Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt von fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) an MMAB, von Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA zu MMAB und von Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - Finanzcode 001. CG-C erhielt ein Master- und Promotionsstipendium von CAPES und LAMT-S erhielt ein Promotionsstipendium von CNPq. Wir danken Elizabete R. Milani für die konfokale Mikroskopie-Unterstützung und Dr. Dario Zamboni für die Bereitstellung von LLC-MK2-Zellen (Ribeirao Preto Medical School, USP).

1. Zell- und Parasitenkulturen
<ol><li>Züchten Sie LLC-MK2 -Zellen (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) aus der American Type Culture Collection (CCL-7) in einem 25 cm2 Zellkulturkolben, der in RPMI-Medium enthalten ist, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS (Fetal Bovine Serum) und Antibiotika (100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin) bei 37 ° C in 5% CO2 17.</li>
	<li>Infizieren Sie LLC-MK2-Zellen mit Trypanosoma cruzi (Y-Stamm) gemäß einem früher...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. 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E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

Hier stellen wir ein Protokoll zur Durchführung einer doppelten Immunmarkierung in mit Trypanosoma cruzi infizierten Zellen mit zwei verschiedenen Antikörpern derselben Wirtsspezies vor. Um die Auswirkungen der Infektion genauer zu untersuchen, können Strukturen in der Wirtszelle wie der Zellkern oder zytosolische Organellen mit diesem Protokoll markiert werden. Es kann auch in der Post-Embedding-Dünnschnitt-Immunogold-Markierungsmethode verwendet werden. Dieser Ansatz hilft, das Hindernis zu überwinden, nu...

Die Untersuchung der Interaktion des Erregers mit der Wirtszelle auf zellulärer Ebene liefert wesentliche Informationen über die zugrunde liegenden Ursachen der Krankheit, da verschiedene Gruppen wie Viren, Bakterien und Protozoen die meisten Wirtszelltypen infizieren können1,2,3,4. Es kann auch dazu beitragen, potenzielle therapeutische Ziele zu entwickeln und zu identifizieren, die das Wachstum des Erregers verlangsamen oder hemmen können. Unter Lebensbedingungen sind die produzierten Antikörper für die Erkennung von Selbstkomponenten, Antigenen von Viren, bakteriellen Komponenten oder Produkten, Pilzen, Parasiten und anderen verantwortlich5.
Zu diesem Zweck sind Antikörper weit verbreitete Werkzeuge, hauptsächlich zum Verständnis der Lage und Funktion zellulärer Strukturen und Proteine. Mehrere Studien mit multipler Antikörpermarkierung zeigen, dass zusätzliche Blockierungsschritte zur Spezifität der Immunlokalisierung beitragen. Darüber hinaus verwenden die meisten beschriebenen Protokolle spezifische kommerzielle monoklonale Antikörper, einschließlich Antikörper von derselben Wirtsspezies6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Normalerweise verwendet die Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz zwei Antikörper, die in verschiedenen Spezies aufgezogen werden, um die Zellstrukturen von Interesse oder die Krankheitserreger und die Wirtszellen zu färben, um die Interaktion zwischen ihnen zu sehen. Dies kann jedoch ein Problem sein, wenn keine kommerziellen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper speziell für einige Krankheitserreger zur Verfügung stehen, um die Doppelmarkierung durchzuführen. Außerdem gibt es kommerziell erhältliche Antikörperkonjugationskits, und es ist möglich, die primären Antikörper durch eine Succinimidylesterreaktion direkt an das Fluorophor zu konjugieren15. Das Problem ist, dass diese Kits oft teuer sind und es notwendig ist, genügend Antikörper zu haben, um sie zu markieren. Mit diesem Wissen haben wir erfolgreich eine doppelte Immunfluoreszenzmethode entwickelt, bei der zwei verschiedene Antikörper verwendet werden, die in derselben Spezies gezüchtet wurden, um die Proteinlokalisation in Trypanosoma brucei16 zu untersuchen. Für intrazelluläre Parasiten, einschließlich Trypanosoma cruzi, wurde dieser Ansatz jedoch nicht nachgewiesen. Hier zeigen wir, wie man eine Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz durchführt, um intrazelluläre T. cruzi-Parasiten und die Wirtszelle mit primären Antikörpern zu untersuchen, die in derselben Spezies ohne Kreuzreaktionen aufgezogen wurden. Neben dieser Methode wurde eine dreifache Immunfluoreszenzmarkierung unter Zugabe des dritten Antikörpers einer anderen Spezies etabliert. Diese Ansätze helfen, wenn die Quelle von Antikörpern begrenzt ist und kann in jedem Zelltyp verwendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

Heutzutage ist es möglich, eine breite Palette von molekularen Werkzeugen zu finden, um Parasiten-Wirts-Zell-Interaktionen zu untersuchen. Es bestehen jedoch einige Einschränkungen, um kommerzielle monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erhalten, die spezifische Zellstrukturen und Proteine in Parasiten erkennen. Außerdem gibt es nur wenige kommerzielle Antikörper zur Kennzeichnung von Trypanosomatiden. Normalerweise werden polyklonale Antikörper gegen Parasiten im eigenen Haus hergestellt und könnten in Kombination mit anderen Antikörpern, die in derselben Spezies produziert werden, schwieriger zu verwenden sein. Hier zeigt das Protokoll, wie polyklonale und monoklonale Antikörper, die in derselben Spezies gezüchtet wurden, verwendet werden, um eine Doppeltemarkierung der Immunfluoreszenz durchzuführen, um wirtszell- und pathogeninteraktionen zu untersuchen. Um die doppelmarkierende Immunfluoreszenz zu erreichen, ist es entscheidend, zuerst den polyklonalen Antikörper der Maus zu inkubieren und dann die Inkubation mit dem sekundären Maus-IgG-Antikörper zu verfolgen, der mit einem beliebigen Fluorochrom konjugiert ist. Danach ist ein zusätzlicher Blockierungsschritt notwendig, um zu verhindern, dass spuren des primären Antikörpers vom nächsten sekundären Antikörper erkannt werden. Dann werden ein monoklonaler Maus-Antikörper und sein spezifischer sekundärer IgG-Unterklasse-Antikörper, der an ein anderes Fluorochrom konjugiert ist, zu den geeigneten Zeitpunkten in die Probe gegeben. Darüber hinaus ist es möglich, eine dreifache Markierung der Immunfluoreszenz mit einem dritten Antikörper durchzuführen, der in einer anderen Spezies aufgezogen wurde. Auch Strukturen wie Kerne und Aktin können anschließend mit ihren spezifischen Verbindungen oder Markierungen gefärbt werden. Somit können diese hier vorgestellten Ansätze für jede Zelle angepasst werden, deren Primärantikörperquellen begrenzt sind.

Hier zeigen wir, wie wir Wirt-Parasiten-Interaktionen durch Immunfluoreszenz untersuchen können, wenn die Quelle von Antikörpern aufgrund der Nichtverfügbarkeit kommerzieller Antikörper, die spezifische Strukturen und Proteine in Trypanosomatiden erkennen, begrenzt ist.
Unter den Trypanosomatiden hat T. cruzi einen der komplexesten Lebenszyklen mit verschiedenen Entwicklungsstadien zwischen Wirbeltieren und wirbellosen Wirten 19. Während des Lebenszykl...

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Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Hier beschreibt das Protokoll, wie man eine doppelte Markierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von primären Antikörpern durchführt, die in derselben Spezies aufgezogen wurden, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Es kann auch den dritten Antikörper von einem anderen Wirt in diesem Protokoll enthalten. Dieser Ansatz kann in jedem Zelltyp und Pathogen durchgeführt werden.

Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern derselben Spezies zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

In diesem Protokoll können zwei Antikörper desselben Wirts zusammen im Immunfluoreszenz-Assay verwendet werden, um wirtszell- und pathogeninteraktionen zu untersuchen. Da es nur wenige kommerzielle Antikörper gibt, um spezifische Zellstrukturen und Proteine in Parasiten zu erkennen, kann dieses Protokoll sehr nützlich sein. Dies ist ein einfach durchzuführendes Doppelmarkierungs-Immunfluoreszenzprotokoll, das polyklonale und monoklonale Antikörper verwendet, die in derselben Spezies aufgezogen werden.Viele Forscher sind sich vielleicht nicht bewusst, dass dies möglich ist. Dieser Ansatz hilft, wenn die Quelle der Antikörper begrenzt ist. Es kann verwendet werden, um die Erreger in den Wirtszellproteinen in infizierten Wirtszellen nachzuweisen und kann auch auf freie lebende Organismen angewendet werden.Dies ist ein einfaches Protokoll, das einen Blockierungsschritt zwischen dem ersten und zweiten Antikörperpaar erfordert. Das Verfahren wird von Dr. Camila Gachet-Castro und dem Doktoranden Lays Trajano-Silva aus meinem Labor demonstriert. Sammeln Sie drei Tage nach der Infektion von LLC-MK2-Zellen mit Trypanosoma cruzi den Überstand aus den infizierten Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Zellkulturröhrchen.Zentrifugieren Sie die Probe zu niedrigeren Zelltrümmern und platzieren Sie dann das Röhrchen bei Raumtemperatur, damit die Trypomastigoten zum Überstand schwimmen können. Sammeln Sie nach 10 Minuten den Überstand in einem neuen konischen Röhrchen, zentrifugieren Sie dann die Probe und verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet, das die Parasiten enthält, in vollständigem RPMI-Medium wiederverwenden. Fügen Sie LLC-MK2-Zellen in 24-Well-Platten mit UV-sterilisierten abgerundeten Deckgläsern hinzu und lassen Sie the&m sich 16 Stunden lang niederlassen.Um dann die Zellen zu infizieren, fügen Sie jedem Brunnen einen Überstand hinzu, der T.Cruzi enthält, und inkubieren Sie sechs Stunden lang. Als nächstes waschen Sie die Deckblätter, die die infizierten und nicht infizierten Zellen enthalten, fünfmal mit PBS und fixieren Sie dann die Zellen mit 2% Paraformaldehyd in PBS. Nach 10 Minuten die Deckgläser dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS waschen und dann die Deckgläser 10 Minuten lang mit nichtionischem Reinigungsmittel permeabilisieren.Nach drei fünfminütigen PBS-Waschungen die Deckgläser in Blocklösung für 30 Minuten inkubieren, gefolgt von einer weiteren 30-minütigen Inkubation mit entweder einem monoklonalen oder polyklonalen Maus-Antikörper. Nach dem Waschen von PBS werden die Deckgläser 30 Minuten lang mit sekundären Antikörpern in Blocklösung und Phalloidin inkubiert, um Aktinfilamente in der Wirtszelle zu färben. Waschen Sie dann die Deckgläser noch einmal dreimal mit PBS, bevor Sie eine kleine Menge Anti-Fade-Montagereagenz mit DAPI-Medium auf die Oberfläche des Objektträgers auftragen.Kippen Sie den Deckstab vorsichtig mit einer Pinzette im Medium, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Zur doppelten Markierung werden die Deckgläser nach dem Inkubieren der Deckgläser in Blocklösung, wie zuvor gezeigt, 30 Minuten lang im polyklonalen Antikörper der Maus inkubiert. Als nächstes waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS, bevor Sie sie 30 Minuten lang mit dem sekundären Antikörper inkubieren.Führen Sie dann nach drei PBS-Wäschen einen zweiten Blockierungsschritt mit AffiniPure Kaninchen-Anti-Maus-IgG in Blockierlösung verdünnt durch. Nach 30 Minuten die Deckgläser erneut mit PBS waschen, bevor Sie sie mit dem monoklonalen Maus-Antikörper für weitere 30 Minuten inkubieren. Als nächstes, nach drei PBS-Waschungen, inkubieren Sie die Deckgläser mit Ziegen-Anti-Maus-IgG 2B-Antikörper und Phalloidin.Tragen Sie dann nach drei PBS-Wäschen das Anti-Fade-Montagereagenz auf, wie zuvor gezeigt. Für die dreifache Markierung beginnen Sie nach dem Blockieren der Deckgläser und der Inkubation mit dem polyklonalen Antikörper der Maus, gefolgt von einem Ziegen-Anti-Maus-Antikörper, eine neue Inkubation mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper in Blockierlösung für 30 Minuten. Dann, nach drei PBS-Wäschen, inkubieren Sie die Deckgläser mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper für 30 Minuten.Als nächstes führen Sie nach drei PBS-Waschungen einen Blockierungsschritt mit AffiniPure Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper durch, der in Blockierlösung für 30 Minuten verdünnt ist. Waschen Sie dann die Deckgläser erneut, bevor Sie 30 Minuten lang mit einem monoklonalen IgG-Subklassen-Antikörper der Maus inkubieren. Nach drei PBS-Wäschen die Deckgläser 30 Minuten lang mit einem bestimmten Paar Ziegen-Anti-Maus-IgG-Subklassen-Antikörpern inkubieren.Nach der Inkubation die Deckgläser dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS waschen. Analysieren Sie die immunfluoreszierenden Proben mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv und detektieren Sie die Fluoreszenz mit einem Photomultiplierrohr und einem Hybriddetektor. Erfassen Sie dann alle konfokalen Bilder mit getrennten Kanälen und führen Sie die Bildverarbeitung mit Adobe Photoshop durch.Diese konfokalen Mikroskopiebilder zeigen Ergebnisse mit den Kontrollexperimenten von infizierten und nicht infizierten Zellen, die die Spezifität der Antikörper in der Wirtszelle und des internalisierten Parasiten hervorheben. Der polyklonale Antikörper anti-Trypanosoma cruzi FAZ der Maus erkannte das Riesenprotein T.cruzi in der Flagellum-Attachment-Zone am Parasiten flagellum, nicht aber in der Wirtszelle. Die Verteilung des heterogenen nukleären Ribonukleoproteins A1 in den Kernen wurde mit einem kommerziellen monoklonalen Mausantikörper beobachtet, der nur die Zellen des Wirtssäugetiers, nicht aber den Parasiten erkennt.Auch die Wirts- und Parasitenkerne und die Parasitenkinetoplasten wurden mit DAPI gefärbt und Wirt F-Aktin wurde mit Phalloidin gefärbt, das mit Alexa 594 konjugiert war, was die Spezifität der Antikörper bestätigt. Double-Labeling Immunfluoreszenz zeigt die Proteinverteilungen im Wirt und den Parasiten, die durch konfokale Mikroskopie analysiert werden. Die Markierung deutete auf keine Kreuzreaktion zwischen Antikörpern mit dieser Methodik hin.Zusammenfassend stellt das hier beschriebene Protokoll zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen eine grundlegende und ausgefeilte Technik dar, die an jede Kombination von Antikörpern angepasst werden kann. Dieser Ansatz macht die Immunfluoreszenz kostengünstig und kann helfen, die Lokalisation von zwei oder mehr Proteinen von Interesse zu untersuchen, wenn nur wenige Antikörper verfügbar sind.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...