Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) aan MMAB, door Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA aan MMAB en door Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - financieringscode 001. CG-C ontving een master- en doctoraatsbeurs van CAPES en LAMT-S ontving een doctoraatsbeurs van CNPq. We bedanken Elizabete R. Milani voor confocale microscopie-assistentie en Dr. Dario Zamboni voor het leveren van LLC-MK2-cellen (Ribeirao Preto Medical School, USP).

1. Cel- en parasietculturen
<ol><li>Kweek LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) cellen uit de American Type Culture Collection (CCL-7) in een celkweekkolf van 25 cm2 met in RPMI medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS (Fetal Bovine Serum) en antibiotica (100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) bij 37 °C in 5% CO2 17.</li>
	<li>Infecteer LLC-MK2 cellen met Trypanosoma cruzi (Y stam) volgens een eerder protocol 18.</...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+natural+antibodies.">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

Hier presenteren we een protocol om dubbele immunolabeling uit te voeren in trypanosoma cruzi geïnfecteerde cellen met behulp van twee verschillende antilichamen van dezelfde gastheersoort. Om, met meer detail, de implicaties van de infectie te bestuderen, kunnen structuren in de gastheercel zoals de kern of cytosolische organellen worden gelabeld met behulp van dit protocol. Het kan ook worden gebruikt in de post-embedding dunne sectie immunogold labeling methode. Deze aanpak helpt om het obstakel te overwinne...

Het bestuderen van de interactie van de ziekteverwekker met de gastheercel op cellulair niveau biedt essentiële informatie over de onderliggende oorzaken van de ziekte, aangezien verschillende groepen, zoals virussen, bacteriën en protozoa, de meeste gastheerceltypen kunnen infecteren1,2,3,4. Het kan ook helpen bij het ontwikkelen en identificeren van potentiële therapeutische doelen die de groei van de ziekteverwekker kunnen vertragen of remmen. In levende omstandigheden zijn de geproduceerde antilichamen verantwoordelijk voor het herkennen van zelfcomponenten, antigenen van virussen, bacteriële componenten of producten, schimmels, parasieten en anderen5.
Voor dit doel zijn antilichamen veel gebruikte hulpmiddelen, voornamelijk voor het begrijpen van de locatie en functie van cellulaire structuren en eiwitten. Verschillende studies met behulp van meervoudige antilichaametikettering tonen aan dat extra blokkerende stappen bijdragen aan de specificiteit van de immunolokalisatie. Bovendien gebruiken de meeste beschreven protocollen specifieke commerciële monoklonale antilichamen, waaronder antilichamen van dezelfde gastheersoort6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Gewoonlijk gebruikt dubbele labeling immunofluorescentie twee antilichamen die in verschillende soorten zijn grootgebracht om de celstructuren van belang of de pathogenen en de gastheercellen te kleuren om de interactie tussen hen te zien. Dit kan echter een probleem zijn wanneer er geen commerciële monoklonale of polyklonale antilichamen specifiek voor sommige pathogenen beschikbaar zijn om de dubbele etikettering uit te voeren. Ook zijn er in de handel verkrijgbare antilichaamconjugatiekits en is het mogelijk om de primaire antilichamen rechtstreeks aan de fluorofoor te conjugeren door een succinimidylesterreactie15. Het probleem is dat deze kits vaak duur zijn en dat het noodzakelijk is om voldoende antilichamen te hebben om ze te labelen. Dit wetende, hebben we met succes een dubbele immunofluorescentiemethode ontwikkeld met behulp van twee verschillende antilichamen die in dezelfde soort zijn gekweekt om eiwitlokalisatie in Trypanosoma brucei16 te bestuderen. Voor intracellulaire parasieten, waaronder Trypanosoma cruzi, is deze aanpak echter niet aangetoond. Hier laten we zien hoe dubbele labeling immunofluorescentie kan worden uitgevoerd om intracellulaire T. cruzi-parasieten en de gastheercel te bestuderen met behulp van primaire antilichamen die in dezelfde soort zijn opgewekt zonder kruisreacties. Naast deze methode is een drievoudige immunofluorescentie-etikettering vastgesteld met toevoeging van het derde antilichaam van een andere soort. Deze benaderingen helpen wanneer de bron van antilichamen beperkt is en kunnen in elk celtype worden gebruikt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

Tegenwoordig is het mogelijk om een breed scala aan moleculaire hulpmiddelen te vinden die beschikbaar zijn om parasiet-gastheer celinteracties te bestuderen. Er zijn echter enkele beperkingen om commerciële monoklonale of polyklonale antilichamen te verkrijgen die specifieke celstructuren en eiwitten in parasieten herkennen. Bovendien zijn er weinig commerciële antilichamen beschikbaar om trypanosomatiden te labelen. Meestal worden polyklonale antilichamen tegen parasieten in eigen huis bereid en kunnen ze moeilijker te gebruiken zijn in combinatie met andere antilichamen die in dezelfde soort worden geproduceerd. Hier demonstreert het protocol hoe polyklonale en monoklonale antilichamen die in dezelfde soort zijn gekweekt, kunnen worden gebruikt om dubbele etikettering van immunofluorescentie uit te voeren om gastheercel- en pathogeeninteracties te bestuderen. Om de dubbele labeling immunofluorescentie te bereiken, is het cruciaal om eerst het polyklonale antilichaam van de muis te incuberen en vervolgens de incubatie te volgen met het secundaire muis IgG-antilichaam geconjugeerd aan elk fluorochroom. Daarna is een extra blokkerende stap nodig om te voorkomen dat sporen van het primaire antilichaam worden herkend door het volgende secundaire antilichaam. Vervolgens worden een monoklonaal antilichaam van de muis en zijn specifieke IgG-subklasse secundair antilichaam geconjugeerd aan een ander fluorochroom op de juiste tijdstippen aan het monster toegevoegd. Bovendien is het mogelijk om drievoudige etikettering van immunofluorescentie uit te voeren met behulp van een derde antilichaam dat in een andere soort is opgewekt. Ook kunnen structuren zoals kernen en actine vervolgens worden gekleurd met hun specifieke verbindingen of labels. Deze hier gepresenteerde benaderingen kunnen dus worden aangepast voor elke cel waarvan de bronnen van primaire antilichamen beperkt zijn.

Hier laten we zien hoe gastheer-parasietinteracties door immunofluorescentie kunnen worden bestudeerd wanneer de bron van antilichamen beperkt is vanwege de onbeschikbaarheid van commerciële antilichamen die specifieke structuren en eiwitten in trypanosomatiden herkennen.
Onder trypanosomatiden heeft T. cruzi een van de meest complexe levenscycli met verschillende ontwikkelingsstadia tussen gewervelde en ongewervelde gastheren 19. Tijdens de T. cruzi-leven...

Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Hier beschrijft het protocol hoe dubbele labeling immunofluorescentie kan worden uitgevoerd met behulp van primaire antilichamen die in dezelfde soort zijn grootgebracht om gastheer-pathogeeninteracties te bestuderen. Ook kan het het derde antilichaam van een andere gastheer in dit protocol opnemen. Deze aanpak kan worden gemaakt in elk celtype en pathogenen.

Dubbele etikettering van immunofluorescentie met behulp van antilichamen van dezelfde soort om gastheer-pathogeeninteracties te bestuderen

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

In dit protocol kunnen twee antilichamen van dezelfde gastheer samen worden gebruikt in de immunofluorescentietest om gastheercel- en pathogeeninteracties te bestuderen. Omdat er slechts enkele commerciële antilichamen beschikbaar zijn om specifieke celstructuren en eiwitten in parasieten te herkennen, kan dit protocol zeer nuttig zijn. Dit is een eenvoudig uit te voeren dubbel labelend immunofluorescentieprotocol dat polyklonale en monoklonale antilichamen gebruikt die in dezelfde soort zijn gekweekt.Veel onderzoekers zijn zich er misschien niet van bewust dat dit mogelijk is. Deze aanpak helpt wanneer de bron van antilichamen beperkt is. Het kan worden gebruikt om de pathogenen in de gastheerceleiwitten in geïnfecteerde gastheercellen te detecteren en kan ook worden toegepast op vrije levende organismen.Dit is een eenvoudig protocol, vereist één blokkerende stap tussen het eerste en tweede paar antilichamen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Camila Gachet-Castro en promovendus Lays Trajano-Silva uit mijn laboratorium. Drie dagen na het infecteren van LLC-MK2-cellen met Trypanosoma cruzi, verzamel het supernatant van de geïnfecteerde cellen in een conische buis van 15 milliliter celkweek.Centrifugeer het monster om celresten te verlagen en plaats de buis vervolgens op kamertemperatuur zodat de trypomastigoten naar het supernatant kunnen zwemmen. Verzamel na 10 minuten het supernatant in een nieuwe conische buis, centrifugeer vervolgens het monster en gooi het supernatant weg voordat u de pellet met de parasieten in volledig RPMI-medium resuspendeert. Voeg LLC-MK2-cellen toe in 24-putplaten met UV-gesteriliseerde afgeronde coverslips en laat de & m gedurende 16 uur bezinken.Voeg vervolgens, om de cellen te infecteren, supernatant met T.Cruzi toe aan elke put en incubeer gedurende zes uur. Was vervolgens de coverslips met de geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen vijf keer met PBS en fixeer de cellen vervolgens met 2% paraformaldehyde in PBS. Was na 10 minuten de coverslips drie keer gedurende vijf minuten elk met PBS en permeabiliseer vervolgens de coverslips met niet-ionisch wasmiddel gedurende 10 minuten.Na drie PBS-wasbeurten van vijf minuten incubeer je de coverslips in blokkerende oplossing gedurende 30 minuten, gevolgd door nog eens 30 minuten incubatie met een monoklonaal of polyklonaal antilichaam van de muis. Nadat PBS wast, incubeer de coverslips gedurende 30 minuten met secundair antilichaam in blokkerende oplossing en falloïdine om actinefilamenten in de gastheercel te kleuren. Was vervolgens de coverslips nog drie keer met PBS voordat u een kleine hoeveelheid anti-fade montagereagens met DAPI-medium op het oppervlak van de dia aanbrengt.Gebruik een tang om de coverslip voorzichtig in het medium te kantelen om bubbelvorming te voorkomen. Voor dubbele etikettering, na het incuberen van de coverslips in blokkerende oplossing zoals eerder aangetoond, incubeer ze gedurende 30 minuten in het polyklonale antilichaam van de muis. Was vervolgens de coverslips drie keer gedurende vijf minuten elk met PBS voordat u ze gedurende 30 minuten met het secundaire antilichaam incubeert.Voer vervolgens na drie PBS-wasbeurten een tweede blokkeringsstap uit met AffiniPure konijn anti-muis IgG verdund in blokkerende oplossing. Was de coverslips na 30 minuten opnieuw met PBS voordat u ze nog eens 30 minuten incubeert met het monoklonale antilichaam van de muis. Incubaleer vervolgens na drie PBS-wasbeurten de coverslips met geitenantimuis IgG 2B-antilichaam en falloïdine.Breng vervolgens na drie PBS-wasbeurten anti-fade montagereagens aan zoals eerder is aangetoond. Voor drievoudige etikettering, na het blokkeren van de coverslips en het broeden met het polyklonale antilichaam van de muis, gevolgd door geitenantilichaam tegen muizen, start een nieuwe incubatie met konijn polyklonaal antilichaam in blokkerende oplossing gedurende 30 minuten. Incubeer vervolgens na drie PBS-wasbeurten de dekenslips met geitenantilichaam tegen konijnen gedurende 30 minuten.Voer vervolgens, na drie PBS-wasbeurten, een blokkerende stap uit met AffiniPure konijn anti-muis antilichaam verdund in blokkerende oplossing gedurende 30 minuten. Was vervolgens de dekmantels opnieuw voordat u gedurende 30 minuten broedt met een monoklonaal IgG-subklasse antilichaam van de muis. Na drie PBS-wasbeurten incubeer je de coverslips gedurende 30 minuten met een specifiek paar geitenantimuis IgG-subklasse-antilichamen.Was na de incubatie de deklipjes driemaal gedurende vijf minuten met PBS. Analyseer de immunofluorescente monsters met behulp van een confocale microscoop met een 63X olie-onderdompelingsobjectief en detecteer de fluorescentie met een fotomultiplicatorbuis en hybride detector. Verkrijg vervolgens alle confocale afbeeldingen met gescheiden kanalen en voer beeldverwerking uit met Adobe Photoshop.Deze confocale microscopiebeelden tonen resultaten met de controle-experimenten van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen die de specificiteit van de antilichamen in de gastheercel en de geïnternaliseerde parasiet benadrukken. Het polyklonale antilichaam anti-Trypanosoma cruzi FAZ van muizen herkende het T.cruzi-reuzeneiwit in de flagellumaanhechtingszone bij de parasiet flagellum, maar niet in de gastheercel. Verdeling van het heterogene nucleaire ribonucleoproteïne A1 in de kernen werd waargenomen met behulp van een commercieel monoklonaal antilichaam van muizen dat alleen de gastheer zoogdiercellen herkent, maar niet de parasiet.Ook werden de gastheer- en parasietkernen en de parasiet kinetoplasten gekleurd met DAPI en gastheer F-actine werd gekleurd met falloïdine geconjugeerd aan Alexa 594, wat de specificiteit van de antilichamen bevestigde. Double-labeling immunofluorescentie toont de eiwitverdelingen in de gastheer en de parasiet geanalyseerd door confocale microscopie. De etikettering suggereerde geen kruisreactie tussen antilichamen met behulp van deze methodologie.Samenvattend biedt het hier beschreven protocol om gastheer-pathogeeninteracties te bestuderen een eenvoudige en uitgebreide techniek die kan worden aangepast aan elke combinatie van antilichamen. Deze aanpak maakt immunofluorescentie kosteneffectief en kan helpen bij het bestuderen van de lokalisatie van twee of meer eiwitten van belang wanneer er weinig antilichamen beschikbaar zijn.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Gebruik van de EpiAirway Model voor het karakteriseren van op lange termijn gastheer-pathogeen interacties

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolatie van Double Negative αβ T-cellen uit de nier

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Gebruik van<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menselijke Colonoid Monolayers studie van interacties tussen ziekteverwekkers, Commensals en Host intestinaal epitheel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...