Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) til MMAB, av Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA til MMAB og av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - finanskode 001. CG-C fikk et master- og doktorgradsstipend fra CAPES og LAMT-S fikk doktorgradsstipend fra CNPq. Vi takker Elizabete R. Milani for konfokal mikroskopihjelp og Dr. Dario Zamboni for å ha gitt LLC-MK2-celler (Ribeirao Preto Medical School, USP).

1. Celle- og parasittkulturer
<ol><li>Vokse LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) celler fra American Type Culture Collection (CCL-7) i en 25 cm2 cellekultur kolbe som inneholder i RPMI medium supplert med 10% varmeinaktivert FB (Fetal Bovine Serum) og antibiotika (100 U/ml Penicillin og 100 μg/ml Streptomycin) ved 37 °C i 5 % CO2 17.</li>
	<li>Infiser LLC-MK2-celler med Trypanosoma cruzi (Y-stamme) i henhold til en tidligere protokoll 18</s...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+natural+antibodies.">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

Her presenterer vi en protokoll for å utføre dobbel immunisolering i Trypanosoma cruzi infiserte celler ved hjelp av to forskjellige antistoffer fra samme vertsart. For å studere, med flere detaljer, kan implikasjonene av infeksjonen, strukturer i vertscellen som kjernen eller cytosolorganellene merkes ved hjelp av denne protokollen. Den kan også brukes i den etterinnlagte tynne delen immunogold merkingsmetode. Denne tilnærmingen bidrar til å overvinne hindringen av å ha få antistoffer tilgjengelig for ?...

Å studere samspillet mellom patogenet og vertscellen på cellenivå gir viktig informasjon om de underliggende årsakene til sykdommen siden forskjellige grupper, for eksempel virus, bakterier og protozoer, kan infisere de fleste vertscelletyper1,2,3,4. Det kan også bidra til å utvikle og identifisere potensielle terapeutiske mål som kan bremse eller hemme veksten av patogenet. Under levende forhold er de produserte antistoffene ansvarlige for å gjenkjenne selvkomponenter, antigener fra virus, bakterielle komponenter eller produkter, sopp, parasitter og andre5.
Til dette formål er antistoffer mye brukte verktøy, hovedsakelig for å forstå plasseringen og funksjonen til cellulære strukturer og proteiner. Flere studier som bruker flere antistoffmerking viser at ytterligere blokkeringstrinn bidrar til spesifisiteten av immunokaliseringen. I tillegg bruker de fleste beskrevne protokoller spesifikke kommersielle monoklonale antistoffer, inkludert antistoffer fra samme vertsart6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Vanligvis bruker dobbeltmerking av immunfluorescens to antistoffer oppdratt i forskjellige arter for å farge cellestrukturene av interesse eller patogenene og vertscellene for å se samspillet mellom dem. Dette kan imidlertid være et problem når ingen kommersielle monoklonale eller polyklonale antistoffer som er spesifikke for noen patogener, er tilgjengelige for å utføre dobbeltmerkingen. Det er også kommersielt tilgjengelige antistoffkonjugeringssett, og det er mulig å konjugere de primære antistoffene direkte til fluoroforen av en succinimidylsterreaksjon15. Problemet er at disse settene ofte er dyre, og det er nødvendig å ha nok antistoffer til å merke dem. Når vi visste dette, utviklet vi vellykket en dobbel immunfluorescensmetode ved hjelp av to forskjellige antistoffer oppdratt i samme art for å studere proteinlokalisering i Trypanosoma brucei16. Men for intracellulære parasitter, inkludert Trypanosoma cruzi, har denne tilnærmingen ikke blitt demonstrert. Her viser vi hvordan man utfører dobbeltmerking av immunfluorescens for å studere intracellulære T. cruzi-parasitter og vertscellen ved hjelp av primære antistoffer oppdratt i samme art uten kryssreaksjoner. Foruten denne metoden er det etablert en trippel immunfluorescensmerking med tilsetning av det tredje antistoffet fra en annen art. Disse tilnærmingene hjelper når kilden til antistoffer er begrenset og kan brukes i hvilken som helst celletype.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

I dag er det mulig å finne et bredt spekter av molekylære verktøy tilgjengelig for å studere parasittvertscelleinteraksjoner. Det finnes imidlertid noen begrensninger for å oppnå kommersielle monoklonale eller polyklonale antistoffer som gjenkjenner spesifikke cellestrukturer og proteiner i parasitter. Dessuten er det få kommersielle antistoffer tilgjengelig for å merke trypanosomatider. Vanligvis fremstilles polyklonale antistoffer mot parasitter internt og kan være mer utfordrende å bruke i kombinasjon med andre antistoffer produsert i samme art. Her demonstrerer protokollen hvordan man bruker polyklonale og monoklonale antistoffer oppdratt i samme art for å utføre dobbel merking av immunfluorescens for å studere vertscelle- og patogeninteraksjoner. For å oppnå dobbel merking immunfluorescence, er det avgjørende å inkubere først musen polyklonal antistoff og deretter følge inkubasjonen med sekundær mus IgG antistoff konjugert til noen fluorokrom. Etter det er et ekstra blokkeringstrinn nødvendig for å forhindre at spor av det primære antistoffet blir anerkjent av neste sekundære antistoff. Deretter tilsettes et monoklonalt musantistoff og det spesifikke IgG-subklasse sekundære antistoffet som er konjugert til en annen fluorokrom, til prøven til passende tider. I tillegg er det mulig å utføre trippel merking av immunfluorescens ved hjelp av et tredje antistoff oppdratt i en annen art. Også strukturer som kjerner og aktin kan farges senere med sine spesifikke forbindelser eller etiketter. Dermed kan disse tilnærmingene som presenteres her justeres for enhver celle hvis kilder til primære antistoffer er begrenset.

Her viser vi hvordan man studerer vertsparasittinteraksjoner ved immunfluorescens når kilden til antistoffer er begrenset på grunn av utilgjengeligheten av kommersielle antistoffer som gjenkjenner spesifikke strukturer og proteiner i trypanosomatider.
Blant trypanosomatider har T. cruzi en av de mest komplekse livssyklusene som involverer ulike utviklingsstadier mellom virveldyr og hvirvelløse verter 19. I løpet av T. cruzi livssyklusen, på et tid...

Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Her beskriver protokollen hvordan man utfører dobbeltmerking av immunfluorescens ved hjelp av primære antistoffer oppdratt i samme art for å studere vertspatogeninteraksjoner. Det kan også inkludere det tredje antistoffet fra en annen vert i denne protokollen. Denne tilnærmingen kan gjøres i hvilken som helst celletype og patogener.

Dobbel merking av immunfluorescens ved hjelp av antistoffer fra samme art for å studere vertspatogeninteraksjoner

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

I denne protokollen kan to antistoffer fra samme vert brukes sammen i immunfluorescence-analysen for å studere vertscelle- og patogeninteraksjoner. Siden det bare er få kommersielle antistoffer tilgjengelig for å gjenkjenne spesifikke cellestrukturer og proteiner i parasitter, kan denne protokollen være svært nyttig. Dette er en lett-å-utføre dobbeltmerking immunfluorescence protokoll som bruker polyklonale og monoklonale antistoffer oppvokst i samme art.Mange forskere er kanskje ikke klar over at dette er mulig. Denne tilnærmingen hjelper når kilden til antistoffer er begrenset. Den kan brukes til å oppdage patogenene i vertscelleproteinene i infiserte vertsceller og kan også brukes på frie levende organismer.Dette er en enkel protokoll, krever ett blokkeringstrinn mellom første og andre par antistoffer. Prosedyren vil bli demonstrert av Dr.Camila Gachet-Castro og ph.d.-student Lays Trajano-Silva fra laboratoriet mitt. Tre dager etter å ha smittet LLC-MK2-celler med Trypanosoma cruzi, samle supernatanten fra de infiserte cellene i et 15 milliliter cellekultur konisk rør.Sentrifuger prøven til lavere celleavfall, og plasser deretter røret ved romtemperatur slik at trypomastigotene kan svømme til supernatanten. Etter 10 minutter, samle supernatanten i et nytt konisk rør, sentrifuger deretter prøven og kast supernatanten før du bruker pelletsen som inneholder parasittene i komplett RPMI-medium. Legg LLC-MK2 celler i 24-brønns plater som inneholder UV steriliserte avrundede deksler og la&m å bosette seg i 16 timer.Deretter å infisere cellene, legge supernatant som inneholder T.Cruzi til hver brønn og inkubere i seks timer. Deretter vasker du dekslene som inneholder de infiserte og ikke-infiserte cellene fem ganger med PBS, og fikser deretter cellene med 2% paraformaldehyd i PBS. Etter 10 minutter, vask dekslene tre ganger i fem minutter hver med PBS og permeabiliser deretter dekslene med ikke-ionisk vaskemiddel i 10 minutter.Etter tre fem minutters PBS-vask, inkuber dekslene i blokkeringsløsning i 30 minutter, etterfulgt av en annen 30-minutters inkubasjon med enten en musmonylal eller polyklonal antistoff. Etter PBS vasker, inkuber dekslene i 30 minutter med sekundært antistoff i blokkeringsløsning og falloidin for å flekke aktinfilamenter i vertscellen. Vask deretter dekslene med PBS tre ganger igjen før du påfører en liten mengde anti-fade monteringsreagens med DAPI-medium til overflaten av lysbildet.Bruk tang til å vippe dekslene forsiktig i mediet for å forhindre bobledannelse. For dobbel merking, etter inkubering av dekslene i blokkeringsløsning som vist tidligere, inkuber dem i musens polyklonale antistoff i 30 minutter. Deretter vasker du dekslene tre ganger i fem minutter hver med PBS før du inkuberer dem med sekundært antistoff i 30 minutter.Deretter utfører du et nytt blokkeringstrinn etter tre PBS-vasker med AffiniPure kanin antimus IgG fortynnet i blokkeringsløsning. Etter 30 minutter, vask dekslene med PBS igjen før du inkuberer dem med musen monoklonalt antistoff i ytterligere 30 minutter. Deretter, etter tre PBS-vasker, inkuberer du dekslene med geit antimus IgG 2B antistoff og falloidin.Deretter bruker du anti-fade monteringsreagens som vist tidligere etter tre PBS-vasker. For trippel merking, etter å ha blokkert dekslene og inkubert med musen polyklonalt antistoff, etterfulgt av geit anti-mus antistoff, start en ny inkubasjon med kanin polyklonalt antistoff i blokkeringsløsning i 30 minutter. Deretter, etter tre PBS-vasker, inkuber dekslene med geit anti-kanin antistoff i 30 minutter.Deretter, etter tre PBS-vasker, utfør et blokkeringstrinn med AffiniPure kanin antistoff fortynnet i blokkeringsløsning i 30 minutter. Vask deretter dekslene igjen før du inkuberer med en hvilken som helst mus monoklonal IgG subclass antistoff i 30 minutter. Etter tre PBS-vasker, inkuber dekslene i 30 minutter med et bestemt par geit antimus IgG subclass antistoffer.Etter inkubasjon, vask dekslene tre ganger i fem minutter hver med PBS. Analyser immunfluorescerende prøver ved hjelp av et konfokalt mikroskop med et 63X oljeinnlevelsesmål og oppdag fluorescensen med et fotomultiplierrør og hybriddetektor. Hent deretter alle konfektbilder med separerte kanaler og utfør bildebehandling ved hjelp av Adobe Photoshop.Disse konfiske mikroskopibildene viser resultater med kontrolleksperimentene til infiserte og ikke-infiserte celler som fremhever spesifisiteten til antistoffene i vertscellen og den internaliserte parasitten. Musen polyklonal antistoff anti-Trypanosoma cruzi FAZ anerkjente T.cruzi gigantiske proteinet i flagellum vedlegg sone på parasitten flagellum, men ikke i vertscellen. Distribusjon av det heterogene kjernefysiske ribonukleoproteinet A1 i kjernen ble observert ved hjelp av et kommersielt musmonyklonalt antistoff som bare gjenkjenner vertspattedyrcellene, men ikke parasitten.Også verten og parasitten kjerner og parasitten kinetoplaster ble farget med DAPI og vert F-aktin ble farget med falloidin konjugert til Alexa 594, bekrefter spesifisiteten av antistoffene. Dobbeltmerking av immunfluorescens viser proteinfordelingene i verten og parasitten analysert av konfektmikroskopi. Merkingen foreslo ingen kryssreaksjon mellom antistoffer ved hjelp av denne metodikken.Oppsummert presenterer protokollen beskrevet her for å studere vertspatogeninteraksjoner en grunnleggende og forseggjort teknikk som kan tilpasses enhver kombinasjon av antistoffer. Denne tilnærmingen gjør immunfluorescens kostnadseffektiv og kan bidra til å studere lokalisering av to eller flere proteiner av interesse når få antistoffer er tilgjengelige.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ tilnærming til preger landskapet av Host-patogenfrie Protein-protein interaksjoner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging inlc Secretion å etterforske Cellular Infeksjon av Bakteriell Patogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolering av Double Negative αβ T celler fra nyre

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Ved å bruke<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Å studere autofagi-Cytoskjelettet Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse av Adhesjon Under skjærspenning for studier av T-lymfocytter-adhesjonsmolekyl Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering av Host-patogen svar og vaksinen i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menneskelig Colonoid Monolayers å studere interaksjonen mellom patogener, Commensals og vert Intestinal epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...