação celular e remova o buffer imediatamente para que menos de 1 ml permaneça como uma película fina que reveste as células. Incubar por 2 a 3 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, a 10 ml de HBSS para o frasco T-75.E pipeta o SH-SY5Ys em um tubo de centrífuga cônica de 15 ml. Centrifugar a 400xG por 5 minutos. Aspire o supernascimento e suspenda as células em 2 ml de mídia tamponada hepes sem fenol, certificando-se de quebrar aglomerados antes da fixação.Fixar as células adicionando 2 ml de formaldeído de 4% de potência ao tubo e incubando por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação suave ocasional. Adicione 10 ml de HBSS ao tubo. Em seguida, centrífuga a 1200xG por 7 minutos.Aspire o supernasciente, e suspenda a pelota celular em 2 ml de mídia tamponada hepes sem fenol. Conte e remova 1 milhão de células HS-SY5Y em um tubo de baixa ligação de proteínas de 2 ml. Leve o volume total para 300 a 500 microliters com mídia tamponada HEPES sem fenol.Em seguida, aqueça brevemente o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius. Reconstitua o éster stp de corante vermelho sensível ao pH de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione 12,5 microgramas de corante por milhão de células SH-SY5Y.Misture suavemente apertando o tubo. E incubar o tubo em temperatura ambiente por 30 minutos, protegido da luz. Adicione 1 ml de HBSS e centrífuga a 1200xG por 7 minutos e 4 graus Celsius.Descarte o supernatante. E lave com 2 ml de HBSS. Suspenda a pelota celular na mídia de macrófago livre de fenol para uma concentração de 0,2 a 1,2 milhões de células por ml, de modo que 50 microlitres contêm de 10.000 a 60.000 células.Em um gabinete de segurança biológica, prepare uma solução de células fluorescentes vermelhas profundas com corante éster-reativo em meios de macrofago. Adicione Hoechst 33342, e aqueça a solução de trabalho a 37 graus Celsius em um banho de água. Aspire o meio macrófago iPSC suavemente, tubondo a célula supernante com uma pipeta multicanal em um reservatório estéril.Adicione 70 microliters por poço da solução de corante aos macrófagos iPSC usando uma pipeta multicanal. Incubar por 1 hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Reparar tratamentos experimentais em mídia de macrófago sem fenol.Após a incubação, aspire o meio macrófago iPSC muito suavemente com uma pipeta multicanal, e adicione 100 microliters de HBSS por poço. Remova imediatamente o HBSS por tubulação suave. Em seguida, adicione 100 microliters de mídia de macrófago sem fenol, além de tratamentos experimentais em poços separados.Incubar por 10 minutos a 1 hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters dos SH-SY5Ys rotulados por poço dos lados de cada poço na borda do líquido. Em seguida, incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 3 a 5 horas.Após a incubação da fagocitose, aspira suavemente os supernantes celulares por pipetar com uma pipeta multicanal e descartar. Lave uma vez com 100 microliters de PBS. Em seguida, fixar as células adicionando 100 microliters de 2% de energia formaldeído e incubando por 15 minutos à temperatura ambiente.Aspirar poços e adicionar 100 microliters de PBS. Ou proceda diretamente à imagem com o microscópio de alto teor, ou cubra com selador de placa e papel alumínio, e armazene a placa a 4 graus Celsius, até que seja necessário. Ligue o microscópio de imagem de alto conteúdo e abra o software de captura de imagens.Carregue a placa de ensaio no microscópio clicando no ícone LOAD na parte superior da tela. Selecione a guia CONFIGURAÇÃO". Nos menus suspensos na caixa superior esquerda, selecione o tipo de placa apropriada.A opção de foco automático:dois pico "O objetivo:40x Água, na forma DE 1.1"Confocal" e Binning de 1. Lave o objetivo de 40x Água antes de usar através do menu de configurações. Na caixa de seleção do canal, use o ícone plus para adicionar os canais DAPI, Alexa 647 e Alexa 568.Defina isso para medir em um único plano de um micrômetro. Otimize o tempo e as configurações de potência para a eficiência de coloração da placa de ensaio. Certifique-se de que os canais não são medidos simultaneamente, clicando na sequência do canal para separar os canais.Em navegação e definir layout, selecione os poços de medição e selecione de 9 a 12 campos por poço. Durante a configuração, clique em um campo representativo no mapa da placa. E verifique cada canal de medição, por sua vez, para garantir que a mancha esteja presente, e que as imagens estejam focadas ajustando o deslocamento do canal.Para carregar os dados em um servidor para análise remota, clique na caixa de trabalhos online e no nome de tela relevante. Salve o protocolo de ensaio clicando no botão salvar"e clique na guia executar experimento"na parte superior. Nomeie a placa de experimento, em seguida, clique em iniciar "Um tempo de célula ao vivo vive phagocytosis ensaio mostrou que com 10, 000 SH-SY5Ys por poço, o número de partículas de fagocitose por célula aumentou linearmente com o tempo e foi inibido em aproximadamente 50% por Cytochalasin D.Com maiores quantidades de SH-SY5Ys por poço, a fagocitose apresentou baixa linearidade, provavelmente devido à má segmentação do iPSC, macrófagos, e SH-SY5Ys em um campo de visão mais lotado.Os seguintes resultados foram obtidos por meio da realização de uma imagem de alto teor de célula fixa, incluindo esta imagem representativa da fagocitose. O aumento da quantidade de SH-SY5Ys resultou em um maior número de partículas fagocitas por célula. O ensaio de fagocitose foi validado utilizando vários inibidores da fagocitose.Cytochalasin D e Jasplakinolide inibiram significativamente a fagocitose em 91 e 90%, respectivamente. E a Bafilomicina A1 reduziu significativamente a fagocitose em 31%, quando pré-incubada por 1 hora antes da fagocitose. A adição de anexo recombinante 5 reduziu significativamente a fagocitose em 30% quando adicionada aos poços imediatamente antes da adição sh-SY5Y.Sh-SY5Ys fixos estamos confirmados para expor Phosphatidylserine usando uma sonda fluorescente Annexin 5. Considerando que os SH-SY5Ys vivos foram negativos para a coloração de Anexo 5. Vários comprimentos de duração da fagocitose, de 1 a 5 horas, foram testados utilizando-se adição escalonada de carga fagocítica.O comprimento total deste protocall pode ser encurtado preparando a carga fagítica e manchando os macrófagos iPSC em paralelo. Se você quiser fazer isso, trabalhe os tempos com antecedência e use suas incubações para preparar soluções para os próximos passos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Neurociência

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Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

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TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

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In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

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Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

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In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

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Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Desenvolvimento de ensaio para quantificação de conteúdo elevado de Sod1 proteína mutante formação agregada em células vivas

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A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

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Um romance imagens Live In Vitro e fagocitose mediada por ensaio de Astrocyte usando pH sinaptossomas conjugada com indicador

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In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

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In Vitro Ensaio para estudar a agregação da proteína Tau e rastreio de drogas

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