Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
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इस काम Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) द्वारा MMAB तक समर्थित किया गया था, Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA द्वारा MMAB और Coordenação de Aperfeçoamento de Pessoal de Nível -000 सीजी-सी ने CAPES से एक मास्टर और डॉक्टरेट फैलोशिप प्राप्त की और LAMT-S ने CNPq से डॉक्टरेट फैलोशिप प्राप्त की। हम Confocal माइक्रोस्कोपी सहायता के लिए Elizabete आर मिलानी और LLC-MK2 कोशिकाओं (Ribeirao Preto मेडिकल स्कूल, यूएसपी) प्रदान करने के लिए डॉ Dario Zamboni धन्यवाद.

1. सेल और परजीवी संस्कृतियों
<ol><li>एलएलसी-एमके 2 (रीसस मंकी किडनी एपिथेलियल) कोशिकाओं को अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (सीसीएल -7) से 25 सेमी 2 सेल संस्कृति फ्लास्क में 10% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस (भ्रूण गोज...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+natural+antibodies.">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

यहां, हम एक ही मेजबान प्रजातियों से दो अलग-अलग एंटीबॉडी का उपयोग करके ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी संक्रमित कोशिकाओं में डबल इम्युनोलेबलिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। अध्ययन करने के लिए,...

सेलुलर स्तर पर मेजबान सेल के साथ रोगज़नक़ की बातचीत का अध्ययन करने के लिए रोग के अंतर्निहित कारणों पर आवश्यक जानकारी प्रदान करता है क्योंकि वायरस, बैक्टीरिया और प्रोटोजोआ जैसे विभिन्न समूह, अधिकांश मेजबान सेल प्रकारों को संक्रमित कर सकते हैं1,2,3,4। यह संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को विकसित करने और पहचानने में भी मदद कर सकता है जो रोगज़नक़ के विकास को धीमा या बाधित कर सकते हैं। जीवित परिस्थितियों में, उत्पादित एंटीबॉडी स्व-घटकों, वायरस, जीवाणु घटकों या उत्पादों, कवक, परजीवी और अन्य 5 से एंटीजन को पहचानने के लिए जिम्मेदार हैं।
इस उद्देश्य के लिए, एंटीबॉडी व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं, मुख्य रूप से सेलुलर संरचनाओं और प्रोटीन के स्थान और कार्य को समझने के लिए। एकाधिक एंटीबॉडी लेबलिंग का उपयोग करने वाले कई अध्ययनों से पता चलता है कि अतिरिक्त ब्लॉकिंग चरण इम्युनोलोकलाइजेशन की विशिष्टता में योगदान करते हैं। इसके अलावा, अधिकांश वर्णित प्रोटोकॉल विशिष्ट वाणिज्यिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, जिसमें एक ही मेजबान प्रजातियों के एंटीबॉडी शामिल हैं6,7,8,9,10,11,12,13,14।
आमतौर पर, डबल लेबलिंग इम्युनोफ्लोरेसेंस विभिन्न प्रजातियों में उठाए गए दो एंटीबॉडी का उपयोग ब्याज की कोशिका संरचनाओं या रोगजनकों और मेजबान कोशिकाओं को उनके बीच बातचीत को देखने के लिए दागने के लिए करता है। हालांकि, यह एक समस्या हो सकती है जब कुछ रोगजनकों के लिए विशिष्ट कोई वाणिज्यिक मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी डबल लेबलिंग करने के लिए उपलब्ध नहीं हैं। इसके अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी संयुग्मन किट हैं, और प्राथमिक एंटीबॉडी को सीधे फ्लोरोफोर में एक सुकिनिमिडिल एस्टर प्रतिक्रिया 15 द्वारा संयुग्मित करना संभव है। समस्या यह है कि ये किट अक्सर महंगे होते हैं, और उन्हें लेबल करने के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी होना आवश्यक है। यह जानते हुए, हमने ट्रिपैनोसोमा ब्रूसी 16 में प्रोटीन स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए एक ही प्रजाति में उठाए गए दो अलग-अलग एंटीबॉडी का उपयोग करके सफलतापूर्वक एक डबल इम्युनोफ्लोरेसेंस विधि विकसित की। हालांकि, ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी सहित इंट्रासेल्युलर परजीवी के लिए, इस दृष्टिकोण का प्रदर्शन नहीं किया गया है। यहां, हम दिखाते हैं कि इंट्रासेल्युलर टी क्रूज़ी परजीवी और मेजबान कोशिका का अध्ययन करने के लिए डबल लेबलिंग इम्युनोफ्लोरेसेंस कैसे किया जाए, जो क्रॉस-प्रतिक्रियाओं के बिना एक ही प्रजाति में उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करता है। इस विधि के अलावा, एक ट्रिपल इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग को एक अलग प्रजाति से तीसरे एंटीबॉडी के अलावा स्थापित किया गया है। ये दृष्टिकोण मदद करते हैं जब एंटीबॉडी का स्रोत सीमित होता है और किसी भी सेल प्रकार में उपयोग किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

आजकल, परजीवी-मेजबान सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध आणविक उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला को ढूंढना संभव है। हालांकि, वाणिज्यिक मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी प्राप्त करने के लिए कुछ सीमाएं मौजूद हैं जो परजीवी में विशिष्ट कोशिका संरचनाओं और प्रोटीन को पहचानती हैं। इसके अलावा, ट्रिपैनोसोमैटिड लेबल करने के लिए कुछ वाणिज्यिक एंटीबॉडी उपलब्ध हैं। आमतौर पर, परजीवी के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी को घर में तैयार किया जाता है और एक ही प्रजाति में उत्पादित अन्य एंटीबॉडी के साथ संयोजन में उपयोग करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यहां, प्रोटोकॉल दर्शाता है कि मेजबान सेल और रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए डबल लेबलिंग इम्युनोफ्लोरेसेंस करने के लिए एक ही प्रजाति में उठाए गए पॉलीक्लोनल और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कैसे किया जाए। डबल लेबलिंग immunofluorescence प्राप्त करने के लिए, पहले माउस polyclonal एंटीबॉडी incubate और फिर द्वितीयक माउस IgG एंटीबॉडी किसी भी fluorochrome के लिए संयुग्मित के साथ इनक्यूबेशन का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है। उसके बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी के किसी भी निशान को अगले माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पहचाने जाने से रोकने के लिए एक अतिरिक्त अवरुद्ध चरण आवश्यक है। फिर, एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और इसके विशिष्ट आईजीजी उपवर्ग माध्यमिक एंटीबॉडी एक अलग फ्लोरोक्रोम के लिए संयुग्मित उचित समय पर नमूने में जोड़े जाते हैं। इसके अतिरिक्त, एक अलग प्रजाति में उठाए गए तीसरे एंटीबॉडी का उपयोग करके ट्रिपल लेबलिंग इम्युनोफ्लोरेसेंस करना संभव है। इसके अलावा, नाभिक और एक्टिन जैसी संरचनाओं को बाद में उनके विशिष्ट यौगिकों या लेबल के साथ दाग दिया जा सकता है। इस प्रकार, यहां प्रस्तुत इन दृष्टिकोणों को किसी भी सेल के लिए समायोजित किया जा सकता है जिसके प्राथमिक एंटीबॉडी के स्रोत सीमित हैं।

यहां, हम दिखाते हैं कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा मेजबान-परजीवी इंटरैक्शन का अध्ययन कैसे किया जाए जब एंटीबॉडी का स्रोत वाणिज्यिक एंटीबॉडी की अनुपलब्धता के कारण सीमित होता है जो ट्रिपैनोसोमाटिड्स में...

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Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

यहां, प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक ही प्रजाति में उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके डबल लेबलिंग इम्युनोफ्लोरेसेंस कैसे किया जाए। इसके अलावा, यह इस प्रोटोकॉल में एक अलग मेजबान से तीसरे एंटीबॉडी को शामिल कर सकता है। यह दृष्टिकोण किसी भी सेल प्रकार और रोगजनकों में किया जा सकता है।

डबल लेबलिंग Immunofluorescence मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक ही प्रजाति से एंटीबॉडी का उपयोग कर

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

इस प्रोटोकॉल में, एक ही मेजबान से दो एंटीबॉडी एक साथ immunofluorescence परख में इस्तेमाल किया जा सकता है मेजबान सेल और रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए. चूंकि परजीवी में विशिष्ट कोशिका संरचनाओं और प्रोटीन को पहचानने के लिए केवल कुछ वाणिज्यिक एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, इसलिए यह प्रोटोकॉल बहुत उपयोगी हो सकता है। यह एक आसान-से-प्रदर्शन डबल-लेबलिंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल है जो एक ही प्रजाति में उठाए गए पॉलीक्लोनल और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करता है।कई शोधकर्ता इस बात से अनजान हो सकते हैं कि यह संभव है। यह दृष्टिकोण मदद करता है जब एंटीबॉडी का स्रोत सीमित होता है। इसका उपयोग संक्रमित मेजबान कोशिकाओं में मेजबान सेल प्रोटीन में रोगजनकों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है और मुक्त जीवित जीवों पर भी लागू किया जा सकता है।यह एक सरल प्रोटोकॉल है, एंटीबॉडी की पहली और दूसरी जोड़ी के बीच एक अवरुद्ध चरण की आवश्यकता होती है। इस प्रक्रिया को डॉ कैमिला गाचेत-कास्त्रो और पीएचडी छात्र लेस ट्रेजानो-सिल्वा द्वारा मेरी प्रयोगशाला से प्रदर्शित किया जाएगा। ट्रिपैनोसोमा क्रूजी के साथ एलएलसी-एमके 2 कोशिकाओं को संक्रमित करने के तीन दिन बाद, 15 मिलीलीटर सेल संस्कृति शंक्वाकार ट्यूब में संक्रमित कोशिकाओं से supernatant एकत्र करें।सेल मलबे को कम करने के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर कमरे के तापमान पर ट्यूब को रखें ताकि ट्राइपोमस्टिगोट्स को सुपरनेटेंट में तैरने की अनुमति मिल सके। 10 मिनट के बाद, एक नई शंक्वाकार ट्यूब में supernatant इकट्ठा, फिर नमूने centrifuge और पूर्ण RPMI माध्यम में परजीवी युक्त गोली resuspending से पहले supernatant त्याग. यूवी निष्फल गोल कवरलिप्स युक्त 24-अच्छी तरह से प्लेटों में एलएलसी-एमके 2 कोशिकाओं को जोड़ें और एंड एम को 16 घंटे के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।फिर कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से टी.क्रूज़ी युक्त supernatant जोड़ें और छह घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद, पीबीएस के साथ संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं वाले कवरलिप्स को पांच बार धोएं, फिर पीबीएस में 2% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। 10 मिनट के बाद, पीबीएस के साथ पांच मिनट के लिए कवरलिप्स को तीन बार धोएं और फिर 10 मिनट के लिए गैर-आयनिक डिटर्जेंट के साथ कवरलिप्स को पार कर लें।तीन पांच मिनट पीबीएस धोने के बाद, 30 मिनट के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में कवरलिप्स को इनक्यूबेट करें, इसके बाद माउस मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक और 30 मिनट का इनक्यूबेशन। पीबीएस धोने के बाद, मेजबान सेल में एक्टिन फिलामेंट्स को दागने के लिए समाधान और फेलोइडिन को अवरुद्ध करने में द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ 30 मिनट के लिए कवरलिप्स को इनक्यूबेट करें। फिर स्लाइड की सतह पर DAPI माध्यम के साथ एंटी-फीका बढ़ते अभिकर्मक की एक छोटी राशि को लागू करने से पहले पीबीएस के साथ कवरलिप्स को तीन बार फिर से धोलें।संदंश का उपयोग करते हुए, धीरे से बुलबुले के गठन को रोकने के लिए माध्यम में कवरस्लिप को झुकाएं। डबल लेबलिंग के लिए, पहले प्रदर्शित के रूप में अवरुद्ध समाधान में coverslips incubating के बाद, उन्हें माउस polyclonal एंटीबॉडी में 30 मिनट के लिए incubate. इसके बाद, 30 मिनट के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ उन्हें इनक्यूबेट करने से पहले पीबीएस के साथ पांच मिनट के लिए कवरलिप्स को तीन बार धोएं।फिर तीन पीबीएस धोने के बाद, AffiniPure खरगोश विरोधी माउस IgG अवरुद्ध समाधान में पतला के साथ एक दूसरा अवरुद्ध कदम प्रदर्शन. 30 मिनट के बाद, एक और 30 मिनट के लिए माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ incubating से पहले पीबीएस के साथ कवरलिप्स को फिर से धोलें। इसके बाद, तीन पीबीएस धोने के बाद, बकरी विरोधी माउस IgG 2B एंटीबॉडी और phalloidin के साथ coverslips incubate.फिर तीन पीबीएस धोने के बाद, एंटी-फीका बढ़ते अभिकर्मक लागू करें जैसा कि पहले दिखाया गया था। ट्रिपल लेबलिंग के लिए, माउस पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ कवरलिप्स को अवरुद्ध करने और इनक्यूबेट करने के बाद, बकरी एंटी-माउस एंटीबॉडी के बाद, 30 मिनट के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक नया इनक्यूबेशन शुरू करें। फिर तीन पीबीएस धोने के बाद, 30 मिनट के लिए बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के साथ coverslips incubate।इसके बाद, तीन पीबीएस धोने के बाद, 30 मिनट के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में पतला AffiniPure खरगोश विरोधी माउस एंटीबॉडी के साथ एक अवरुद्ध कदम प्रदर्शन। फिर 30 मिनट के लिए किसी भी माउस मोनोक्लोनल आईजीजी सबक्लास एंटीबॉडी के साथ incubating से पहले कवरलिप्स को फिर से धोलें। तीन पीबीएस धोने के बाद, बकरी विरोधी माउस IgG subclass एंटीबॉडी की एक विशिष्ट जोड़ी के साथ 30 मिनट के लिए coverslips incubate.इनक्यूबेशन बाद, पीबीएस के साथ पांच मिनट के लिए कवरलिप्स को तीन बार धोएं। एक 63X तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर immunofluorescent नमूनों का विश्लेषण और एक photomultiplier ट्यूब और हाइब्रिड डिटेक्टर के साथ प्रतिदीप्ति का पता लगाने. फिर अलग किए गए चैनलों के साथ सभी confocal छवियों को प्राप्त करें और एडोब फ़ोटोशॉप का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण करें।ये कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं के नियंत्रण प्रयोगों के साथ परिणाम दिखाती हैं जो मेजबान सेल और आंतरिक परजीवी में एंटीबॉडी की विशिष्टता को उजागर करती हैं। माउस polyclonal एंटीबॉडी विरोधी ट्रिपैनोसोमा cruzi FAZ परजीवी flagellum पर flagellum अनुलग्नक क्षेत्र में T.cruzi विशाल प्रोटीन को मान्यता दी, लेकिन मेजबान सेल में नहीं. नाभिक में विषम परमाणु राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन ए 1 का वितरण एक वाणिज्यिक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके देखा गया था जो केवल मेजबान स्तनधारी कोशिकाओं को पहचानता है, लेकिन परजीवी को नहीं।इसके अलावा, मेजबान और परजीवी नाभिक और परजीवी किनेटोप्लास्ट को डीएपीआई के साथ दाग दिया गया था और मेजबान एफ-एक्टिन को एलेक्सा 594 में संयुग्मित फेलोइडिन के साथ दाग दिया गया था, जो एंटीबॉडी की विशिष्टता की पुष्टि करता है। डबल-लेबलिंग immunofluorescence मेजबान और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण परजीवी में प्रोटीन वितरण से पता चलता है। लेबलिंग ने इस पद्धति का उपयोग करके एंटीबॉडी के बीच कोई क्रॉस-प्रतिक्रिया नहीं का सुझाव दिया।संक्षेप में, मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक बुनियादी और विस्तृत तकनीक प्रस्तुत करता है जिसे एंटीबॉडी के किसी भी संयोजन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण immunofluorescence लागत प्रभावी बनाता है और कुछ एंटीबॉडी उपलब्ध होने पर ब्याज के दो या अधिक प्रोटीन के स्थानीयकरण का अध्ययन करने में मदद कर सकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

गतिशील लाइव सेल इमेजिंग के लिए मेजबान पैथोजन सहभागिता के अध्ययन के लिए एक ऑप्टिकल जाल का प्रयोग करें

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

एक पर्यावरण वायरल Hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी का प्रयोग समुदाय से एकल असहाय डीएनए डबल असहाय डीएनए और आरएनए के पृथक्करण

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

लंबे समय तक मेजबान रोगज़नक़ सहभागिता निस्र्पक के लिए EpiAirway मॉडल का उपयोग

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

मेजबान पैथोजन प्रोटीन से प्रोटीन सहभागिता के लैंडस्केप विशेषताएँ एक तुलनात्मक दृष्टिकोण

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा सेलुलर संक्रमण की जांच करने के लिए InlC स्राव इमेजिंग<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

गुर्दे से डबल नकारात्मक αβ टी कोशिकाओं के अलगाव

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

का प्रयोग करें<em&gt; शिगेला flexneri</em&gt; भोजी-cytoskeleton बातचीत का अध्ययन

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

टी लिम्फोसाइट-आसंजन अणु बातचीत का अध्ययन के लिए आसंजन के तहत कतरनी तनाव की परख

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

चूहों में मेजबान-रोगज़नक़ प्रतिक्रियाओं और वैक्सीन प्रभावकारिता का मूल्यांकन

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

मानव कोलोनॉइड Monolayers रोगजनकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, Commensals, और मेजबान आंत्र उपकला

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...