Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة أمبارو في ولاية ساو باولو (FAPESP 2010/19547-1؛ 2018/03677-5) إلى MMAB، ومن مؤسسة Apoio ao Ensino، ومن Pesquisa e Assistência- FAEPA إلى MMAB، ومن قبل منسقة العلاقات العامة في نيفيل سوبيريور - البرازيل (CAPES) - الرمز المالي 001. حصلت CG-C على زمالة الماجستير والدكتوراه من CAPES وحصلت LAMT-S على زمالة الدكتوراه من CNPq. نشكر إليزابيتي ر. ميلاني على المساعدة في الفحص المجهري البؤري والدكتور داريو زامبوني على توفير خلايا LLC-MK2 (كلية ريبيراو بريتو الطبية ، USP).

1. مزارع الخلايا والطفيليات
<ol><li>قم بزراعة خلايا LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) من مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (CCL-7) في قارورة زراعة خلايا 25 سم 2 تحتوي على وسط RPMI مكملة ب 10٪ FBS المعطل للحرارة (مصل الجنين البقري) والمضادات الحيوية (100 U / mL Penicillin و 100 μg / mL Streptomycin) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 <sup class="...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+natural+antibodies.">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء وضع العلامات المناعية المزدوجة في الخلايا المصابة بالمجربة الكروزية باستخدام جسمين مضادين مختلفين من نفس النوع المضيف. لدراسة ، بمزيد من التفصيل ، الآثار المترتبة على العدوى ، يمكن تسمية الهياكل في الخلية المضيفة مثل النواة أو العضيات الخلوية باستخدام ه?...

لدراسة تفاعل العامل الممرض مع الخلية المضيفة على المستوى الخلوي يوفر معلومات أساسية عن الأسباب الكامنة وراء المرض لأن مجموعات مختلفة ، مثل الفيروسات والبكتيريا والبروتوزوا ، يمكن أن تصيب معظم أنواع الخلايا المضيفة 1،2،3،4. يمكن أن يساعد أيضا في تطوير وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة التي يمكن أن تبطئ أو تمنع نمو العامل الممرض. في الظروف الحية، تكون الأجسام المضادة المنتجة مسؤولة عن التعرف على المكونات الذاتية، والمستضدات من الفيروسات، والمكونات أو المنتجات البكتيرية، والفطريات، والطفيليات، وغيرها5.
لهذا الغرض ، تستخدم الأجسام المضادة على نطاق واسع ، وذلك أساسا لفهم موقع ووظيفة الهياكل الخلوية والبروتينات. تظهر العديد من الدراسات التي تستخدم علامات متعددة للأجسام المضادة أن خطوات الحجب الإضافية تساهم في خصوصية تحديد الموقع المناعي. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم معظم البروتوكولات الموصوفة أجساما مضادة تجارية وحيدة النسيلة محددة ، بما في ذلك الأجسام المضادة من نفس النوع المضيف6،7،8،9،10،11،12،13،14.
عادة ، يستخدم التألق المناعي المزدوج لوضع العلامات جسمين مضادين تم تربيتهما في أنواع مختلفة لتلطيخ هياكل الخلايا ذات الأهمية أو مسببات الأمراض والخلايا المضيفة لرؤية التفاعل بينهما. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا مشكلة عندما لا تتوفر أجسام مضادة تجارية أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة خاصة ببعض مسببات الأمراض لإجراء وضع العلامات المزدوجة. أيضا ، هناك مجموعات اقتران الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ، ومن الممكن إقران الأجسام المضادة الأولية مباشرة بالفلوروفور عن طريق تفاعل إستر سكسينيميديل15. المشكلة هي أن هذه المجموعات غالبا ما تكون باهظة الثمن ، ومن الضروري أن يكون لديك ما يكفي من الأجسام المضادة لتصنيفها. مع العلم بذلك ، نجحنا في تطوير طريقة التألق المناعي المزدوج باستخدام جسمين مضادين مختلفين تم تربيتهما في نفس النوع لدراسة توطين البروتين في Trypanosoma brucei16. ومع ذلك ، بالنسبة للطفيليات داخل الخلايا ، بما في ذلك Trypanosoma cruzi ، لم يتم إثبات هذا النهج. هنا ، نوضح كيفية إجراء التألق المناعي المزدوج لدراسة طفيليات T. cruzi داخل الخلايا والخلية المضيفة باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في نفس النوع دون تفاعلات متقاطعة. إلى جانب هذه الطريقة ، تم إنشاء علامة التألق المناعي الثلاثي مع إضافة الجسم المضاد الثالث من نوع مختلف. تساعد هذه الأساليب عندما يكون مصدر الأجسام المضادة محدودا ويمكن استخدامه في أي نوع من الخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

في الوقت الحاضر ، من الممكن العثور على مجموعة واسعة من الأدوات الجزيئية المتاحة لدراسة تفاعلات الخلايا المضيفة الطفيلية. ومع ذلك ، توجد بعض القيود للحصول على أجسام مضادة تجارية وحيدة النسيلة أو متعددة النسيلة تتعرف على هياكل وبروتينات خلايا محددة في الطفيليات. إلى جانب ذلك ، هناك عدد قليل من الأجسام المضادة التجارية المتاحة لتسمية المثقبيات. عادة ، يتم تحضير الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد الطفيليات في المنزل ويمكن أن يكون من الصعب استخدامها مع الأجسام المضادة الأخرى المنتجة في نفس النوع. هنا ، يوضح البروتوكول كيفية استخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة وأحادية النسيلة التي تربى في نفس النوع لإجراء التألق المناعي المزدوج لدراسة تفاعلات الخلايا المضيفة ومسببات الأمراض. لتحقيق التألق المناعي المزدوج لوضع العلامات ، من الأهمية بمكان احتضان الجسم المضاد متعدد النسيلة للفأر أولا ثم اتباع الحضانة مع الجسم المضاد للفأر الثانوي IgG المقترن بأي فلوروكروم. بعد ذلك ، من الضروري اتخاذ خطوة حظر إضافية لمنع أي أثر للجسم المضاد الأساسي من التعرف عليه بواسطة الجسم المضاد الثانوي التالي. بعد ذلك ، تتم إضافة جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر وجسمه المضاد الثانوي من الفئة الفرعية IgG المقترن بفلوروكروم مختلف إلى العينة في الأوقات المناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن إجراء التألق المناعي الثلاثي لوضع العلامات باستخدام جسم مضاد ثالث يثار في نوع مختلف. أيضا ، يمكن تلطيخ هياكل مثل النوى والأكتين لاحقا بمركباتها أو ملصقاتها المحددة. وبالتالي ، يمكن تعديل هذه الأساليب المعروضة هنا لأي خلية تكون مصادرها من الأجسام المضادة الأولية محدودة.

هنا ، نعرض كيفية دراسة التفاعلات بين الطفيليات المضيفة عن طريق التألق المناعي عندما يكون مصدر الأجسام المضادة محدودا بسبب عدم توفر الأجسام المضادة التجارية التي تتعرف على هياكل وبروتينات محددة في المثقبيات.
من بين المثقبيات ، لدى T. cruzi واحدة من أكثر دورات الحياة تعقيد...

Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

هنا ، يصف البروتوكول كيفية إجراء التألق المناعي المزدوج باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي تربى في نفس النوع لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض. أيضا ، يمكن أن تشمل الجسم المضاد الثالث من مضيف مختلف في هذا البروتوكول. يمكن إجراء هذا النهج في أي نوع من الخلايا ومسببات الأمراض.

التألق المناعي المزدوج باستخدام الأجسام المضادة من نفس النوع لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

في هذا البروتوكول ، يمكن استخدام جسمين مضادين من نفس المضيف معا في اختبار التألق المناعي لدراسة تفاعلات الخلية المضيفة ومسببات الأمراض. نظرا لوجود عدد قليل فقط من الأجسام المضادة التجارية المتاحة للتعرف على هياكل الخلايا والبروتينات المحددة في الطفيليات ، يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيدا للغاية. هذا هو بروتوكول التألق المناعي المزدوج سهل التنفيذ الذي يستخدم الأجسام المضادة متعددة النسيلة وأحادية النسيلة التي تربى في نفس النوع.قد يكون العديد من الباحثين غير مدركين أن هذا ممكن. يساعد هذا النهج عندما يكون مصدر الأجسام المضادة محدودا. يمكن استخدامه للكشف عن مسببات الأمراض في بروتينات الخلية المضيفة في الخلايا المضيفة المصابة ويمكن أيضا تطبيقه على الكائنات الحية الحرة.هذا بروتوكول بسيط ، يتطلب خطوة حظر واحدة بين الزوج الأول والثاني من الأجسام المضادة. سيتم عرض الإجراء من قبل الدكتورة كاميلا غاشيه كاسترو وطالب الدكتوراه لايس تراجانو سيلفا من مختبري. بعد ثلاثة أيام من إصابة خلايا LLC-MK2 بالمثقبيات الكروزية ، اجمع المادة الفائقة من الخلايا المصابة في أنبوب مخروطي لزراعة الخلايا سعة 15 ملليلتر.قم بطرد العينة لخفض حطام الخلية ، ثم ضع الأنبوب في درجة حرارة الغرفة للسماح للتريبوماستيجوت بالسباحة إلى السوبرناتانت. بعد 10 دقائق ، اجمع المادة الفائقة في أنبوب مخروطي جديد ، ثم قم بطرد العينة وتخلص من المادة الفائقة قبل إعادة تعليق الكريات التي تحتوي على الطفيليات في وسط RPMI كامل. أضف خلايا LLC-MK2 في 24 لوحة تحتوي على أغطية مستديرة معقمة بالأشعة فوق البنفسجية واسمح ل &m بالاستقرار لمدة 16 ساعة.ثم لإصابة الخلايا ، أضف مادة فائقة تحتوي على T.Cruzi إلى كل بئر واحتضنها لمدة ست ساعات. بعد ذلك ، اغسل الأغطية التي تحتوي على الخلايا المصابة وغير المصابة خمس مرات باستخدام PBS ، ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 2٪ paraformaldehyde في PBS. بعد 10 دقائق ، اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBS ثم تخلل الأغطية بمنظف غير أيوني لمدة 10 دقائق.بعد ثلاث غسلات PBS لمدة خمس دقائق ، قم باحتضان الأغطية في محلول حجب لمدة 30 دقيقة ، تليها حضانة أخرى لمدة 30 دقيقة إما باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة أو متعدد النسيلة للفأر. بعد غسل PBS ، احتضن الأغطية لمدة 30 دقيقة مع الأجسام المضادة الثانوية في محلول الحجب و phalloidin لتلطيخ خيوط الأكتين في الخلية المضيفة. ثم اغسل الأغطية باستخدام PBS ثلاث مرات مرة أخرى قبل تطبيق كمية صغيرة من كاشف التركيب المضاد للتلاشي مع وسط DAPI على سطح الشريحة.باستخدام الملقط ، قم بإمالة الغطاء برفق في الوسط لمنع تكوين الفقاعة. لوضع العلامات المزدوجة ، بعد احتضان coverslips في محلول الحجب كما هو موضح سابقا ، احتضنها في الجسم المضاد متعدد النسيلة للفأر لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBS قبل احتضانها بالجسم المضاد الثانوي لمدة 30 دقيقة.ثم بعد ثلاث غسلات PBS ، قم بإجراء خطوة حظر ثانية باستخدام AffiniPure rabbit anti-mouse IgG المخفف في محلول الحظر. بعد 30 دقيقة ، اغسل الأغطية باستخدام PBS مرة أخرى قبل احتضانها بالجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، بعد ثلاث غسلات PBS ، احتضن الأغطية باستخدام الأجسام المضادة للماعز المضادة للفأر IgG 2B و phalloidin.ثم بعد ثلاث غسلات PBS ، ضع كاشفا مضادا للتلاشي كما هو موضح سابقا. لوضع العلامات الثلاثية ، بعد حجب coverslips والاحتضان مع الجسم المضاد متعدد النسيلة الفأر ، تليها الأجسام المضادة للماعز المضادة للفأر ، ابدأ حضانة جديدة مع الأجسام المضادة متعددة النسيلة الأرنب في محلول منع لمدة 30 دقيقة. ثم بعد ثلاث غسلات PBS ، احتضن الأغطية بالأجسام المضادة المضادة للأرانب من الماعز لمدة 30 دقيقة.بعد ذلك ، بعد ثلاث غسلات PBS ، قم بإجراء خطوة حجب باستخدام الجسم المضاد المضاد للفأر AffiniPure Rabbit المخفف في محلول الحجب لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل الأغطية مرة أخرى قبل الحضانة بأي جسم مضاد أحادي النسيلة من IgG لمدة 30 دقيقة. بعد ثلاث غسلات PBS ، احتضن الأغطية لمدة 30 دقيقة مع زوج محدد من الأجسام المضادة من فئة الماعز الفرعية IgG المضادة للفأر.بعد الحضانة ، اغسل الأغطية ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBS. تحليل عينات الفلورسنت المناعي باستخدام المجهر البؤري مع هدف غمر الزيت 63X والكشف عن التألق باستخدام أنبوب مضاعف ضوئي وكاشف هجين. ثم احصل على جميع الصور البؤرية ذات القنوات المنفصلة وقم بإجراء معالجة الصور باستخدام Adobe Photoshop.تظهر صور المجهر البؤري هذه نتائج تجارب التحكم للخلايا المصابة وغير المصابة التي تسلط الضوء على خصوصية الأجسام المضادة في الخلية المضيفة والطفيلي الداخلي. تعرف الجسم المضاد متعدد النسيلة للفأر المضاد للتريبانوسوما كروزي FAZ على بروتين T.cruzi العملاق في منطقة تعلق السوط في السوط الطفيلي ، ولكن ليس في الخلية المضيفة. لوحظ توزيع البروتين الريبي النووي النووي غير المتجانس A1 في النوى باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة للفئران التجارية يتعرف فقط على خلايا الثدييات المضيفة ، ولكن ليس الطفيلي.أيضا ، تم تلطيخ نوى المضيف والطفيليات و kinetoplasts الطفيلي مع DAPI والمضيف F-actin ملطخة مع phalloidin مقترنة ب Alexa 594 ، مما يؤكد خصوصية الأجسام المضادة. يظهر التألق المناعي المزدوج العلامات توزيعات البروتين في المضيف والطفيلي الذي تم تحليله بواسطة المجهر البؤري. وأشار وضع العلامات إلى عدم وجود تفاعل متقاطع بين الأجسام المضادة باستخدام هذه المنهجية.باختصار ، يقدم البروتوكول الموصوف هنا لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض تقنية أساسية ومفصلة يمكن تكييفها مع أي مزيج من الأجسام المضادة. هذا النهج يجعل التألق المناعي فعالا من حيث التكلفة ويمكن أن يساعد في دراسة توطين اثنين أو أكثر من البروتينات ذات الأهمية عندما يكون هناك عدد قليل من الأجسام المضادة المتاحة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

فصل واحدة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، والحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، والحمض النووي الريبي من جالية الفيروسية البيئة باستخدام الكروماتوغرافيا هيدروكسيباتيت

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

استخدام نموذج لوصف EpiAirway طويل الأجل المضيف الممرض التفاعلات

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

عزل مزدوج السلبية خلايا T αβ من الكلى

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...