Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) til MMAB, af Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA til MMAB og af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - finanskode 001. CG-C modtaget en master og ph.d.-stipendium fra CAPES og LAMT-S modtaget ph.d.-stipendium fra CNPq. Vi takker Elizabete R. Milani for konfokal mikroskopi bistand og Dr. Dario Zamboni for at levere LLC-MK2 celler (Ribeirao Preto Medical School, USP).

1. Celle- og parasitkulturer
<ol><li>Grow LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) celler fra American Type Culture Collection (CCL-7) i en 25 cm2 cellekultur kolbe indeholdende i RPMI medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS (Fosterkvæg Serum) og antibiotika (100 U / mL Penicillin og 100 μg / mL Streptomycin) ved 37 °C i 5% CO2 17.</li>
	<li>Inficere LLC-MK2 celler med Trypanosoma cruzi (Y stamme) i henhold til en tidligere protokol 18</...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+natural+antibodies.">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

Her præsenterer vi en protokol til at udføre dobbelt immunmærkning i Trypanosoma cruzi inficerede celler ved hjælp af to forskellige antistoffer fra samme værtsart. For at studere, med flere detaljer, konsekvenserne af infektionen, strukturer i værtscellen såsom kernen eller cytosolic organeller kan mærkes ved hjælp af denne protokol. Det kan også bruges i den post-integrering af tynde sektion immunogold mærkning metode. Denne tilgang hjælper med at overvinde forhindringen for at have få antistoffer...

At studere samspillet mellem patogenet med værtscellen på celleniveau giver vigtige oplysninger om de underliggende årsager til sygdommen, da forskellige grupper, såsom vira, bakterier og protozoer, kan inficere de fleste værtscelletyper1,2,3,4. Det kan også hjælpe med at udvikle og identificere potentielle terapeutiske mål, der kan bremse eller hæmme væksten af patogenet. Under levende forhold er de producerede antistoffer ansvarlige for at genkende selvkomponenter, antigener fra vira, bakteriekomponenter eller produkter, svampe, parasitter og andre5.
Til dette formål er antistoffer meget anvendte værktøjer, hovedsagelig til at forstå placeringen og funktionen af cellulære strukturer og proteiner. Flere undersøgelser ved hjælp af flere antistofmærkninger viser, at yderligere blokeringstrin bidrager til immunolokaliseringens specificitet. Derudover bruger de fleste beskrevne protokoller specifikke kommercielle monoklonale antistoffer, herunder antistoffer fra samme værtsart6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Normalt bruger dobbelt mærkning immunofluorescence to antistoffer rejst i forskellige arter til at plette cellestrukturerne af interesse eller patogenerne og værtscellerne for at se samspillet mellem dem. Dette kan dog være et problem, når der ikke er nogen kommercielle monoklonale eller polyklonale antistoffer, der er specifikke for nogle patogener, til rådighed til at udføre dobbeltmærkningen. Der er også kommercielt tilgængelige antistofbøjningssæt, og det er muligt at konjugere de primære antistoffer direkte til fluorophoren ved en kortfattet esterreaktion15. Problemet er, at disse kits ofte er dyre, og det er nødvendigt at have nok antistoffer til at mærke dem. Ved at vide dette udviklede vi med succes en dobbelt immunfluorescencemetode ved hjælp af to forskellige antistoffer rejst i samme art for at studere protein localization i Trypanosoma brucei16. Men for intracellulære parasitter, herunder Trypanosoma cruzi, er denne tilgang ikke blevet påvist. Her viser vi, hvordan man udfører dobbelt mærkning immunfluorescence at studere intracellulære T. cruzi parasitter og værtscellen ved hjælp af primære antistoffer rejst i samme art uden krydsreaktioner. Ud over denne metode er der etableret en tredobbelt immunofluorescencemærkning med tilsætning af det tredje antistof fra en anden art. Disse tilgange hjælper, når kilden til antistoffer er begrænset og kan bruges i enhver celletype.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

I dag er det muligt at finde en bred vifte af molekylære værktøjer til rådighed til at studere parasit-værtscelleinteraktioner. Der er dog nogle begrænsninger for at opnå kommercielle monoklonale eller polyklonale antistoffer, der genkender specifikke cellestrukturer og proteiner i parasitter. Desuden er der få kommercielle antistoffer til rådighed til at mærke trypanosomatider. Normalt fremstilles polyklonale antistoffer mod parasitter internt og kan være mere udfordrende at bruge i kombination med andre antistoffer, der produceres i samme art. Her viser protokollen, hvordan man bruger polyklonale og monoklonale antistoffer rejst i samme art til at udføre dobbelt mærkning immunofluorescence at studere værtscelle og patogen interaktioner. For at opnå dobbelt mærkning immunofluorescence, er det afgørende at inkubere først musen polyklonale antistof og derefter følge inkubationen med den sekundære mus IgG antistof konjugeret til fluorochrome. Derefter er et ekstra blokeringstrin nødvendigt for at forhindre, at ethvert spor af det primære antistof genkendes af det næste sekundære antistof. Derefter tilsættes et musemonolonalt antistof og dets specifikke IgG subklasse sekundære antistof, der er konjugeret til et andet fluorkrom, til prøven på de relevante tidspunkter. Derudover er det muligt at udføre tredobbelt mærkning immunfluorescence ved hjælp af et tredje antistof rejst i en anden art. Også strukturer som kerner og actin kan farves efterfølgende med deres specifikke forbindelser eller etiketter. Således kan disse tilgange, der præsenteres her, justeres for enhver celle, hvis kilder til primære antistoffer er begrænsede.

Her viser vi, hvordan man studerer værtsparasitinteraktioner ved immunfluorescence, når kilden til antistoffer er begrænset på grund af manglende adgang til kommercielle antistoffer, der genkender specifikke strukturer og proteiner i trypanosomatider.
Blandt trypanosomatider har T. cruzi en af de mest komplekse livscyklusser, der involverer forskellige udviklingsstadier mellem hvirveldyr og hvirvelløse værter 19. Under T. cruzi livscyklus, på et...

Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Her beskriver protokollen, hvordan man udfører dobbelt mærkning immunofluorescence ved hjælp af primære antistoffer rejst i samme art for at studere værtspatogeninteraktioner. Det kan også omfatte det tredje antistof fra en anden vært i denne protokol. Denne tilgang kan foretages i enhver celletype og patogener.

Dobbelt mærkning immunofluorescence ved hjælp af antistoffer fra samme art til at studere Host-Patogen interaktioner

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

I denne protokol kan to antistoffer fra samme vært bruges sammen i immunofluorescence assay til at studere værtscelle- og patogeninteraktioner. Da der kun er få kommercielle antistoffer til rådighed til at genkende specifikke cellestrukturer og proteiner i parasitter, kan denne protokol være meget nyttig. Dette er en let at udføre dobbelt-mærkning immunofluorescence protokol, der bruger polyklonale og monoklonale antistoffer rejst i samme art.Mange forskere kan være uvidende om, at dette er muligt. Denne tilgang hjælper, når kilden til antistoffer er begrænset. Det kan bruges til at opdage patogenerne i værtscelleproteinerne i inficerede værtsceller og kan også anvendes på frie levende organismer.Dette er en simpel protokol, kræver et blokerende trin mellem det første og andet par antistoffer. Proceduren vil blive demonstreret af Dr.Camila Gachet-Castro og ph.d.-studerende Lays Trajano-Silva fra mit laboratorium. Tre dage efter at inficere LLC-MK2 celler med Trypanosoma cruzi, indsamle supernatant fra de inficerede celler i en 15 milliliter celle kultur konisk rør.Centrifuge prøven til lavere cellerester, derefter placere røret ved stuetemperatur for at tillade trypomastigotes at svømme til supernatanten. Efter 10 minutter opsamles supernatanten i et nyt konisk rør, prøven centrifugeres derefter og kasserer supernatanten, før pelleten, der indeholder parasitterne, kasseres i komplet RPMI-medium. Tilføj LLC-MK2 celler i 24-brønd plader, der indeholder UV steriliseret afrundede coverslips og lad &m at bosætte sig i 16 timer.Derefter for at inficere cellerne, tilsæt supernatant indeholdende T.Cruzi til hver brønd og inkubere i seks timer. Vask derefter coverlips indeholdende de inficerede og ikke-inficerede celler fem gange med PBS, og fastgør derefter cellerne med 2% paraformaldehyd i PBS. Efter 10 minutter vaskes dækslerne tre gange i fem minutter hver med PBS og gennemtræng derefter dækslerne med ikke-ionisk vaskemiddel i 10 minutter.Efter tre fem minutters PBS-vask inkuberes dækslerne i blokeringsopløsningen i 30 minutter efterfulgt af yderligere 30-minutters inkubation med enten et musemonolonalt eller polyklonalt antistof. Efter PBS vasker, inkuberes coverlips i 30 minutter med sekundært antistof i blokeringsopløsning og phalloidin for at plette actin filamenter i værtscellen. Vask derefter coverlips med PBS tre gange igen, før du anvender en lille mængde anti-fade montering reagens med DAPI medium til overfladen af diaset.Brug sammentrerne, vip forsigtigt dækslerne i mediet for at forhindre bobledannelse. Ved dobbelt mærkning inkuberes de i musepolonalantistof i 30 minutter efter inkubation af dækslerne i blokeringsopløsningen som tidligere påvist. Vask derefter coverlips tre gange i fem minutter hver med PBS, før du inkuberer dem med det sekundære antistof i 30 minutter.Derefter efter tre PBS vasker, udføre en anden blokering trin med AffiniPure kanin anti-mus IgG fortyndet i blokerende opløsning. Efter 30 minutter vaskes coverlips med PBS igen, før du inkuberer dem med musens monoklonale antistof i yderligere 30 minutter. Dernæst, efter tre PBS vasker, inkubere coverlips med ged anti-mus IgG 2B antistof og fallloidin.Derefter efter tre PBS vasker, anvende anti-fade montering reagens som påvist tidligere. Til tredobbelt mærkning, efter blokering af dæksler og inkubation med musens polyklonale antistof, efterfulgt af gede anti-mus antistof, skal du starte en ny inkubation med kaninpolonal antistof i blokeringsopløsning i 30 minutter. Derefter efter tre PBS vasker, inkubere coverlips med ged anti-kanin antistof i 30 minutter.Derefter, efter tre PBS vasker, udføre en blokering skridt med AffiniPure kanin anti-mus antistof fortyndet i blokering opløsning i 30 minutter. Vask derefter coverlips igen, før du inkuberer med mus monoklonale IgG subklasse antistof i 30 minutter. Efter tre PBS-vasker inkuberes coverlips i 30 minutter med et bestemt par gede anti-mus IgG-underklasseantistoffer.Efter inkubation vaskes dækslerne tre gange i fem minutter hver med PBS. Analyser immunfluorescent prøver ved hjælp af et konfokalt mikroskop med en 63X olie nedsænkning mål og opdage fluorescens med en fotomultiplier rør og hybrid detektor. Derefter erhverve alle confocal billeder med adskilte kanaler og udføre billedbehandling ved hjælp af Adobe Photoshop.Disse konfokale mikroskopibilleder viser resultater med kontrolforsøg af inficerede og ikke-inficerede celler, der fremhæver specificiteten af antistofferne i værtscellen og den internaliserede parasit. Musen polyklonale antistof anti-Trypanosoma cruzi FAZ anerkendt T.cruzi kæmpe protein i flagellum vedhæftet fil zone på parasitten flagellum, men ikke i værtscellen. Distribution af det heterogene nukleare ribonucleoprotein A1 i kernerne blev observeret ved hjælp af et kommercielt musemonolonalt antistof, der kun genkender værtspattedyrcellerne, men ikke parasitten.Værten og parasitkernerne og parasitten kinetoplasts blev også farvet med DAPI, og værten F-actin blev farvet med fallloidin konjugeret til Alexa 594, hvilket bekræftede antistoffernes specificitet. Dobbeltmærkning immunfluorescence viser proteinfordelinger i værten og parasitten analyseret af konfokal mikroskopi. Mærkningen antydede ingen krydsreaktion mellem antistoffer ved hjælp af denne metode.Sammenfattende præsenterer den protokol, der er beskrevet her for at studere værtspatogeninteraktioner, en grundlæggende og udførlig teknik, der kan tilpasses enhver kombination af antistoffer. Denne tilgang gør immunofluorescence omkostningseffektiv og kan hjælpe med at studere lokalisering af to eller flere proteiner af interesse, når få antistoffer er tilgængelige.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ tilgang til at karakterisere Landskab værtspatogene protein-protein interaktioner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging inlc Sekretion at undersøge Cellular Infektion med bakteriepatogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolering af Double Negative αβ T-celler fra nyren

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Anvendelse af<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; For at studere autofagi-Cytoskeleton interaktioner

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse af Vedhæftning Under Shear Stress for Studiet af T-lymfocyt-adhæsionsmolekyle Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering af vært-patogen svar og Vaccine effekt i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menneskelige Colonoid encellelag at studere samspillet mellem patogener, latente og vært intestinale epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...