Name: in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

Författarna tackar Dr. Val Millar och Dr. Sohaib Nizami för deras hjälp med högkvalitativ mikroskopi och Dr Daniel Ebner för tillgång till de höginnehållsmikroskopen. Dessutom tackar författarna Dr. Emma Mead för analysutvecklingsråd och Mrs. Cathy Browne för iPSC-stöd. Detta arbete stöddes av Alzheimer's Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, grant reference ARUK-2020DDI-OX), med ytterligare stöd till James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) från Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award från Parkinsons Storbritannien (J-1403); MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 och Momentum MC_PC_16034 Awards.

<ol>
	<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearing+the+dead:+apoptotic+cell+sensing,+recognition,+engulfment,+and+digestion.">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li><li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+in+the+brain:+Homeostasis+and+disease.">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).</li><li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer's+disease:+potential+therapeutic+targets.">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li><li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+live+neurons.">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li><li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia.">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding.">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).</li><li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila.">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li><li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2.">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).</li><li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets.">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li><li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages.">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li><li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Alzheimer's+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout,+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages.">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research &amp; Therapy. 12, 151 (2020).</li><li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer's+disease+not+evident+in+mouse+models.">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li><li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li><li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+robust+Z'+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons.">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).</li><li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+&#945;-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson's+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons.">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular &#945;-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li><li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2.">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li><li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease.">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Witting, A., M&#252;ller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia/brain+macrophages+in+vitro:+Involvement+of+lectin-,+integrin-,+and+phosphatidylserine-mediated+recognition.">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li><li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia.">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li><li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease.">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).</li><li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome.">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li><li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells.">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li><li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis.">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Microglia har viktiga funktioner som påverkar initiering och progression av neurodegenerativa sjukdomar, inklusive fagocytos av apoptotiska nervceller. Nedsatt mikroglial fagocytos och olämplig faagocytos av synapser har båda associerats med neurodegenerativa sjukdomar, även om de underliggande mekanismerna och orsakssambandet inte är väl förstådda4,23. Detta dokument beskriver en faagocytosanalys för att mäta fagocytos av apoptotiska celler med iPSC-makrofager, med antingen en levande cell tid-förfall avbildning av avläsning eller fast-cell höginnehåll mikroskopi, eller en kombination av båda på en enda analys. Denna mångsidighet innebär att analysen kan användas för att studera enskilda farocytiska händelser över tid i några brunnar eller användas för screening med högt innehåll med flera tillstånd eller behandlingar. Eftersom analysen med hög halt är fixerad vid en enda tidpunkt kan flera analysplattor beredas samtidigt. Analysen med högt innehåll har potentiellt nytta för att karakterisera makrofager/mikroglia med sjukdomsrelaterade genetiska varianter eller screening av små molekylhämmare för förändringar i fagocytos. Analysen kan också enkelt anpassas för att studera fagocytos av andra mikrogliamodeller, eller potentiellt astrocyter. Phagocytosis analys kan potentiellt multiplexeras med levande-cell imaging fläckar, t.ex. mitokondrier, kalcium eller ROS indikatorer, och post-fixation immunofluorescent färgning för proteiner av intresse kan utföras. Jämfört med befintliga phagocytosis analyser som använder apoptotiska neuronal celler, de främsta fördelarna som detta protokoll ger är att förberedelse av den phagocytic lasten är relativt enkel och snabb, och resulterar i en enhetlig produkt. Andra analyser inducerar apoptos av nervceller eller SH-SY5Ys med S-nitroso-L-cystein i 2 h25, okadasyra i 3 h22, staurospor för 4-16 h26,27,28,29 eller UV-bestrålning i 24 h30, och kan resultera i celler i olika stadier av apoptos. Dessutom har live-cell imaging och hög innehåll imaging avläsningar inte tidigare beskrivits, såvitt författarna är medvetna om. Den huvudsakliga begränsningen av att använda paraformaldehydfixering för att förbereda den farocytiska lasten är att den inte helt rekapitulerar apoptosprocessen, eftersom fixering förhindrar att cellerna delas upp i apoptotiska kroppar, som sannolikt kommer att faagocytoseras snabbare på grund av deras mindre storlek. Det är inte känt vilken effekt fixering har på utsöndring av nukleotid "hitta mig" signaler (t.ex. ATP, UDP) från målcellen som lockar fagocyter. I likhet med apoptotiska celler uppvisar de fasta SH-SY5Ys vissa membranpermeabilitet till propidiumididid. Membranpermeabilitet är förknippad med frisättningen av "hitta mig" signaler; Detta har dock inte studerats i de fasta SH-SY5Ys, och om nukleotid frigörs för snabbt, skulle de tvättas bort innan SH-SY5Ys läggs till iPSC-makrofager.
Det första kritiska steget i protokollet är färgning av döda SH-SY5Ys med en STP ester av en pH-känslig röd fluorescerande färgämne. Detta färgämne reagerar snabbt och kovaly med fria primära aminer på ytan av de döda SH-SY5Ys. Färgningens varaktighet behöver inte optimeras; Försiktighet måste dock vidtas vid hantering av färgämnet innan märkning. Märkningsreaktionen får inte utföras i buffertar som innehåller fria aminer. Dessutom finns det risk för nederbörd om DMSO-beståndet späds ut i kall vattenbuffert eller vid hög slutlig koncentration. Fällningar visas som täta mörka föremål under mikroskopet. Dessutom fastnar den pH-känsliga färglösningen på vanliga centrifugrör av plast och tvättas långsamt bort; Därför rekommenderas lågbindande rör för märkningssteget. Användning av ett pH-känsligt färgämne, istället för ett permanent fluorescerande färgämne, hjälper identifiering av uppslukade partiklar, jämfört med partiklar som granne plasmamembranet. Eftersom det finns viss fluorescens vid neutralt pH, måste densiteten hos fagocytisk last och iPSC-makrofager hållas tillräckligt låg för noggrann segmentering, även om den är tillräckligt hög för att många phagocytiska händelser fångas. Höginnehåll mikroskopi kunde exakt identifiera faagocytos med en medelhög densitet av last i brunnen (mer än 2 SH-SY5Ys per iPSC-makrofag). Omvänt, på grund av svagare känslighet för mikroskopet i det djupa röda spektrumet, var segmentering av iPSC-makrofager i live-cell time-lapse imaging data mindre säker och det var nödvändigt att använda en mycket låg densitet av last för att minska sannolikheten för falska positiva (1 SH-SY5Y för varannan iPSC-makrofager). Validering av korrekt segmentering och lasttäthet bör utföras med jämförelser mellan obehandlade och cytochalasin D-behandlade brunnar. I en väloptimerad analys bör cytochalasin D minska det genomsnittliga antalet fläckar per cell med 90% i förhållande till obehandlade prover.
Ett annat kritiskt steg i protokollet är iPSC-makrofen färgning, vilket gör att cellen kan identifieras och segmenteras i bild analys så att alla externa SH-SY5Ys utesluts från räkningen. Det rekommenderade färgämnet är cellpermeant, omvandlat till en olöslig fluorescerande produkt i cytoplasman, fixerbar och giftfri (se Materialförteckning ). Färgningssteget optimerades för användning av iPSC-makrofager med den höginnehållsbildande phagocytosanalysen, och vi föreslår att den ska optimeras om andra celltyper används. Varaktigheten av cellfärgning kan ökas för att förbättra nedfallet av den olösliga fluorescerande produkten i celler. Om färgkoncentrationen optimeras bör man vara försiktig så att toxiska halter av det organiska lösningsmedelsfordonet undviks.
Den tredje kritiska faktorn för analysens framgång är dataanalysen. De analyspipeliner som tillhandahålls är avsedda att vara vägledande snarare än normativa, eftersom skillnader i färgningsintensitet eller cellmorfologi kan minska effektiviteten av segmentering av rörledningarna som skrivna. Vissa optimeringar kommer därför att krävas, med testning av pipelinen på lämpliga positiva och negativa kontroller, och de parametrar som ska optimeras anges i protokolltexten. Negativa kontroller bör omfatta ett tillstånd där iPSC-makrofager förbehandlas med en potent fagocytoshämmare såsom cytochalasin D före tillsats av SH-SY5Ys. En annan möjlig negativ kontroll är tillägg av SH-SY5Ys till tidigare obehandlade brunnar av iPSC-makrofager i slutet av analysen, 10 min före fixering, vilket gör det möjligt att lösa lasten men är för kort för att en märkbar mängd fagocytos ska uppstå. En fagocytoshändelse definieras som ett rödfluorescerande objekt inom gränserna för en iPSC-makrofag, definierad av programvarualgoritmen med hjälp av den djupröda fluorescenskanalen. Om segmenteringen av cellerna är dålig (figur 2),kan många icke-faagocytosed SH-SY5Ys i närheten av iPSC-makrofager felaktigt inkluderas i analysen, dvs. falska positiva. Den viktigaste faktorn för att uppnå god segmentering är strikt avgränsning av iPSC-makrofager. Segmentering för båda analyserna är automatiserad, så det är inte möjligt att få perfekt segmentering för varje cell; Några parametrar kan dock justeras för att göra segmenteringen mer optimal, med några testbilder som referens. Cytochalasin D kontroll är viktigt för att bedöma optimal segmentering eftersom ett stort antal phagocytic händelser som detekteras i detta villkor indikerar att segmenteringen är suboptimal. Optimering av dataanalyspipelinen bör helst upprepas tills antalet fagocytiska händelser per cell är 80-90% lägre i cytochalasin D-tillståndet jämfört med ingen hämmare.
De problem med fagocytosanalysen som mest sannolikt uppstår är: (1) svag pH-känslig fluorescens i positiva kontroller, (2) sparse eller ojämn fördelning av makrofager i slutet av analysen, eller (3) högt antal falska positiva i analysen från icke-faagocytosed SH-SY5Ys. Felsökning av svag pH-känslig fluorescens bör först kontrollera att färgning av SH-SY5Ys resulterade i en cellpellets med en stark magentafärg. Om färgen är svag, se till att ett färskt färgämneslager används, se till att märkningsbufferten är amningsfri, tillsätt en extra tvätt till SH-SY5Ys före färgning, kontrollera om rätt antal SH-SY5Ys var färgat, se till att inga färgutfällningar är i bevis och optimera färgämnets märkningskoncentration. Om SH-SY5Ys är starkt färgade, kontrollera om koncentrationen som tillsätts analysplattan är korrekt och se till att iPSC-makrofager är friska och inte för gamla. Den andra typen av problem, ojämn makrofagfördelning, kan bero på förlust av celler under pipetting och åtgärder bör vidtas för att minska de pipettingkrafter som cellerna upplevr, vilket undviker smalborrningsspetsar. Om problemet kvarstår, minska inkubationstiden för att ladda iPSC-makrofager med cellpermeantfärgämne. Det tredje problemet, när det gäller felaktigt införande av icke-faagocytosed partiklar i analysen, indikerar att mer optimering av analyspipelinen krävs. Felsökning bör först fokusera på cellsegmentering och om programvaran innehåller intilliggande objekt. Specifika parametrar som kan justeras föreslås i noterna nedan de relevanta stegen (steg 6.1.11-6.1.15 för livecellsanalysen och steg 6.2.4-6.2.8 för analysen av höginnehåll). Om cellsegmenteringen inte kan förbättras ytterligare har analysen med högt innehåll ett extra steg (steg 6.2.8) som utesluter felaktigt segmenterade iPSC-makrofager. Dessutom kan modulen som filtrerar accepterade fläckar av pH-känslig fluorescens inom iPSC-makrofager optimeras, vilket ökar tröskelvärdets intensitet för accepterade objekt, vilket bör bidra till att utesluta icke-phagocytosed SH-SY5Ys (steg 6.1.17 för live-cell timelapse-analysen och steg 6.2.11 för analysen med högt innehåll).
Vi utvecklade två typer av mikroskopi avläsning för phagocytosis analys att var och en har fördelar och begränsningar. Live-cells timelapse-avbildning har fördelarna med att ge extra information om phagocytos kinetik och är mer allmänt tillgänglig än avbildningsplattformar med högt innehåll. Den rekommenderade programvaran med öppen källkod är agnostisk för mikroskopkällan och kan användas med alla fluorescerande mikroskop av god kvalitet, med eller utan live-cell time-lapse-kapacitet. Den huvudsakliga begränsningen av live-cell imaging är begränsad känslighet och optik, vilket gör det mer utmanande att upptäcka och utföra bra segmentering av iPSC-makrofager. Denna begränsning kan mildras antingen genom att öka varaktigheten för iPSC-makrofingringsfärgning eller genom att växla till ett känsligare mikroskop, om tillgängligt. Den högkvalitativa avbildningsfasen är den rekommenderade avläsningen om ett bildsystem med högt innehåll är tillgängligt. Avbildningssystem med högt innehåll möjliggör högre dataflöde och mer tillförlitliga data, vilket gör det möjligt att använda denna analys för screening, där ett robust Z på ≥0,7 förväntas för "antal fläckar per cell"-utgång 20. Jämfört med livecells timelapse-metoden har den högupplösta mikroskopiavläsningen högre känslighet, högre grad av automatisering och hastighet, fler brunnar och bildfält kan bearbetas och högupplösta konfokala bilder produceras. Cellsegmentering är effektivare med bra bilder, och segmentering underlättas dessutom av programvaran för analys av avbildning med högt innehåll som ger fler cellsegmenteringsmetoder som lämpar sig för mycket oregelbundet formade celler. Programvaran för avbildningsanalys med högt innehåll beräknade också fler parametrar för faagocytos, jämfört med programvaran med öppen källkod, till exempel andelen fagocytiska celler. Den huvudsakliga begränsningen av phagocytostestet med högt innehåll är kostnad och tillgänglighet för bildsystemet och analysprogramvaran.
Sammanfattningsvis är den kvantitativa faagocytosanalysen som presenteras i detta dokument ett användbart verktyg för modellering av mikroglia faagocytos av döda nervceller in vitro. Mikroglia modelleras av iPSC-makrofager och de döda nervcellerna modelleras av paraformaldehyd-fasta SH-SY5Ys. Även om inte de mest autentiska mikroglia och döda / apoptotiska neuronmodeller publicerade, är dessa lätta att förbereda och skalbara. Själva analysen är mycket mångsidig, med två typer av avläsning av avbildningar detaljerade, och den har potential att anpassas för användning med olika mikroglia / makrofag monokulturmodeller, eller en annan celltyp för att fungera som den fagocytiska lasten. Avläsningen med hög innehåll är fördelaktig för att erhålla kvantitativa data och kan skalas upp för att analysera små molekylmodulatorer av fagocytos eller screengenetiska varianter i iPSC-makrofager. Men eftersom avbildningssystem med högt innehåll är dyra och datatunga, har en alternativ avläsning av avbildning inkluderats i protokollet med hjälp av ett live-cells tidsfördröjningsmikroskop, som skulle kunna ersätta alla konventionella fluorescensmikroskop av god kvalitet, om det behövs.

Microglia är hjärnvävnad-bosatta makrofager, och deras funktioner inkluderar immunövervakning, samordna inflammatoriska svar på skada / infektion, synaptisk ombyggnad och faagocytos av döda celler, myelin, proteinaggregat och patogener. Faagocytos är den process genom vilken mikroglia känner igen last med ytreceptorer och omorganiserar sitt cytoskeleton för att uppsluka objektet till en fagosom, som sedan smälter samman med lysosomer för nedbrytning av lasten. Friska microglia phagocytose apoptotiska hjärnceller för att ta bort dem innan de blir nekrotiska1. Foscytosen hos apoptotiska celler är också känd som efferocytos, och kräver visning av en fosfatidylserin "äta-mig" signal av den döendecellen 2. Många mikrogliareceptorer binder direkt till fosfatidylserin, inklusive TIM-4, BAI1, Stabilin-2 och TREM2. Mikroglialla TAM-receptorer (t.ex. MERTK) och integrins binder indirekt till fosfatidylserin, med hjälp av tillbehörsproteinerna GAS6 respektive MFG-E8. Andra "eat-me"-signaler kan vara nödvändiga för erkännande av döende celler, dessa inkluderar förändringar i glykosylering eller laddning av ytproteiner; Uttryck av intracellulära proteiner ICAM3, calreticulin, annexin-I vid cellytan. oxiderad LDL; eller beläggning av apoptotisk cell med mikrogliaproducerat komplement C1q1,2.
Neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, frontotemporal demens och amyotrofisk lateral skleros har associerats med försämring av mikroglia funktion, inklusive en ackumulering av hjärnan avfall produkter såsom döda celler, myelin fragment och protein aggregat, och överdrivna inflammatoriska svar på dessa stimuli3. Faagocytos kan försämras vid neurodegenerativa sjukdomar och bidra till patologin, på grund av en kombination av åldrande, inflammation eller specifika genetiska riskvarianter4,5. Å andra sidan finns det också bevis från djurmodeller av neurodegenerativa sjukdomar att mikroglia kan olämpligt faagocytose livskraftiga nervceller eller synapser6,7,8. Mekanismen kommer sannolikt att initieras av fosfatidylserindisplay av skadade neuriter, som direkt avkänns av mikrogliafostosreceptorer TREM2 eller GPR56, eller indirekt avkäns genom lösligt komplement C1q beläggning fosfatidylserinberikat membran, vilket leder till CR3-medierad fosagocytos9,10,11.
In vitro-analyser av fagocytosfunktion,t.ex.för att bedöma den fenotypiska effekten av en genetisk riskvariant i mikroglia, utförs ofta med icke-fysiologiska laster såsom latexpärlor 4 . Fluorescerande märkta bakterier och zymosan används också, som är fysiologiska men inte relevanta för neurodegenerativa sjukdomar. Icke-fysiologiska farocytiska laster kan användas för att upptäcka defekter i de grundläggande maskinerna för fagocytisk uppslukling men misslyckas med att noggrant modellera det första "erkännande" steget i fagocytos av apoptotiska nervceller. Storleken, formen, styvheten och typen av last dikterar också de intracellulära signalvägarna som aktiveras, vilket leder till olika resultat av mikrogliaaktiveringstillstånd. Till exempel är E.coli-bakterier små och styva, till skillnad från mänskliga celler, och lipopolysackariderna på deras yta känns igen av Toll-liknande receptor 4 (TLR4) som aktiverar faagocytos och proinflammatoriska signalvägar2,12.
I samband med neurodegenerativa sjukdomsstudier skulle en mer relevant fosfacytisk last ha fosfatidylserindisplay på däggdjursplasmamembran, och skulle helst vara mänskliga och neuronala, för att inkludera signaler som mikroglia sannolikt kommer att stöta på. För detta faagocytosprotokoll valdes den mänskliga neuroblastomcelllinjen SH-SY5Y som en neuronmodell som är lätt att odla. Permanent yta fosfatidylserin display inducerades artificiellt av paraformaldehyd, som tidigare har visat sig orsaka fosfatidylserin display av trombocyter13. För mikroglia cell modell mänskliga iPSC-makrofager användes, som efterliknar ontogeny och transkriptionell profil av mänskliga microglia, och är faagocyticallykompetenta 14,15,16,17. iPSC-makrofager är inte den mest autentiska mikrogliamodellen som finns tillgänglig, t.ex. Man kan dock ersätta den med en mer autentisk monokultur iPSC-modell av mikroglia om så önskas, såsom Haenseler et al.15. Mänskliga iPSC-modeller är att föredra framför primära gnagare microglia för att studera neurodegeneration, på grund av oro för den begränsade överlappningen av mikroglia transkriptionsmoduler observeras i mänskliga kontra mus neurodegenerativa sjukdom vävnader18. De döda SH-SY5Ys är färgade med ett syrakänsligt färgämne som fluorescerar svagt vid neutralt pH och starkare inuti fagolysosomerna hos iPSC-makrofager efter fagocytos. Att använda ett syrakänsligt färgämne förbättrar noggrannheten i att upptäcka fagocytiska händelser, med mångsidighet för olika avläsningar av levande och fasta makrofager19. Detta protokoll beskriver både live-cell time-lapse imaging av fagocytos och en fast höginnehåll imaging analys för fagocytos, med samma cell förberedelse steg före avläsning (Figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Figur 1: Schematiskt metoddiagram. Kontur av fagocytosanalysen, där beredning av SH-SY5Ys och färgning av iPSC-makrofager utförs parallellt, och sedan SH-SY5Ys pipetted på iPSC-makrofager. Antingen utförs live-cell time-lapse imaging omedelbart, eller cellerna inkuberas vid 37 °C/5% CO2 under den erforderliga varaktigheten och fixeras innan höginnehållsmikroskopi utförs. PFA: paraformaldehyd, HBM: fenol röd-fria HEPES-buffrade medier, pHr: pH-känsliga röda fluorescerande färgämne STP Ester lösning, PRFMM: fenol röd-fria makrofagen massmedia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>For centrifugation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L, 20-200 &#181;L, 100-1000 &#181;L single-channel micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol 50 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Component of Factory media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>For fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell-800 24-well plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34815</td>
			<td>Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14085</td>
			<td>Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td>96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 &#956;M, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 laminar air flow safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, set to 37&#176;C and 5 % CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image Data Storage and Analysis System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11330</td>
			<td>Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20&#176;C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320074</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for CellTracker and pHrodo dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td>Live-cell time-lapse imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube CY5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4656</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4650</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Light Cube RFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMEP4652</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td>Accessory for EVOS FL Auto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Component of SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE 10-547F</td>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant BMP4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-3</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC0033</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant SCF</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-695</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant VEGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Component of Embryoid Body media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Imaging Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein binding 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108.132</td>
			<td>For staining SH-SY5Ys</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC9501</td>
			<td>Component of both Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel 20-200 uL pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For liquid handling of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH14000000</td>
			<td>High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36011</td>
			<td>pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 &#956;L (12.5 &#956;g) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette filler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as &#34;Factories&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vessel for SH-SY5Y culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealers</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676001</td>
			<td>For assay plate storage and transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, set to 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418F</td>
			<td>Component of Factory and Macrophage media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-744Q</td>
			<td>Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro quantitative imaging assay for phagocytosis of dead neuroblastoma cells by ipsc-macrophages

Microglia orkestrera neuroimmuna svar i flera neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom och Alzheimers sjukdom. Microglia rensa upp döda och döende nervceller genom processen av efferocytos, en specialiserad form av fagocytos. Faagocytosfunktionen kan störas av miljömässiga eller genetiska riskfaktorer som påverkar mikroglia. Detta dokument presenterar en snabb och enkel in vitro mikroskopi protokoll för att studera microglial efferocytosis i en inducerad pluripotent stamcell (iPSC) modell av microglia, med hjälp av en mänsklig neuroblastom cellinje (SH-SY5Y) märkt med en pH-känsliga färgämne för phagocytic last. Förfarandet resulterar i ett högt utbyte av döda neuroblastomceller, som visar ytan fosfatidylserin, erkänd som en "äta-mig" signal av fostrater. 96-brunnsplattans analys är lämplig för live-cell time-lapse-avbildning, eller så kan plattan fixas framgångsrikt före vidare bearbetning och kvantifieras genom högkvalitativ mikroskopi. Mikroskopi med högt innehåll med fast cell gör det möjligt att skala upp analysen för screening av små molekylhämmare eller bedöma den fagocytiska funktionen hos genetiska varianter iPSC-linjer. Medan denna analys utvecklades för att studera faagocytos av hela döda neuroblastomceller av iPSC-makrofager, kan analysen enkelt anpassas för andra laster som är relevanta för neurodegenerativa sjukdomar, såsom synaptosomer och myelin, och andra fagocytiska celltyper.

Live-cell time-lapse imaging utfördes med hjälp av det tidigare skisserade protokollet, med vilda iPSC-makrofager sådd vid 20 000 celler per brunn. Olika mängder SH-SY5Ys tillämpades (10 000-30 000 per brunn som uppskattats från cellantalet i steg 3, 1), och fagocytoshämmaren cytochalasin D var förinkuberad (1 h) med vissa brunnar, som fungerar som en kontroll för att hämma fogocytos för varje mängd SH-SY5Ys. Bildbehandlingen påbörjades 40 minuter efter tillsats av SH-SY5Ys och bilder togs med 5 minuters intervall under de kommande 3 h (data inkluderar den första 40 minuters fördröjningen). En representativ timelapse-video ingår i kompletterande data ochanalyseras kvantitativa data som visas i figur 3. Med mängden 10 000 SH-SY5Ys per brunn ökade antalet fagocytosed partiklar (fläckar) per cell linjärt med tiden och hämmades av cirka 50% av cytochalasin D. Hämningen av cytochalasin D var svagare än väntat, troligen orsakad av otillräckliga tekniska eller biologiska replikat, eftersom endast en brunn per villkor var avbildad med tre bildfält. Med högre mängder SH-SY5Ys per brunn (20 000 och 30 000) uppvisade fagocytos dålig linjäritet, sannolikt på grund av dålig segmentering av iPSC-makrofager och SH-SY5Ys i ett mer trångt synfält.
Avbildning med fast cell med högt innehåll utfördes med det tidigare skisserade protokollet, med iPSC-makrofager av vild typ vid 20 000 celler per brunn, flera olika mängder SH-SY5Ys (10 000-80 000 per brunn) och analysplattan fixades och avbildades efter 5 timmar. En representativ bild av fagocytos presenteras i figur 4Aoch de analyserade data som visas i figur 4B17. Att öka mängden SH-SY5Ys resulterade i ett högre antal fagocytosed partiklar (fläckar) per cell; En fördubbling av SH-SY5Y mängd leder dock bara till en 1,5x ökning av antalet fläckar per cell. Detta indikerar att de testade mängderna inte är hastighetsbegränsande för fagocytos. Därefter validerades den högkvalitativa avbildningsfasanalysen med hjälp av flera hämmare av fagocytos (figur 4C)17. Aktinpolymeriseringshämmarna cytochalasin D och jasplakinolid hämmade signifikant fagocytos med 91% respektive 90%, när de förinkuberades i 1 h före phagocytos. Det robusta Z' av analysen när cytochalasin D eller jasplakinolid används som negativa kontroller beräknas som 0,7 respektive0,8, 20. Lysosomförsurningshämmaren bafilomycin A1 minskade signifikant fagocytosen med 31%, när inkuberade 1 h före fagocytos. Den svagare effekten av lysosomförsurningshämmaren jämfört med aktinhämmare tyder på att detektion av den internaliserade lasten kanske inte kräver fullständig försurning av fagosomen. Rekombinant annexin V användes som en kontroll för att specifikt blockera fosfatidylserin exponerat på ytan av SH-SY5Ys, vilket förhindrar phagocytic receptorer från att komma åt ligand, en viktig "eat-me" signal. Tillsats av rekombinant annexin V avsevärt minskade fagocytos med 30%, när de tillsätts till brunnar omedelbart före SH-SY5Y tillägg. Fasta SH-SY5Ys bekräftades att exponera fosfatidylserin, med hjälp av en fluorescerande annexin V sond, medan levande SH-SY5Ys var negativa för annexin V färgning (Figur 4D).
Microglial phagocytosis receptor TREM2 har tidigare visat sig vara viktigt för fagocytos av apoptotiska nervceller21. R47H mutationen av TREM2 är en risk gen för sent uppkomsten av Alzheimers sjukdom, och är hypotetiska att minska ligand bindande av TREM223. I syfte att bedöma fagocytisk funktion hos R47H TREM2 och TREM2 KO utfördes phagocytostestet med hög halt med isogena iPSC-makrofaglinjer med WT/R47H/KO TREM217. Flera längder av faagocytos varaktighet från 1 till 5 h testades, med hjälp av en förskjuten tillägg av phagocytic last (40,000 SH-SY5Ys). Den resulterande signalen ökar linjärt till 4 timmar och planar ut något vid 5 timmar (figur 5)17. Minskad fagocytos hastighet och kapacitet (% spot positiva celler) var uppenbart i TREM2 KO jämfört med WT, medan R47H TREM2 mutant inte visade förändrad fagocytos. Den phagocytic defekten i TREM2 KO celler är inte fenocopied av R47H TREM2 mutationen, till synes eftersom TREM2 funktionen är tillräcklig för att stödja normala phagocytosis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Figur 3: Exempeldata för livecellsfasanalys. Upptag av döda SH-SY5Ys av vilda iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) avbildat med 5 minuters intervall för 3 h. Tider som visas på grafen är från initiering av fagocytos, inklusive de första 40 min utan mätning. Det genomsnittliga antalet fläckar per cell från tre replikerade brunnar ritas. Phagocytos på 10 000 SH-SY5Ys hämmas med 10 μM cytochalasin D med 1 h förbehandling, medan högre mängder SH-SY5Ys (20 000 och 30 000) har suboptimal kvantifiering av fogocytos. Medelvärde ± standardavvikelse (SD), N = 1 experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Figur 4: Optimering och validering av phagocytosanalys med fast cell. (A) Representativ mikroskopibild med högt innehåll av SH-SY5Ys phagocytosed av vilda iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). En 3 h tidspunkt med 40 000 SH-SY5Ys visas. Fluorescenskanaler slås samman, med iPSC-makrofagfläck som visas som röd, atomkärnor som blå och SH-SY5Ys som gula. Inset-panelen är en del av bilden förstorad 3x. (B) Antalet fläckar per cell av fagocytosed döda SH-SY5Ys efter 5 h, med olika mängder last tillägg till vilda iPSC-makrofager. Medelvärde ± standardfel av medelvärdet (SEM), för N = 3 skördar. C)Phagocytos (3 h) hämmas med 10 μM cytochalasin D (Cyt), 1 μM bafilomycin A1 (Baf), 1 μM jasplakinolid (med 1 h förbehandling; Jas) och 13 μg/ml rekombinant annexin V (tillsätts samtidigt till de döda SH-SY5Ys; Ann, det är jag). iPSC-makrofager utan sh-SY5Ys tillagt användes som en negativ kontroll (-ve), och den positiva (+ve) kontrollen är obehandlad iPSC-makrofager med SH-SY5Ys tillagd. Data normaliserades till medelvärdet för experimentrepetitionen. Betyder ± SEM, för N = 3-6 skördar och med två cellinjer av vildtyp (SFC840-03-03, Karakteriseringen av denna rad beskrivs i (Fernandes et al.21 och BIONi010-C). 1-vägs ANOVA med Dunnetts post hoc-test, jämförelser med obehandlade celler. *p < 0,05, ***p < 0,001. D)Nytillverkad SH-SY5Ys-fläck jämnt för fosfatidylserindisplay (annexin V-FITC) och har begränsad cellpermeabilitet (propidiumididid). Levande SH-SY5Ys fläckar inte för annexin V-FITC eller propidium iodide, med undantag för focal färgning finns på de få döda cellerna i kultur. Siffror återges med tillstånd från Alzheimers Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Figur 5: Phagocytos reduceras i TREM2 KO men inte i R47H TREM2 iPSC-makrofager. Höginnehåll phagocytosis analys utförs med 40,000 SH-SY5Ys per brunn med förskjutna tillägg. Medel kvantifierades för parametrarna: antal fläckar per cell, summan av spotområden (μm2)per cell och procentandel celler som innehåller fagocytosed partiklar per fält. Data normaliserades till medelvärdet för varje genotyp per experiment. Medelvärde ± SEM, för N = 3 skördar. Upprepade mått 2-vägs ANOVA, Dunnetts post hoc-test, parvis jämförelser med WT för varje gång: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Siffror återges med tillstånd från Alzheimers Research & Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Kompletterande figur S1: Exempel QC för beredning av SH-SY5Ys. Dissocierade SH-SY5Ys var fasta i 10 min med 0% (levande celler), 1%, och 2% av paraformaldehyd (PFA), sedan tvättas. Cellerna var färgade med annexin V-FITC och propidium iodide (PI) och omedelbart mätt med flöde cytometri. Färgdensitet prick tomter skapades i flöde cytometri analys programvara, med hjälp av en-färgade och obefläckade kontroller för att placera en kvadrant grind. Kvadranter kommenteras med procentandelen händelser inom kvadranten. Levande celler finns främst under fjärde kvartalet och fasta celler är främst under andra kvartalet. Q1 = annexin V-/PI-, Q2 = annexin V+/PI+, Q3 = annexin V+/PI-, Q4 = annexin V-/PI- (levande celler). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande video: Live-cell tid-förfaller fagocytos. Representativ timelapse video av SH-SY5Ys phagocytosed av vilda iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Bilderna togs var 5:e minut i 3 timmar. Videon beskärs och körs med 3 bildrutor per sekund, vilket visar de sista 1,5 h av analysen. De syrakänsliga färgfläckade SH-SY5Ys visas i rött, signalintensitet ökar med fagosome försurning. Cellkärnor färgade med Hoechst 33342 visas i blått. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages at JoVE.com

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Neurodegenerativa sjukdomar är associerade med dysreglerade mikroglia funktioner. Denna artikel beskriver en in vitro-analys av fagocytos av neuroblastomceller av iPSC-makrofager. Kvantitativa mikroskopiavläsningar beskrivs för både livecellig timelapse-avbildning och avbildning med högt innehåll med fast cell.

Kvantitativa bildanalys in vitro för faragocytos av döda neuroblastomceller av iPSC-makrofager

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Denna in vitro imaging analys gör det möjligt att kvantifiera effekten av olika cell behandlingar eller olika genotyper på microglial fagocytosis. Med hjälp av två celltyper som är relevanta för neurodegenerativ sjukdom använder vi döda neuroblastomceller för den farocytiska lasten, som framställs på ett sätt som enkelt och billigt kan skalas upp av stora avbildningsskärmar med högt innehåll. I ett biologiskt säkerhetsskåp klass 2, ta avstånd från SH-SY5Ys genom att aspirera på mediet.Tillsätt 4 ml celldisociationsbuffert och ta bort bufferten omedelbart så att mindre än 1 ml förblir som en tunnfilm som täcker cellerna. Inkubera i 2 till 3 minuter vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Sedan vid 10 ml HBSS till T-75-kolven.Och pipett SH-SY5Ys i ett 15 ml koniskt centrifugeringsrör. Centrifugera vid 400xG i 5 minuter. Aspirera supernaten och suspendera cellerna i 2 ml fenol rödfria HEPES buffrade medier, se till att bryta upp klumpar före fixering.Fixera cellerna genom att tillsätta 2 ml 4%effekt formaldehyd på röret och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur med tillfällig mild agitation. Tillsätt 10 ml HBSS i röret. Centrifugera sedan vid 1200xG i 7 minuter.Aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten i 2 ml fenolrödfria HEPES-buffrade medier. Räkna och ta bort 1 miljon HS-SY5Y-celler i ett 2 ml lågt proteinbindande rör. Ta den totala volymen till 300 till 500 mikroliter med fenol rödfria HEPES buffrade medier.Värm sedan kort röret i ett 37 grader Celsius vattenbad. Rekonstruera den pH-känsliga röda fluorescerande stp-esteren enligt tillverkarens instruktioner. Tillsätt sedan 12,5 mikrogram färgämne per miljon SH-SY5Y-celler.Blanda försiktigt genom att snärta på röret. Och inkubera röret vid rumstemperatur i 30 minuter, skyddat mot ljus. Tillsätt 1 ml HBSS och centrifugera vid 1200xG i 7 minuter och 4 grader Celsius.Kassera supernaten. Och tvätta med 2 ml HBSS. Suspendera cellpelleten i fenolrött fritt makrofagmedel till en koncentration av 0, 2 till 1, 2 miljoner celler per ml, så att 50 mikroliter innehåller 10 000 till 60 000 celler.I ett biologiskt säkerhetsskåp, förbered en lösning av djupröd fluorescerande cellpermeant succinimidyl ester-reaktiv färgämne i makrofag media. Tillsätt Hoechst 33342 och värm arbetslösningen till 37 grader Celsius i ett vattenbad. Aspirera iPSC-makrofatmediet försiktigt genom att pipettera cellens supernatant med en flerkanalspipett i en steril reservoar.Tillsätt 70 mikroliter per brunn av färglösningen till iPSC-makrofagen med en flerkanalspipett. Inkubera i 1 timme vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Reparera experimentella behandlingar i fenol röd-fria makrofag media.Efter inkubationen aspirerar du iPSC-makrofatmediet mycket försiktigt med en flerkanalspipett och lägger till 100 mikroliter HBSS per brunn. Avlägsna omedelbart HBSS genom skonsam rörning. Tillsätt sedan 100 mikroliter fenolrödfria makrofagmedier, plus experimentella behandlingar i separata brunnar.Inkubera i 10 minuter till 1 timme vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Använd en flerkanalspipett för att tillsätta 50 mikroliter av de märkta SH-SY5Ys per brunn från sidorna av varje brunn vid vätskans kant. Inkubera sedan vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 3 till 5 timmar.Efter phagocytos inkubation, aspirera försiktigt cell supernatants genom pipetting med en flerkanalig pipett och kassera. Tvätta en gång med 100 mikroliter PBS. Fixa sedan cellerna genom att lägga till 100 mikroliter 2%effekt formaldehyd och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.Aspirera brunnar och tillsätt 100 mikroliter PBS. Fortsätt antingen direkt till avbildning med mikroskopet med högt innehåll, eller täck med platttätning och folie och förvara plattan vid 4 grader Celsius tills det behövs. Slå på bildmikroskopet med hög innehåll och öppna bildinspelningsprogrammet.Ladda analysplattan i mikroskopet genom att klicka på LOAD"-ikonen högst upp på skärmen. Välj fliken SETUP". Välj lämplig plåttyp i listmenyerna i rutan uppe till vänster.Autofokusalternativet:två toppar"Målet:40x Vatten, NA 1.1"Confocal"-läge och Binning av 1. Spola 40x Vattenmålet före användning via inställningsmenyn. I rutan för kanalval använder du plusikonen för att lägga till kanalerna DAPI, Alexa 647 och Alexa 568.Ställ in dessa så att de mäts på ett enda plan på en mikrometer. Optimera tids- och effektinställningarna för färgningseffektiviteten hos analysplattan. Se till att kanalerna inte mäts samtidigt genom att klicka på kanalsekvensen för att separera kanalerna.Under navigering och definiera layout väljer du mätbrunnar och väljer 9 till 12 fält per brunn. Klicka på ett representativt fält på plåtkartan under installationen. Och kontrollera varje mätkanal i sin tur för att säkerställa att färgningen är närvarande och att bilderna är fokuserade genom att justera kanalförskjutningen.Om du vill ladda upp data till en server för fjärranalys klickar du på rutan onlinejobb och relevant skärmnamn. Spara analysprotokollet genom att klicka på spara"-knappen och klicka på fliken körexperimentet högst upp. Namnge experimentplattan, klicka sedan på start"En levande celltid lever fagocytosanalys visade att med 10, 000 SH-SY5Ys per brunn ökade antalet fagocytospartiklar per cell linjärt med tiden och hämmades av cirka 50%av Cytochalasin D.Med högre mängder SH-SY5Ys per brunn uppvisade fagocytos dålig linjäritet, sannolikt på grund av dålig segmentering av iPSC, makrofager och SH-SY5Ys i ett mer trångt synfält.Följande resultat erhölls genom att utföra en fast-cell hög innehåll imaging, inklusive denna representativa bild av phagocytosis. Att öka mängden SH-SY5Ys resulterade i ett högre antal phagocytosed partiklar per cell. Phagocytosis analys validerades med hjälp av flera hämmare av fagocytos.Cytochalasin D och Jasplakinolid hämmade signifikant fagocytos med 91 respektive 90 procent. Och Bafilomycin A1 minskade avsevärt fagocytos med 31%när förinkuberade i 1 timme före fagocytos. Tillsats av rekombinant Annexin 5 minskade signifikant fagocytosen med 30% när den tillsattes brunnar omedelbart före SH-SY5Y tillägg.Fixat SH-SY5Ys vi är bekräftade att exponera Fosfatidylserin med hjälp av en fluorescerande Annexin 5 sond. Levande SH-SY5Ys var negativa för 5-färgning i Annexin 5. Flera längder av phagocytosis varaktighet, från 1 till 5 timmar, testades med hjälp av förskjutna tillägg av phagocytic last.Den totala längden på detta protocall kan förkortas genom att förbereda den farocytiska lasten och färga iPSC-makrofager parallellt. Om du vill göra detta bör du räkna ut tidpunkterna i förväg och använda dina inkubationer för att förbereda lösningar för de framtida stegen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Märkning och celler Imaging i zebrafisk Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

En kvantitativ cellmigrationsassay för Murina Enter Neural stamfäder

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM och pH-känsliga GFP-sonder för att utvärdera Neurotransmitter Vesikel Dynamics i SH-SY5Y neuroblastomceller: cell imaging och dataanalys

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Genöverföring in vivo till Schwann-celler i gnagare ischiasnerven genom elektroporering

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

In Vitro Fagocytos av Myelin skräp av benmärgen-Derived makrofager

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay utveckling för hög innehåll kvantifiering av Sod1 Mutant Protein sammanlagda bildandet i levande celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

En roman In Vitro Live-imaging test av Astrocyten-medierad fagocytos med pH-indikator-konjugerad Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Analys för att studera sammanläggning av Tau-Protein- och drogkontroll

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...