Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) à MMAB, par fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência - FAEPA à MMAB et par Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - code financier 001. CG-C a reçu une bourse de maîtrise et de doctorat de CAPES et LAMT-S a reçu une bourse de doctorat du CNPq. Nous remercions Elizabete R. Milani pour l’assistance en microscopie confocale et le Dr Dario Zamboni pour la fourniture de cellules LLC-MK2 (Ribeirao Preto Medical School, USP).

1. Cultures de cellules et de parasites
<ol><li>Cultiver des cellules LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) de l’American Type Culture Collection (CCL-7) dans une fiole de culture cellulaire de 25 cm2 contenant dans un milieu RPMI complété par 10% de FBS (Sérum Fœtal Bovin) inactivé par la chaleur et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) à 37 °C dans 5% de CO2 17.</li>
	<li>Infecter les cellules LLC-MK2 avec Trypanosoma...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. 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S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer un double immunomarquage dans les cellules infectées par Trypanosoma cruzi en utilisant deux anticorps différents de la même espèce hôte. Pour étudier, avec plus de détails, les implications de l’infection, les structures de la cellule hôte telles que le noyau ou les organites cytosoliques peuvent être étiquetées à l’aide de ce protocole. En outre, il peut être utilisé dans la méthode d’étiquetage immunogold à section mince post-intégratio...

Étudier l’interaction de l’agent pathogène avec la cellule hôte au niveau cellulaire fournit des informations essentielles sur les causes sous-jacentes de la maladie, car différents groupes, tels que les virus, les bactéries et les protozoaires, peuvent infecter la plupart des types de cellules hôtes1,2,3,4. Il peut également aider à développer et à identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui peuvent ralentir ou inhiber la croissance de l’agent pathogène. Dans des conditions de vie, les anticorps produits sont responsables de la reconnaissance des auto-composants, des antigènes des virus, des composants ou produits bactériens, des champignons, des parasites et autres5.
À cette fin, les anticorps sont des outils largement utilisés, principalement pour comprendre l’emplacement et la fonction des structures cellulaires et des protéines. Plusieurs études utilisant le marquage d’anticorps multiples démontrent que des étapes de blocage supplémentaires contribuent à la spécificité de l’immunolocalisation. En outre, la plupart des protocoles décrits utilisent des anticorps monoclonaux commerciaux spécifiques, y compris des anticorps de la même espèce hôte6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Habituellement, l’immunofluorescence à double marquage utilise deux anticorps élevés chez des espèces différentes pour colorer les structures cellulaires d’intérêt ou les agents pathogènes et les cellules hôtes pour voir l’interaction entre eux. Cependant, cela peut être un problème lorsqu’aucun anticorps commercial monoclonal ou polyclonal spécifique à certains agents pathogènes n’est disponible pour effectuer le double marquage. En outre, il existe des kits de conjugaison d’anticorps disponibles dans le commerce, et il est possible de conjuguer les anticorps primaires directement au fluorophore par une réaction d’ester de succinimidyle15. Le problème est que ces kits sont souvent coûteux, et il est nécessaire d’avoir suffisamment d’anticorps pour les étiqueter. Sachant cela, nous avons développé avec succès une méthode de double immunofluorescence utilisant deux anticorps différents élevés dans la même espèce pour étudier la localisation des protéines dans Trypanosoma brucei16. Cependant, pour les parasites intracellulaires, y compris Trypanosoma cruzi, cette approche n’a pas été démontrée. Ici, nous montrons comment effectuer une immunofluorescence à double marquage pour étudier les parasites intracellulaires de T. cruzi et la cellule hôte en utilisant des anticorps primaires élevés chez la même espèce sans réactions croisées. Outre cette méthode, un triple marquage par immunofluorescence a été établi avec l’ajout du troisième anticorps d’une espèce différente. Ces approches aident lorsque la source d’anticorps est limitée et peuvent être utilisées dans n’importe quel type de cellule.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

De nos jours, il est possible de trouver un large éventail d’outils moléculaires disponibles pour étudier les interactions parasite-cellule hôte. Cependant, certaines limites existent pour obtenir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux commerciaux qui reconnaissent des structures cellulaires et des protéines spécifiques chez les parasites. En outre, il existe peu d’anticorps commerciaux disponibles pour marquer les trypanosomatidés. Habituellement, les anticorps polyclonaux contre les parasites sont préparés en interne et pourraient être plus difficiles à utiliser en combinaison avec d’autres anticorps produits chez la même espèce. Ici, le protocole montre comment utiliser des anticorps polyclonaux et monoclonaux élevés chez la même espèce pour effectuer une immunofluorescence à double marquage afin d’étudier les interactions entre les cellules hôtes et les agents pathogènes. Pour obtenir l’immunofluorescence à double marquage, il est crucial d’incuber d’abord l’anticorps polyclonal de la souris, puis de suivre l’incubation avec l’anticorps IgG secondaire de la souris conjugué à n’importe quel fluorochrome. Après cela, une étape de blocage supplémentaire est nécessaire pour empêcher toute trace de l’anticorps primaire d’être reconnue par l’anticorps secondaire suivant. Ensuite, un anticorps monoclonal de souris et son anticorps secondaire spécifique de sous-classe IgG conjugué à un fluorochrome différent sont ajoutés à l’échantillon aux moments appropriés. De plus, il est possible d’effectuer une immunofluorescence à triple marquage à l’aide d’un troisième anticorps élevé chez une espèce différente. En outre, des structures telles que les noyaux et l’actine peuvent être colorées ultérieurement avec leurs composés ou étiquettes spécifiques. Ainsi, ces approches présentées ici peuvent être ajustées pour toute cellule dont les sources d’anticorps primaires sont limitées.

Ici, nous montrons comment étudier les interactions hôte-parasite par immunofluorescence lorsque la source d’anticorps est limitée en raison de l’indisponibilité d’anticorps commerciaux qui reconnaissent des structures et des protéines spécifiques chez les trypanosomatidés.
Parmi les trypanosomatidés, T. cruzi a l’un des cycles de vie les plus complexes impliquant divers stades de développement entre les hôtes vertébrés et invertébrés 19. ...

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Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Ici, le protocole décrit comment effectuer une immunofluorescence à double marquage en utilisant des anticorps primaires élevés chez la même espèce pour étudier les interactions hôte-pathogène. En outre, il peut inclure le troisième anticorps d’un hôte différent dans ce protocole. Cette approche peut être faite dans n’importe quel type de cellule et d’agents pathogènes.

Immunofluorescence à double marquage à l’aide d’anticorps de la même espèce pour étudier les interactions hôte-pathogène

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Dans ce protocole, deux anticorps du même hôte peuvent être utilisés ensemble dans le test d’immunofluorescence pour étudier les interactions entre la cellule hôte et l’agent pathogène. Comme il n’y a que peu d’anticorps commerciaux disponibles pour reconnaître des structures cellulaires et des protéines spécifiques chez les parasites, ce protocole peut être très utile. Il s’agit d’un protocole d’immunofluorescence à double marquage facile à réaliser qui utilise des anticorps polyclonaux et monoclonaux élevés chez la même espèce.De nombreux chercheurs ne savent peut-être pas que c’est possible. Cette approche est utile lorsque la source d’anticorps est limitée. Il peut être utilisé pour détecter les agents pathogènes dans les protéines de la cellule hôte dans les cellules hôtes infectées et peut également être appliqué aux organismes vivants libres.Il s’agit d’un protocole simple, nécessitant une étape de blocage entre la première et la deuxième paire d’anticorps. La procédure sera démontrée par le Dr Camila Gachet-Castro et la doctorante Lays Trajano-Silva de mon laboratoire. Trois jours après avoir infecté les cellules LLC-MK2 avec Trypanosoma cruzi, prélever le surnageant des cellules infectées dans un tube conique de culture cellulaire de 15 millilitres.Centrifuger l’échantillon pour abaisser les débris cellulaires, puis placer le tube à température ambiante pour permettre aux trypomastigotes de nager jusqu’au surnageant. Après 10 minutes, prélever le surnageant dans un nouveau tube conique, puis centrifuger l’échantillon et jeter le surnageant avant de remettre en suspension la pastille contenant les parasites dans un milieu RPMI complet. Ajoutez des cellules LLC-MK2 dans des plaques de 24 puits contenant des couvercles arrondis stérilisés aux UV et laissez le &m se déposer pendant 16 heures.Ensuite, pour infecter les cellules, ajoutez un surnageant contenant du T.Cruzi à chaque puits et incubez pendant six heures. Ensuite, lavez les couvercles contenant les cellules infectées et non infectées cinq fois avec du PBS, puis fixez les cellules avec 2% de paraformaldéhyde dans le PBS. Après 10 minutes, lavez les couvercles trois fois pendant cinq minutes chacun avec du PBS, puis perméabilisez les couvercles avec un détergent non ionique pendant 10 minutes.Après trois lavages PBS de cinq minutes, incuber les couvercles dans une solution bloquante pendant 30 minutes, suivis d’une autre incubation de 30 minutes avec un anticorps monoclonal ou polyclonal de souris. Après le lavage pbS, incuber les couvercles pendant 30 minutes avec un anticorps secondaire en solution bloquante et de la phalloïdine pour tacher les filaments d’actine dans la cellule hôte. Ensuite, lavez à nouveau les couvercles avec du PBS avant d’appliquer une petite quantité de réactif de montage anti-décoloration avec un milieu DAPI sur la surface de la glissière.À l’aide de pinces, inclinez doucement le couvercle dans le milieu pour éviter la formation de bulles. Pour le double marquage, après avoir incubé les couvercles dans une solution bloquante comme démontré précédemment, incubez-les dans l’anticorps polyclonal de la souris pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les couvercles trois fois pendant cinq minutes chacun avec du PBS avant de les incuber avec l’anticorps secondaire pendant 30 minutes.Ensuite, après trois lavages PBS, effectuez une deuxième étape de blocage avec AffiniPure lapin anti-souris IgG dilué dans une solution bloquante. Après 30 minutes, lavez à nouveau les couvercles avec du PBS avant de les incuber avec l’anticorps monoclonal de la souris pendant encore 30 minutes. Ensuite, après trois lavages PBS, incuber les couvercles avec des anticorps IgG 2B anti-souris de chèvre et de la phalloïdine.Ensuite, après trois lavages PBS, appliquez un réactif de montage anti-décoloration comme démontré précédemment. Pour le triple marquage, après avoir bloqué les couvercles et couvé avec l’anticorps polyclonal de souris, suivi d’anticorps anti-souris de chèvre, commencez une nouvelle incubation avec un anticorps polyclonal de lapin en solution bloquante pendant 30 minutes. Ensuite, après trois lavages PBS, incubez les couvercles avec un anticorps anti-lapin de chèvre pendant 30 minutes.Ensuite, après trois lavages PBS, effectuez une étape de blocage avec l’anticorps anti-souris AffiniPure lapin dilué dans une solution bloquante pendant 30 minutes. Ensuite, lavez à nouveau les couvercles avant d’incuber avec un anticorps monoclonal de la sous-classe IgG de souris pendant 30 minutes. Après trois lavages PBS, incuber les couvercles pendant 30 minutes avec une paire spécifique d’anticorps de sous-classe IgG anti-souris de chèvre.Après l’incubation, lavez les couvercles trois fois pendant cinq minutes chacun avec du PBS. Analysez les échantillons immunofluorescents à l’aide d’un microscope confocal avec un objectif d’immersion dans l’huile 63X et détectez la fluorescence avec un tube photomultiplicateur et un détecteur hybride. Ensuite, acquérez toutes les images confocales avec des couches séparées et effectuez le traitement d’image à l’aide d’Adobe Photoshop.Ces images de microscopie confocale montrent des résultats avec les expériences de contrôle de cellules infectées et non infectées mettant en évidence la spécificité des anticorps dans la cellule hôte et le parasite internalisé. L’anticorps polyclonal de souris anti-Trypanosoma cruzi FAZ a reconnu la protéine géante T.cruzi dans la zone d’attachement du flagelle au niveau du flagelle parasite, mais pas dans la cellule hôte. La distribution de la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A1 dans les noyaux a été observée à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris commercial qui ne reconnaît que les cellules de mammifères hôtes, mais pas le parasite.En outre, les noyaux de l’hôte et du parasite et les kinétoplastes du parasite ont été colorés avec du DAPI et la F-actine de l’hôte a été colorée avec de la phalloïdine conjuguée à Alexa 594, confirmant la spécificité des anticorps. L’immunofluorescence à double marquage montre les distributions de protéines chez l’hôte et le parasite analysées par microscopie confocale. Le marquage n’a suggéré aucune réaction croisée entre les anticorps utilisant cette méthodologie.En résumé, le protocole décrit ici pour étudier les interactions hôte-pathogène présente une technique de base et élaborée qui peut être adaptée à n’importe quelle combinaison d’anticorps. Cette approche rend l’immunofluorescence rentable et peut aider à étudier la localisation de deux protéines d’intérêt ou plus lorsque peu d’anticorps sont disponibles.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

L&#39;utilisation d&#39;un piège optique pour l&#39;étude des interactions hôtes pathogènes pour l&#39;imagerie cellulaire dynamique en direct

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Recherche

Immunologie et infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Séparation de l&#39;ADN simple brin, double brin de l&#39;ADN et l&#39;ARN à partir d&#39;un environnement communautaire viral en utilisant chromatographie d&#39;hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

L&#39;utilisation du modèle EpiAirway pour Caractériser long terme Interactions hôte-pathogène

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imagerie RICL sécrétion d&#39;enquêter sur l&#39;infection cellulaire par le pathogène bactérien<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolation de Double Negative αβ cellules T du rein

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Utilisation d&#39;<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Pour étudier les interactions de l&#39;autophagie cytosquelette

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Monocouches de Colonoid humain pour étudier les Interactions entre les pathogènes, germes commensaux et hôte épithélium Intestinal

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...