Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) alla MMAB, dalla Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA alla MMAB e dalla Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - codice finanziario 001. CG-C ha ricevuto un master e una borsa di dottorato da CAPES e LAMT-S ha ricevuto una borsa di dottorato da CNPq. Ringraziamo Elizabete R. Milani per l'assistenza alla microscopia confocale e il Dr. Dario Zamboni per aver fornito cellule LLC-MK2 (Ribeirao Preto Medical School, USP).

1. Colture cellulari e parassitarie
<ol><li>Coltiva cellule LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) dell'American Type Culture Collection (CCL-7) in un pallone di coltura cellulare di 25 cm2 contenente in mezzo RPMI integrato con il 10% di FBS (fetale bovino sierico) e antibiotici inattivati dal calore (100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina) a 37 ° C nel 5% di CO2 17.</li>
	<li>Infettare le cellule LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi (ceppo Y) seco...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. 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S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire la doppia immunolabeling nelle cellule infette da Trypanosoma cruzi utilizzando due diversi anticorpi della stessa specie ospite. Per studiare, con maggiori dettagli, le implicazioni dell'infezione, le strutture nella cellula ospite come il nucleo o gli organelli citosolici possono essere etichettate utilizzando questo protocollo. Inoltre, può essere utilizzato nel metodo di etichettatura immunogold a sezione sottile post-incorporamento. Questo approccio aiuta a super...

Studiare l'interazione del patogeno con la cellula ospite a livello cellulare fornisce informazioni essenziali sulle cause alla base della malattia poiché diversi gruppi, come virus, batteri e protozoi, possono infettare la maggior parte dei tipi di cellule ospiti1,2,3,4. Può anche aiutare a sviluppare e identificare potenziali bersagli terapeutici che possono rallentare o inibire la crescita del patogeno. In condizioni vive, gli anticorpi prodotti sono responsabili del riconoscimento di autocomponenti, antigeni da virus, componenti o prodotti batterici, funghi, parassiti e altri5.
A tale scopo, gli anticorpi sono strumenti ampiamente utilizzati, principalmente per comprendere la posizione e la funzione delle strutture cellulari e delle proteine. Diversi studi che utilizzano l'etichettatura multipla degli anticorpi dimostrano che ulteriori fasi di blocco contribuiscono alla specificità dell'immunolocalizzazione. Inoltre, la maggior parte dei protocolli descritti utilizza anticorpi monoclonali commerciali specifici, inclusi anticorpi della stessa specie ospite6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Di solito, l'immunofluorescenza a doppia etichettatura utilizza due anticorpi allevati in specie diverse per macchiare le strutture cellulari di interesse o i patogeni e le cellule ospiti per vedere l'interazione tra di loro. Tuttavia, questo può essere un problema quando non sono disponibili anticorpi commerciali monoclonali o policlonali specifici per alcuni agenti patogeni per eseguire la doppia etichettatura. Inoltre, esistono kit di coniugazione anticorpale disponibili in commercio ed è possibile coniugare gli anticorpi primari direttamente al fluoroforo mediante una reazione di estere succinimidile15. Il problema è che questi kit sono spesso costosi ed è necessario avere abbastanza anticorpi per etichettarli. Sapendo questo, abbiamo sviluppato con successo un metodo di doppia immunofluorescenza utilizzando due diversi anticorpi allevati nella stessa specie per studiare la localizzazione delle proteine nel Trypanosoma brucei16. Tuttavia, per i parassiti intracellulari, tra cui Trypanosoma cruzi, questo approccio non è stato dimostrato. Qui, mostriamo come eseguire l'immunofluorescenza a doppia marcatura per studiare i parassiti intracellulari di T. cruzi e la cellula ospite utilizzando anticorpi primari allevati nella stessa specie senza reazioni crociate. Oltre a questo metodo, è stata stabilita una tripla etichettatura di immunofluorescenza con l'aggiunta del terzo anticorpo di una specie diversa. Questi approcci aiutano quando la fonte di anticorpi è limitata e può essere utilizzata in qualsiasi tipo di cellula.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

Al giorno d'oggi, è possibile trovare una vasta gamma di strumenti molecolari disponibili per studiare le interazioni parassita-cellula ospite. Tuttavia, esistono alcune limitazioni per ottenere anticorpi commerciali monoclonali o policlonali che riconoscono specifiche strutture cellulari e proteine nei parassiti. Inoltre, ci sono pochi anticorpi commerciali disponibili per etichettare i tripanosomatidi. Di solito, gli anticorpi policlonali contro i parassiti sono preparati internamente e potrebbero essere più difficili da usare in combinazione con altri anticorpi prodotti nella stessa specie. Qui, il protocollo dimostra come utilizzare anticorpi policlonali e monoclonali allevati nella stessa specie per eseguire l'immunofluorescenza a doppia etichettatura per studiare le interazioni tra cellule ospiti e patogeni. Per ottenere la doppia marcatura immunofluorescenza, è fondamentale incubare prima l'anticorpo policlonale di topo e poi seguire l'incubazione con l'anticorpo secondario IgG di topo coniugato a qualsiasi fluorocromo. Successivamente, è necessaria un'ulteriore fase di blocco per evitare che qualsiasi traccia dell'anticorpo primario venga riconosciuta dall'anticorpo secondario successivo. Quindi, un anticorpo monoclonale di topo e il suo specifico anticorpo secondario della sottoclasse IgG coniugato a un fluorocromo diverso vengono aggiunti al campione nei momenti appropriati. Inoltre, è possibile eseguire l'immunofluorescenza a tripla marcatura utilizzando un terzo anticorpo allevato in una specie diversa. Inoltre, strutture come nuclei e actina possono essere colorate successivamente con i loro composti o etichette specifici. Pertanto, questi approcci qui presentati possono essere regolati per qualsiasi cellula le cui fonti di anticorpi primari sono limitate.

Qui, mostriamo come studiare le interazioni ospite-parassita mediante immunofluorescenza quando la fonte di anticorpi è limitata a causa dell'indisponibilità di anticorpi commerciali che riconoscono strutture e proteine specifiche nei tripanosomatidi.
Tra i tripanosomatidi, T. cruzi ha uno dei cicli di vita più complessi che coinvolgono vari stadi di sviluppo tra vertebrati e invertebrati ospiti 19. Durante il ciclo di vita di T. cruzi, in una fase ...

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Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Qui, il protocollo descrive come eseguire l'immunofluorescenza a doppia marcatura utilizzando anticorpi primari allevati nella stessa specie per studiare le interazioni ospite-patogeno. Inoltre, può includere il terzo anticorpo di un ospite diverso in questo protocollo. Questo approccio può essere fatto in qualsiasi tipo di cellula e agenti patogeni.

Immunofluorescenza a doppia marcatura utilizzando anticorpi della stessa specie per studiare le interazioni ospite-patogeno

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

In questo protocollo, due anticorpi dello stesso ospite possono essere utilizzati insieme nel test di immunofluorescenza per studiare le interazioni tra cellule ospiti e patogeni. Poiché ci sono solo pochi anticorpi commerciali disponibili per riconoscere specifiche strutture cellulari e proteine nei parassiti, questo protocollo può essere molto utile. Si tratta di un protocollo di immunofluorescenza a doppia marcatura facile da eseguire che utilizza anticorpi policlonali e monoclonali allevati nella stessa specie.Molti ricercatori potrebbero non essere consapevoli del fatto che questo è possibile. Questo approccio aiuta quando la fonte di anticorpi è limitata. Può essere utilizzato per rilevare gli agenti patogeni nelle proteine delle cellule ospiti nelle cellule ospiti infette e può anche essere applicato agli organismi viventi liberi.Questo è un protocollo semplice, richiede un passaggio di blocco tra la prima e la seconda coppia di anticorpi. La procedura sarà dimostrata dalla dott.ssa Camila Gachet-Castro e dal dottorando Lays Trajano-Silva del mio laboratorio. Tre giorni dopo aver infettato le cellule LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi, raccogliere il surnatante dalle cellule infette in un tubo conico di coltura cellulare da 15 millilitri.Centrifugare il campione per abbassare i detriti cellulari, quindi posizionare il tubo a temperatura ambiente per consentire ai tripomastitonoti di nuotare verso il surnatante. Dopo 10 minuti, raccogliere il surnatante in un nuovo tubo conico, quindi centrifugare il campione e scartare il surnatante prima di rispendere il pellet contenente i parassiti in mezzo RPMI completo. Aggiungere le celle LLC-MK2 in piastre a 24 pozzetti contenenti coverslip arrotondati sterilizzati UV e lasciare che l&m si depositi per 16 ore.Quindi, per infettare le cellule, aggiungere il surnatante contenente T.Cruzi a ciascun pozzetto e incubare per sei ore. Quindi, lavare le coperture contenenti le cellule infette e non infette cinque volte con PBS, quindi fissare le cellule con il 2% di paraformaldeide in PBS. Dopo 10 minuti, lavare le coverslip tre volte per cinque minuti ciascuna con PBS e quindi permeabilizzare le coverslips con detergente non ionico per 10 minuti.Dopo tre lavaggi PBS di cinque minuti, incubare i coverslip in soluzione bloccante per 30 minuti, seguiti da un'altra incubazione di 30 minuti con un anticorpo monoclonale o policlonale di topo. Dopo i lavaggi PBS, incubare i coverslip per 30 minuti con anticorpi secondari in soluzione bloccante e falloidina per colorare i filamenti di actina nella cellula ospite. Quindi lavare nuovamente i coverslip con PBS tre volte prima di applicare una piccola quantità di reagente di montaggio anti-dissolvenza con mezzo DAPI sulla superficie del vetrino.Usando la pinza, inclinare delicatamente il coperchio nel mezzo per prevenire la formazione di bolle. Per la doppia marcatura, dopo aver incubato i coverslip in soluzione bloccante come dimostrato in precedenza, incubarli nell'anticorpo policlonale del topo per 30 minuti. Quindi, lavare i coverslip tre volte per cinque minuti ciascuno con PBS prima di incubarli con l'anticorpo secondario per 30 minuti.Quindi, dopo tre lavaggi PBS, eseguire una seconda fase di blocco con IgG anti-topo di coniglio AffiniPure diluito in soluzione bloccante. Dopo 30 minuti, lavare nuovamente le coperture con PBS prima di incubarle con l'anticorpo monoclonale del topo per altri 30 minuti. Successivamente, dopo tre lavaggi PBS, incubare i coverslip con anticorpo IgG 2B anti-topo di capra e falloidina.Quindi, dopo tre lavaggi PBS, applicare il reagente di montaggio anti-dissolvenza come dimostrato in precedenza. Per la tripla etichettatura, dopo aver bloccato i coverslip e incubato con l'anticorpo policlonale di topo, seguito dall'anticorpo anti-topo di capra, iniziare una nuova incubazione con anticorpo policlonale di coniglio in soluzione bloccante per 30 minuti. Quindi, dopo tre lavaggi PBS, incubare i coverslip con anticorpi anti-coniglio di capra per 30 minuti.Successivamente, dopo tre lavaggi PBS, eseguire una fase di blocco con l'anticorpo anti-topo del coniglio AffiniPure diluito in soluzione bloccante per 30 minuti. Quindi lavare nuovamente i coverslip prima di incubare con qualsiasi anticorpo monoclonale di topo della sottoclasse IgG per 30 minuti. Dopo tre lavaggi PBS, incubare i coverslip per 30 minuti con una coppia specifica di anticorpi anti-topo della sottoclasse IgG di capra.Dopo l'incubazione, lavare le coperture tre volte per cinque minuti ciascuna con PBS. Analizzare i campioni immunofluorescenti utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo di immersione in olio 63X e rilevare la fluorescenza con un tubo fotomoltiplicatore e un rilevatore ibrido. Quindi acquisire tutte le immagini confocali con canali separati ed eseguire l'elaborazione delle immagini utilizzando Adobe Photoshop.Queste immagini al microscopio confocale mostrano i risultati con gli esperimenti di controllo di cellule infette e non infette evidenziando la specificità degli anticorpi nella cellula ospite e nel parassita interiorizzato. L'anticorpo policlonale di topo anti-Trypanosoma cruzi FAZ ha riconosciuto la proteina gigante T.cruzi nella zona di attacco del flagello al flagello del parassita, ma non nella cellula ospite. La distribuzione della ribonucleoproteina nucleare eterogenea A1 nei nuclei è stata osservata utilizzando un anticorpo monoclonale di topo commerciale che riconosce solo le cellule di mammifero ospiti, ma non il parassita.Inoltre, i nuclei dell'ospite e del parassita e i cinetoplasti del parassita sono stati colorati con DAPI e la F-actina dell'ospite è stata colorata con falloidina coniugata ad Alexa 594, confermando la specificità degli anticorpi. L'immunofluorescenza a doppia etichettatura mostra le distribuzioni proteiche nell'ospite e nel parassita analizzate al microscopio confocale. L'etichettatura non ha suggerito alcuna reazione incrociata tra anticorpi utilizzando questa metodologia.In sintesi, il protocollo qui descritto per studiare le interazioni ospite-patogeno presenta una tecnica di base ed elaborata che può essere adattata a qualsiasi combinazione di anticorpi. Questo approccio rende l'immunofluorescenza economicamente vantaggiosa e può aiutare a studiare la localizzazione di due o più proteine di interesse quando sono disponibili pochi anticorpi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Monostrati Colonoid umana per studiare le interazioni tra gli agenti patogeni, Commensals ed epitelio intestinale Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...