Name: in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

Авторы благодарят доктора Вэла Миллара и доктора Сохаиба Низами за их помощь в микроскопии с высоким содержанием, а также доктора Даниэля Эбнера за доступ к микроскопам с высоким содержанием. Кроме того, авторы благодарят доктора Эмму Мид за советы по разработке анализа и миссис Кэти Браун за поддержку iPSC. Эта работа была поддержана Оксфордским институтом поиска лекарств (ARUK ODDI, ссылка на грант ARUK-2020DDI-OX) при дополнительной поддержке Центра стволовых клеток Джеймса Мартина в Оксфорде (S.A.C.) из Оксфордской школы Мартина LC0910-004; Премия Monument Trust Discovery Award от Паркинсона Великобритании (J-1403); MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 и Momentum MC_PC_16034 Awards.

<ol>
	<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li><li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+in+the+brain:+Homeostasis+and+disease.">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).</li><li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer's+disease:+potential+therapeutic+targets.">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li><li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+live+neurons.">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li><li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia.">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding.">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).</li><li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila.">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li><li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2.">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).</li><li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets.">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li><li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages.">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li><li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Alzheimer's+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout,+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages.">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12, 151 (2020).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer's+disease+not+evident+in+mouse+models.">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li><li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+robust+Z'+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons.">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).</li><li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+&#945;-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson's+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons.">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular &#945;-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li><li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2.">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li><li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease.">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Witting, A., M&#252;ller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia/brain+macrophages+in+vitro:+Involvement+of+lectin-,+integrin-,+and+phosphatidylserine-mediated+recognition.">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li><li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia.">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li><li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease.">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).</li><li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome.">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li><li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells.">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li><li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis.">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Микроглия является макрофагами- резидентами ткани мозга, и их функции включают иммунный надзор, координацию воспалительных реакций на травму / инфекцию, синаптическое ремоделирование и фагоцитоз мертвых клеток, миелина, белковых агрегатов и патогенов. Фагоцитоз — это процесс, с помощью которого микроглия распознает груз с поверхностными рецепторами и реорганизует их цитоскелет, чтобы поглотить объект в фагосому, которая затем сливается с лизосомами для деградации груза. Здоровая микроглия фагоцитозы апоптотических клеток мозга удаляет их до того, как они станут некротическими1. Фагоцитоз апоптотических клеток также известен как эффероцитоз и требует отображения сигнала фосфатидилсерина «съесть меня» умирающей клеткой2. Многочисленные рецепторы микроглии напрямую связываются с фосфатидилсерином, включая TIM-4, BAI1, Stabilin-2 и TREM2. Микроглиальные TAM-рецепторы (например, MERTK) и интегрины косвенно связываются с фосфатидилсерином, используя вспомогательные белки GAS6 или MFG-E8 соответственно. Другие сигналы «съесть меня» могут быть необходимы для распознавания умирающих клеток, к ним относятся изменения гликозилирования или заряда поверхностных белков; экспрессия внутриклеточных белков ICAM3, калретикулина, аннексина-I на поверхности клетки; окисленные ЛПНП; или покрытие апоптотической клетки микроглией, продуцируемым комплементом C1q1,2.
Нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, лобно-височную деменцию и боковой амиотрофический склероз, были связаны с нарушением функции микроглии, включая накопление продуктов жизнедеятельности мозга, таких как мертвые клетки, фрагменты миелина и белковые агрегаты, и преувеличенные воспалительные реакции на эти стимулы3. Фагоцитоз может быть нарушен при нейродегенеративных заболеваниях и способствовать патологии, обусловленной сочетанием старения, воспаления или специфических вариантов генетического риска4,5. С другой стороны, есть также данные из животных моделей нейродегенеративных заболеваний, что микроглия может ненадлежащим образом фагоцитозировать жизнеспособные нейроны или синапсы6,7,8. Механизм, вероятно, будет спровоцирован фосфатидилсериновой дисплеем поврежденных нейритов, который непосредственно ощущается рецепторами фагоцитоза микроглии TREM2 или GPR56 или косвенно ощущается растворимым комплементом C1q, покрывающий обогащенную фосфатидилсерином мембрану, что приводит к CR3-опосредованный фагоцитоз9,10,11.
In vitro анализы функции фагоцитоза, например, для оценки фенотипического воздействия варианта генетического риска в микроглии, часто выполняются с использованием нефизиологических грузов, таких как латексные шарики4. Также используются флуоресцентно меченые бактерии и зимозан, которые являются физиологическими, но не имеют отношения к нейродегенеративным заболеваниям. Нефизиологические фагоцитарные грузы могут быть использованы для обнаружения дефектов в основном механизме фагоцитарного поглощения, но не могут точно смоделировать первый шаг «распознавания» в фагоцитозе апоптотических нейронов. Размер, форма, жесткость и тип груза также диктуют внутриклеточные сигнальные пути, которые активируются, что приводит к различным результатам состояния активации микроглии. Например, бактерии E.coli маленькие и жесткие, в отличие от клеток человека, а липополисахариды на их поверхности распознаются Toll-подобным рецептором 4 (TLR4), который активирует фагоцитоз и провоспалительные сигнальные пути2,12.
В контексте исследований нейродегенеративных заболеваний более релевантный фагоцитарный груз будет иметь фосфатидилсерин на плазматических мембранах млекопитающих и в идеале будет человеческим и нейронным, включая сигналы, с которыми может столкнуться микроглия. Для этого протокола фагоцитоза клеточная линия нейробластомы человека SH-SY5Y была выбрана в качестве модели нейрона, которую легко культивировать. Постоянный поверхностный дисплей фосфатидилсерина был искусственно индуцирован параформальдегидом, который, как было ранее показано, вызывает фосфатидилсериновый дисплей тромбоцитов13. Для модели клеток микроглии человека использовались iPSC-макрофаги, которые имитируют онтогенез и транскрипционный профиль микроглии человека и являются фагоцитически компетентными14,15,16,17. iPSC-макрофаги не являются самой аутентичной моделью микроглии, например, они не имитируют морфологию микроглии; однако при желании его можно заменить более аутентичной монокультурной iPSC-моделью микроглии, такой как Haenseler et al.15. Модели iPSC человека предпочтительнее первичных микроглий грызунов для изучения нейродегенерации из-за опасений по поводу ограниченного перекрытия транскрипционных модулей микроглии, наблюдаемых в тканях нейродегенеративных заболеваний человека имыши18. Мертвые SH-SY5Y окрашиваются кислотно-чувствительным красителем, который слабо флуоресцирует при нейтральном рН и сильнее внутри фаголизосом iPSC-макрофагов после фагоцитоза. Использование кислоточувствительного красителя повышает точность обнаружения фагоцитарных событий, с универсальностью для различных считывания живых и фиксированных макрофагов19. Этот протокол описывает как покадровую визуализацию фагоцитоза живыми клетками, так и фиксированный анализ изображений с высоким содержанием для фагоцитоза с теми же этапами подготовки клеток до считывания(рисунок 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Рисунок 1:Принципиальная схема методологии. Контур анализа фагоцитоза, где параллельно проводится подготовка SH-SY5Ys и окрашивание iPSC-макрофагов, а затем SH-SY5Ys пипетируются на iPSC-макрофаги. Либо покадровая визуализация живых клеток выполняется немедленно, либо клетки инкубируют при 37 °C / 5% CO2 в течение требуемой продолжительности и фиксируют перед выполнением микроскопии с высоким содержанием. PFA: параформальдегид, HBM: фенольные красные буферизованные среды HEPES, pHr: pH-чувствительный красный флуоресцентный раствор красителя STP Ester, PRFMM: фенольные среды макрофагов без красного цвета. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>For centrifugation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L, 20-200 &#181;L, 100-1000 &#181;L single-channel micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Component of Factory media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>For fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell-800 24-well plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34815</td>
			<td>Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14085</td>
			<td>Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 &#956;M, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 laminar air flow safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, set to 37&#176;C and 5 % CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image Data Storage and Analysis System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11330</td>
			<td>Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20&#176;C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320074</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for CellTracker and pHrodo dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>Live-cell time-lapse imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube CY5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4656</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4650</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube RFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 10-547F</td>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant BMP4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-3</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC0033</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant VEGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein binding 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108.132</td>
			<td>For staining SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC9501</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel 20-200 uL pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For liquid handling of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td>High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36011</td>
			<td>pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 &#956;L (12.5 &#956;g) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette filler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as &#34;Factories&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for SH-SY5Y culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealers</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676001</td>
			<td>For assay plate storage and transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, set to 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418F</td>
			<td>Component of Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-744Q</td>
			<td>Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages

Микроглия организует нейроиммунные реакции при нескольких нейродегенеративных заболеваниях, включая болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. Микроглия очищает мертвые и умирающие нейроны через процесс эффероцитоза, специализированной формы фагоцитоза. Функция фагоцитоза может быть нарушена экологическими или генетическими факторами риска, которые влияют на микроглию. В данной работе представлен быстрый и простой протокол микроскопии in vitro для изучения эффероцитоза микроглии в модели микроглии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) с использованием клеточной линии нейробластомы человека (SH-SY5Y), помеченной pH-чувствительным красителем для фагоцитарного груза. Процедура приводит к высокому выходу мертвых клеток нейробластомы, которые отображают поверхностный фосфатидилсерин, распознаваемый фагоцитами как сигнал «съесть меня». 96-скважинный пластинчатый анализ подходит для покадровой визуализации живых клеток, или пластина может быть успешно зафиксирована перед дальнейшей обработкой и количественно определена с помощью микроскопии с высоким содержанием. Микроскопия с высоким содержанием фиксированных клеток позволяет масштабировать анализ для скрининга ингибиторов малых молекул или оценки фагоцитарной функции генетических вариантов линий iPSC. Хотя этот анализ был разработан для изучения фагоцитоза целых мертвых клеток нейробластомы iPSC-макрофагами, анализ может быть легко адаптирован для других грузов, имеющих отношение к нейродегенеративным заболеваниям, таких как синаптосомы и миелин, а также другие типы фагоцитарных клеток.

Покадровая визуализация живых клеток была выполнена с использованием ранее описанного протокола, с iPSC-макрофагами дикого типа, посеянными на 20 000 клеток на скважину. Применяли различные количества SH-SY5Ys (10 000-30 000 на скважину, по оценкам по количеству клеток на этапе 3.1), и ингибитор фагоцитоза цитохалазин D был предварительно инкубирован (1 ч) с некоторыми скважинами, действуя как контроль для ингибирования фагоцитоза для каждого количества SH-SY5Ys. Визуализация началась через 40 минут после добавления SH-SY5Ys, и изображения были сделаны с интервалом в 5 минут в течение следующих 3 ч (данные включают начальную задержку 40 минут). Репрезентативное покадровое видео включено в Дополнительные данные,а проанализированные количественные данные показаны на рисунке 3. При количестве 10 000 SH-SY5Ys на скважину количество фагоцитированных частиц (пятен) на клетку увеличивалось линейно со временем и ингибировалось примерно на 50% цитохалазином D. Ингибирование цитохалазином D было слабее, чем ожидалось, скорее всего, вызвано недостаточными техническими или биологическими репликациями, поскольку только одна скважина на состояние была изображена с тремя полями изображения. При более высоких количествах SH-SY5Ys на скважину (20 000 и 30 000) фагоцитоз проявлял плохую линейность, вероятно, из-за плохой сегментации iPSC-макрофагов и SH-SY5Ys в более переполненном поле зрения.
Визуализация с высоким содержанием фиксированных клеток была выполнена с использованием ранее описанного протокола, с iPSC-макрофагами дикого типа при 20 000 клеток на скважину, несколькими различными количествами SH-SY5Ys (10 000-80 000 на скважину), и анализная пластина была зафиксирована и визуалирована через 5 ч. Репрезентативное изображение фагоцитоза представлено на фиг.4А,а проанализированные данные показаны на фиг.4В17. Увеличение количества SH-SY5Ys приводило к увеличению количества фагоцитированных частиц (пятен) на клетку; однако удвоение количества SH-SY5Y приводит только к увеличению числа пятен на ячейку в 1,5 раза. Это указывает на то, что тестируемые количества не ограничивают скорость фагоцитоза. Впоследствии высокосоставленный визуализационный анализ фагоцитоза был подтвержден с использованием нескольких ингибиторов фагоцитоза(Рисунок 4C)17. Ингибиторы полимеризации актина цитохалазин D и джасплакинолид достоверно ингибировали фагоцитоз на 91% и 90% соответственно при предварительной инкубации в течение 1 ч до фагоцитоза. Надежный Z' анализа, когда цитохалазин D или джасплакинолид используются в качестве отрицательных контрольных элементов, рассчитывается как 0,7 и 0,8 соответственно20. Ингибитор подкисления лизосом бафиломицинА А1 достоверно уменьшал фагоцитоз на 31%, при инкубации за 1 ч до фагоцитоза. Более слабый эффект ингибитора подкисления лизосом по сравнению с ингибиторами актина предполагает, что обнаружение интернализованного груза может не требовать полного подкисления фагосомы. Рекомбинантный аннексин V использовался в качестве контроля для специфический блокирования фосфатидилсерина, подвергающегося воздействию на поверхность SH-SY5Ys, предотвращая доступ фагоцитарных рецепторов к лиганду, важному сигналу «съесть меня». Добавление рекомбинантного аннексина V значительно уменьшало фагоцитоз на 30%, при добавлении в колодцы непосредственно перед добавлением SH-SY5Y. Было подтверждено, что фиксированные SH-SY5Y подвергают воздействию фосфатидилсерина с использованием флуоресцентного зонда присоединения V, тогда как живые SH-SY5Y были отрицательными для окрашивания аннексина V(рисунок 4D).
Ранее было показано, что рецептор фагоцитоза микроглии TREM2 важен для фагоцитоза апоптотических нейронов21. Мутация R47H TREM2 является геном риска позднего начала болезни Альцгеймера и, как предполагается, уменьшает связывание лигандов TREM223. С целью оценки фагоцитарной функции R47H TREM2 и TREM2 KO проводили анализ высококонтактного фагоцитоза с фиксированными клетками с использованием изогенных линий iPSC-макрофагов с WT/R47H/KO TREM217. Было протестировано несколько длин фагоцитоза продолжительностью от 1 до 5 ч с использованием поэтапного добавления фагоцитарного груза (40 000 SH-SY5Ys). Полученный сигнал линейно увеличивается до 4 ч, слегка выравниваясь через 5 ч(рисунок 5)17. Снижение скорости и емкости фагоцитоза (% пятноположительных клеток) было очевидно при TREM2 KO по сравнению с WT, тогда как мутант R47H TREM2 не показал измененного фагоцитоза. Фагоцитарный дефект в клетках TREM2 KO не является фенокопируемым мутацией R47H TREM2, по-видимому, потому, что функция TREM2 достаточна для поддержки нормального фагоцитоза.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Рисунок 3:Пример данных для анализа фагоцитоза с временными клетками. Поглощение мертвого SH-SY5Ys дикими iPSC-макрофагами BIONi010-C (ECACC ID: 66540023), сфотографируемым с интервалом 5 мин в течение 3 ч. Время, показанное на графике, от начала фагоцитоза, включая первые 40 минут без измерения. По графику построена средняя площадь пятен на ячейку из трех реплицированных скважин. Фагоцитоз 10 000 SH-SY5Ys ингибируется 10 мкМ цитохалазина D за 1 ч до лечения, тогда как более высокие количества SH-SY5Ys (20 000 и 30 000) имеют субоптимальную количественную оценку фагоцитоза. Среднее ± стандартного отклонения (SD), N = 1 эксперимент. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Рисунок 4:Оптимизация и валидация анализа фагоцитоза с высоким содержанием фиксированных клеток. (A) Репрезентативное микроскопическое изображение с высоким содержанием фагоцитоза SH-SY5Ys, сфагозированного iPSC-макрофагами дикого типа BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Показана 3-часовая точка времени с 40 000 SH-SY5Ys. Флуоресцентные каналы сливаются, при этом окрашивание iPSC-макрофагов показано красным цветом, ядра — синим, а SH-SY5Ys — желтым. Врезная панель представляет собой участок изображения увеличен в 3 раза. (B) Количество пятен на клетку фагоцитированных мертвых SH-SY5Ys через 5 ч, с использованием различных количеств добавок груза к диким типам iPSC-макрофагов. Среднее ± стандартной погрешности среднего значения (SEM), для N = 3 урожая. (C)Фагоцитоз (3 ч) ингибируется 10 мкМ цитохалазина D (Cyt), 1 мкМ бафиломицина A1 (Baf), 1 мкМ джасплакинолида (с 1 ч предварительной обработкой; Jas) и 13 мкг/мл рекомбинантного аннексина V (добавляют одновременно к мертвому SH-SY5Ys; Анна). iPSC-макрофаги без добавления SH-SY5Ys использовались в качестве отрицательного контроля (-ve), а положительный (+ve) контроль представляет собой необработанные iPSC-макрофаги с добавлением SH-SY5Ys. Данные нормализовали до среднего значения для повторения эксперимента. Означает ± SEM, для N = 3-6 урожаев и с двумя клеточными линиями дикого типа (SFC840-03-03, характеристика этой линии описана в (Fernandes et al.21 и BIONi010-C). 1-way ANOVA с пост-специальным тестом Даннетта, сравнения с необработанными клетками. *p < 0,05, ***p < 0,001. (D)Свежефиксированное окрашивание SH-SY5Ys равномерно для дисплея фосфатидилсерина (приложение V-FITC) и ограниченное проницаемость клеток (йодид пропидия). Живые SH-SY5Ys не окрашиваются для аннексина V-FITC или йодида пропидия, за исключением очагового окрашивания, присутствующего на нескольких мертвых клетках в культуре. Цифры воспроизводятся с разрешения Alzheimer's Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Рисунок 5:Фагоцитоз снижается в TREM2 KO, но не в R47H TREM2 iPSC-макрофагах. Анализ фагоцитоза с высоким содержанием проводится с 40 000 SH-SY5Ys на скважину с поэтапными добавками. Средние были количественно определены для параметров: количество пятен на клетку, сумма площадей пятен (мкм2)на клетку и процент клеток, содержащих фагоцитированные частицы на поле. Данные были нормализованы для обозначения каждого генотипа в эксперименте. Среднее ± SEM, для N = 3 урожая. Повторные измерения 2-стороннего ANOVA, пост-хок теста Даннетта, парные сравнения с WT для каждого раза: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Цифры воспроизводятся с разрешения Alzheimer's Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный рисунок S1: Пример контроля качества для приготовления SH-SY5Ys. Диссоциированные SH-SY5Ys фиксировали в течение 10 мин с 0% (живые клетки), 1% и 2% параформальдегида (PFA), затем промывали. Клетки окрашивали аннексином V-FITC и йодидом пропидия (PI) и немедленно измеряли проточной цитометрией. Точечные графики цветовой плотности были созданы в программном обеспечении для анализа проточной цитометрии с использованием одноокрашенных и незапятнанных элементов управления для размещения квадрантных ворот. Квадранты аннотируются процентом событий в этом квадранте. Живые клетки находятся в основном в Q4, а фиксированные клетки в основном в Q2. Q1 = приложение V-/PI-, Q2 = приложение V+/PI+, Q3 = приложение V+/PI-, Q4 = приложение V-/PI- (живые ячейки). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительное видео: Фагоцитоз живых клеток замедленной съемки. Репрезентативное покадровое видео фагоцитозов SH-SY5Ys дикими iPSC-макрофагами BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Снимки делались каждые 5 мин в течение 3 ч. Видео обрезается и выполняется со скоростью 3 кадра в секунду, показывая последние 1,5 ч анализа. Чувствительные к кислоте красители SH-SY5Y показаны красным цветом, интенсивность сигнала увеличивается с подкислением фагосом. Клеточные ядра, окрашенные Hoechst 33342, показаны синим цветом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Нейродегенеративные заболевания связаны с дисрегулируемыми функциями микроглии. В данной статье описан анализ in vitro фагоцитоза клеток нейробластомы iPSC-макрофагами. Количественные показания микроскопии описаны как для покадровой визуализации живых клеток, так и для визуализации с высоким содержанием в фиксированных клетках.

Количественный анализ визуализации in vitro для фагоцитоза мертвых клеток нейробластомы iPSC-макрофагами

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Этот анализ визуализации in vitro позволяет количественно оценить влияние различных клеточных методов лечения или различных генотипов на фагоцитоз микроглии. Используя два типа клеток, которые имеют отношение к нейродегенеративным заболеваниям, мы используем мертвые клетки нейробластомы для фагоцитарного груза, которые готовятся таким образом, что их можно легко и дешево масштабировать с помощью больших экранов изображений с высоким содержанием. В шкафу биологической безопасности класса 2 диссоциируют SH-SY5Ys путем аспирации среды.Добавьте 4 мл буфера диссоциации клеток и немедленно удалите буфер так, чтобы менее 1 мл оставалось в виде тонкой пленки, покрывающих клетки. Инкубировать в течение 2-3 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Затем по 10 мл HBSS в колбу Т-75.И пипетка SH-SY5Ys в коническую центрифужную трубку 15 мл. Центрифуга при 400xG в течение 5 минут. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливайте клетки в 2 мл фенольной буферной среды HEPES без красного цвета, обязательно разбивая сгустки перед фиксацией.Зафиксируйте клетки, добавив в трубку 2 мл формальдегида 4% мощности и инкубируя в течение 10 минут при комнатной температуре с периодическим мягким перемешиванием. Добавьте в туб 10 мл HBSS. Затем центрифугировать при 1200xG в течение 7 минут.Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу в 2 мл фенольного красного цвета hePES буферной среды. Подсчитайте и удалите 1 миллион клеток HS-SY5Y в трубку с низким содержанием белка 2 мл. Доведите общий объем до 300-500 микролитров с помощью фенольных буферизованных сред HEPES без красного цвета.Затем ненадолго нагрейте трубку на водяной бане 37 градусов цельсия. Восстановлен pH-чувствительный красный флуоресцентный краситель STP эфир в соответствии с инструкциями производителя. Затем добавьте 12,5 мкг красителя на миллион sh-SY5Y клеток.Осторожно перемешайте, щелкнув тюбик. И высиживают трубку при комнатной температуре в течение 30 минут, защищенные от света. Добавьте 1 мл HBSS и центрифугу при 1200xG в течение 7 минут и 4 градусов Цельсия.Выбросьте супернатант. И промыть 2 мл HBSS. Повторно суспендировать клеточную гранулу в фенольных средах макрофагов без красного цвета до концентрации от 0,2 до 1,2 миллиона клеток на мл, так что 50 микролитров содержат от 10 000 до 60 000 клеток.В шкафу биологической безопасности готовят раствор темно-красного флуоресцентного клеточного проницаемого сукцинимидилового эфиро-реакционноспособного красителя в макрофаговой среде. Добавьте Hoechst 33342, и разогрейте рабочий раствор до 37 градусов Цельсия на водяной бане. Аспирировать среду макрофагов iPSC осторожно, пипетируя клеточный супернатант многоканальной пипеткой в стерильный резервуар.Добавьте 70 микролитров на лунку раствора красителя к макрофагам iPSC с помощью многоканальной пипетки. Инкубировать в течение 1 часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Восстановительные экспериментальные методы лечения в фенольных средах макрофагов без красного цвета.После инкубации очень аккуратно аспирировать среду iPSC макрофагов многоканальной пипеткой и добавить 100 микролитров HBSS на лунку. Немедленно удалите HBSS путем мягкой пипетки. Затем добавьте 100 микролитров фенольных сред макрофагов без красного цвета, а также экспериментальные обработки в отдельных лунках.Инкубировать в течение 10 минут до 1 часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 50 микролитров меченого SH-SY5Ys на лунку со сторон каждой скважины на краю жидкости. Затем инкубируют при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 3-5 часов.После инкубации фагоцитоза осторожно аспирируют клеточные супернатанты путем пипетки многоканальной пипеткой и выбрасывают. Мойте один раз 100 микролитрами PBS. Затем зафиксируйте клетки, добавив 100 микролитров формальдегида 2% мощности и инкубируя в течение 15 минут при комнатной температуре.Аспирировать лунки и добавить 100 микролитров PBS. Либо приступайте непосредственно к визуализации с помощью микроскопа с высоким содержанием, либо накройте пластинчатым герметиком и фольгой и храните пластину при 4 градусах Цельсия, пока это не потребуется. Включите микроскоп с высоким содержанием изображений и откройте программное обеспечение для захвата изображений.Загрузите пробирную пластину в микроскоп, нажав на значок LOAD в верхней части экрана. Выберите вкладку SETUP". В раскрывающихся меню в левом верхнем углу выберите соответствующий тип пластины.Опция автофокусировки: два пика"Цель: 40x Вода, NA 1.1"Конфокальный" режим и Биннинг 1. Очистите объектив 40x Water перед использованием через меню настроек. В поле выбора канала используйте значок плюса, чтобы добавить каналы DAPI, Alexa 647 и Alexa 568.Установите их для измерения в одной плоскости в один микрометр. Оптимизируйте настройки времени и мощности для повышения эффективности окрашивания пробирной пластины. Убедитесь, что каналы не измеряются одновременно, щелкнув последовательность каналов, чтобы отделить каналы.В разделе навигации и определения макета выберите скважины для измерения и выберите от 9 до 12 месторождений на скважину. Во время настройки нажмите на репрезентативное поле на карте пластин. И проверьте каждый измерительный канал по очереди, чтобы убедиться, что окрашивание присутствует, и что изображения фокусируются, регулируя смещение канала.Чтобы загрузить данные на сервер для удаленного анализа, нажмите на поле «Онлайн-задания» и соответствующее имя экрана. Сохраните протокол анализа, нажав на кнопку «Сохранить», и нажмите на вкладку «Запустить эксперимент» вверху. Анализ фагоцитоза живых клеток показал, что при 10 000 SH-SY5Ys на скважину количество частиц фагоцитозы на клетку линейно увеличивалось со временем и ингибировалось примерно на 50% цитохалазином D. При более высоких количествах SH-SY5Ys на скважину фагоцитоз проявлял плохую линейность, вероятно, из-за плохой сегментации iPSC, макрофаги и SH-SY5Ys в более переполненном поле зрения.Следующие результаты были получены путем выполнения визуализации с высоким содержанием фиксированных клеток, включая это репрезентативное изображение фагоцитоза. Увеличение количества SH-SY5Ys привело к увеличению количества фагоцитозированных частиц на клетку. Анализ фагоцитоза был подтвержден с использованием нескольких ингибиторов фагоцитоза.Цитохалазин D и Jasplakinolide значительно ингибировали фагоцитоз на 91 и 90 процентов соответственно. А бафиломицин А1 значительно уменьшал фагоцитоз на 31% при предварительной инкубации за 1 час до фагоцитоза. Добавление рекомбинантного аннексина 5 значительно уменьшало фагоцитоз на 30% при добавлении в колодцы непосредственно перед добавлением SH-SY5Y.Исправлено SH-SY5Ys, мы подтвердили, что подвергаем воздействию фосфатидилсерина с помощью флуоресцентного зонда Annexin 5. В то время как живые SH-SY5Y были отрицательными для окрашивания Приложением 5. Несколько длин продолжительности фагоцитоза, от 1 до 5 часов, были протестированы с использованием поэтапного добавления фагоцитарного груза.Общая длина этого протокола может быть сокращена путем подготовки фагоцитарного груза и окрашивания макрофагов iPSC параллельно. Если вы хотите сделать это, заранее проработайте сроки и используйте свои инкубаторы для подготовки решений для будущих шагов.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Маркировка и работы с изображениями Ячейки в задний мозг данио рерио

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Количественный Анализ сотового мигрантах мышиных кишечных нейронных прародителей

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM и рН-чувствительные GFP-зонды для оценки нейромедиатора пузырька динамики в SH-SY5Y клеток нейробластомы: Сотовый изображений и анализ данных

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

В естественных условиях переноса гена к шванновских клеток в нерве Грызун седалищного путем электропорации

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

В пробирке Фагоцитоз миелина мусора макрофагами, костного мозга, полученных

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Развитие анализа высокое содержание количественной оценки совокупных формирования Sod1 Мутантный белок в живых клетках

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Роман В Vitro Live изображений Assay экзоцитоз-опосредованной с помощью фагоцитоза pH индикатор конъюгированных синаптосомах

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

В пробирке Assay для изучения агрегация белка Тау и наркотиков скрининг

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...