Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) ao MMAB, pela Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA ao MMAB e pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brasil (CAPES) - código financeiro 001. A CG-C recebeu bolsa de mestrado e doutorado da CAPES e a LAMT-S recebeu bolsa de doutorado do CNPq. Agradecemos a Elizabete R. Milani pela assistência de microscopia confocal e pelo Dr. Dario Zamboni pelo fornecimento de células LLC-MK2 (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP).

1. Culturas celulares e parasitas
<ol><li>Grow LLC-MK2 (Resus Monkey Kidney Epithelial) células da American Type Culture Collection (CCL-7) em um frasco de cultura celular de 25 cm2 contendo em meio RPMI suplementado com 10% de calor-in FBS ativados (Soro Bovino Fetal) e antibióticos (Penicilina U/mL 100 U/mL e 100 μg/mL Streptomicin) a 37 °C em 5% DE CO2 17.</li>
	<li>Infectar células LLC-MK2 com Trypanosoma cruzi (cepa Y) de acordo com um protocolo anterior ...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+natural+antibodies.">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar imunolabécimo duplo em células infectadas trypanosoma cruzi usando dois anticorpos diferentes da mesma espécie hospedeira. Para estudar, com mais detalhes, as implicações da infecção, estruturas na célula hospedeira, como o núcleo ou organelas citosóicas podem ser rotuladas usando este protocolo. Além disso, pode ser usado no método de rotulagem de imunogold de seção fina pós-incorporação. Essa abordagem ajuda a superar o obstáculo de ter poucos ant...

Estudar a interação do patógeno com a célula hospedeira no nível celular fornece informações essenciais sobre as causas subjacentes da doença, uma vez que diferentes grupos, como vírus, bactérias e protozoários, podem infectar a maioria dos tipos de células hospedeiras1,2,3,4. Também pode ajudar a desenvolver e identificar potenciais alvos terapêuticos que podem retardar ou inibir o crescimento do patógeno. Em condições vivas, os anticorpos produzidos são responsáveis pelo reconhecimento de autocomponmentos, antígenos de vírus, componentes ou produtos bacterianos, fungos, parasitas e outros5.
Para isso, os anticorpos são ferramentas amplamente utilizadas, principalmente para a compreensão da localização e função das estruturas celulares e proteínas. Vários estudos utilizando rotulagem múltipla de anticorpos demonstram que etapas adicionais de bloqueio contribuem para a especificidade da imunolocalização. Além disso, a maioria dos protocolos descritos utiliza anticorpos monoclonais comerciais específicos, incluindo anticorpos das mesmas espécies hospedeiras6, 7,8,9,10,11,12,13,14.
Normalmente, a dupla rotulagem imunofluorescência usa dois anticorpos criados em diferentes espécies para manchar as estruturas celulares de interesse ou os patógenos e as células hospedeiras para ver a interação entre eles. No entanto, isso pode ser um problema quando não há anticorpos monoclonais ou policlonais comerciais específicos para alguns patógenos disponíveis para realizar a rotulagem dupla. Além disso, existem kits de conjugação de anticorpos disponíveis comercialmente, e é possível conjugar os anticorpos primários diretamente ao fluoróforo por uma reação de éster succinimidyl15. O problema é que esses kits são muitas vezes caros, e é necessário ter anticorpos suficientes para rotulá-los. Sabendo disso, desenvolvemos com sucesso um método de dupla imunofluorescência usando dois anticorpos diferentes criados na mesma espécie para estudar a localização de proteínas em Trypanosoma brucei16. No entanto, para parasitas intracelulares, incluindo Trypanosoma cruzi, essa abordagem não foi demonstrada. Aqui, mostramos como realizar a dupla rotulagem de imunofluorescência para estudar parasitas intracelulares T. cruzi e a célula hospedeira usando anticorpos primários criados na mesma espécie sem reações cruzadas. Além desse método, foi estabelecida uma rotulagem tripla de imunofluorescência com a adição do terceiro anticorpo de uma espécie diferente. Essas abordagens ajudam quando a fonte de anticorpos é limitada e pode ser usada em qualquer tipo de célula.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

Hoje em dia, é possível encontrar uma ampla gama de ferramentas moleculares disponíveis para estudar interações células parasitas-hospedeiras. No entanto, existem algumas limitações para a obtenção de anticorpos monoclonais ou policlonais comerciais que reconheçam estruturas celulares específicas e proteínas em parasitas. Além disso, há poucos anticorpos comerciais disponíveis para rotular trypanosomatids. Normalmente, anticorpos policlonais contra parasitas são preparados internamente e poderiam ser mais desafiadores de usar em combinação com outros anticorpos produzidos na mesma espécie. Aqui, o protocolo demonstra como usar anticorpos policlonais e monoclonais criados na mesma espécie para realizar a dupla rotulagem de imunofluorescência para estudar interações entre células hospedeiras e patógenos. Para alcançar a imunofluorescência de rotulagem dupla, é crucial incubar primeiro o anticorpo policlonal do camundongo e, em seguida, seguir a incubação com o anticorpo secundário IgG conjugado a qualquer fluorocromo. Depois disso, uma etapa de bloqueio adicional é necessária para evitar que qualquer vestígio do anticorpo primário seja reconhecido pelo próximo anticorpo secundário. Em seguida, um anticorpo monoclonal do rato e seu anticorpo secundário subclasse IgG específico conjugado a um fluorocromo diferente são adicionados à amostra nos momentos apropriados. Além disso, é possível realizar imunofluorescência de rotulagem tripla usando um terceiro anticorpo criado em uma espécie diferente. Além disso, estruturas como núcleos e actina podem ser manchadas posteriormente com seus compostos ou rótulos específicos. Assim, essas abordagens aqui apresentadas podem ser ajustadas para qualquer célula cujas fontes de anticorpos primários sejam limitadas.

Aqui, mostramos como estudar interações hospedeiro-parasita por imunofluorescência quando a fonte de anticorpos é limitada devido à indisponibilidade de anticorpos comerciais que reconhecem estruturas e proteínas específicas em tripanosomatidas.
Entre os trypanosomatids, T. cruzi possui um dos ciclos de vida mais complexos envolvendo vários estágios de desenvolvimento entre vertebrados e hospedeiros invertebrados 19. Durante o ciclo de vida de T. c...

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Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Aqui, o protocolo descreve como realizar a dupla rotulagem de imunofluorescência usando anticorpos primários criados na mesma espécie para estudar interações hospedeiro-patógeno. Além disso, ele pode incluir o terceiro anticorpo de um host diferente neste protocolo. Esta abordagem pode ser feita em qualquer tipo de célula e patógenos.

Imunofluorescência de rotulagem dupla usando anticorpos da mesma espécie para estudar interações hospedeiro-patógeno

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Neste protocolo, dois anticorpos do mesmo hospedeiro podem ser usados juntos no ensaio de imunofluorescência para estudar interações entre células hospedeiras e patógenos. Como há poucos anticorpos comerciais disponíveis para reconhecer estruturas celulares específicas e proteínas em parasitas, esse protocolo pode ser muito útil. Este é um protocolo de imunofluorescência de dupla rotulagem fácil de executar que usa anticorpos policlonais e monoclonais criados na mesma espécie.Muitos pesquisadores podem não saber que isso é possível. Essa abordagem ajuda quando a fonte de anticorpos é limitada. Pode ser usado para detectar os patógenos nas proteínas das células hospedeiras em células hospedeiras infectadas e também pode ser aplicado a organismos vivos livres.Este é um protocolo simples, requerem um passo de bloqueio entre o primeiro e o segundo par de anticorpos. O procedimento será demonstrado pela Dra Camila Gachet-Castro e pela doutoranda Lays Trajano-Silva do meu laboratório. Três dias depois de infectar células LLC-MK2 com Trypanosoma cruzi, colete o supernatante das células infectadas em um tubo cônico de cultura celular de 15 mililitros.Centrifugar a amostra para diminuir os detritos celulares, em seguida, colocar o tubo em temperatura ambiente para permitir que os tripulações nadam até o sobrenatante. Após 10 minutos, colete o supernasce em um novo tubo cônico, depois centrifuugar a amostra e descartar o supernasal antes de reutilizar a pelota contendo os parasitas em meio RPMI completo. Adicione células LLC-MK2 em placas de 24 poços contendo tampas arredondadas UV e permita que a&m se contente por 16 horas.Em seguida, para infectar as células, adicione supernasce contendo T.Cruzi a cada poço e incubar por seis horas. Em seguida, lave as tampas contendo as células infectadas e não infectadas cinco vezes com PBS e, em seguida, fixe as células com 2% de paraformaldeído em PBS. Após 10 minutos, lave as tampas três vezes por cinco minutos cada com PBS e, em seguida, permeabilize as tampas com detergente não iônico por 10 minutos.Após três lavagens pbs de cinco minutos, incubar as tampas na solução de bloqueio por 30 minutos, seguida de outra incubação de 30 minutos com um anticorpo monoclonal ou policlonal do rato. Após as lavagens da PBS, incubar as tampas por 30 minutos com anticorpo secundário na solução de bloqueio e phalloidina para colorição de filamentos actin na célula hospedeira. Em seguida, lave as tampas com PBS três vezes novamente antes de aplicar uma pequena quantidade de reagente de montagem anti-fade com meio DAPI à superfície do slide.Com fórceps, incline suavemente a mancha de cobertura no meio para evitar a formação de bolhas. Para rotulagem dupla, depois de incubar as tampas na solução de bloqueio, como demonstrado anteriormente, incuba-as no anticorpo policlonal do camundongo por 30 minutos. Em seguida, lave as tampas três vezes por cinco minutos cada com PBS antes de incuba-las com o anticorpo secundário por 30 minutos.Em seguida, após três lavagens PBS, realize uma segunda etapa de bloqueio com AffiniPure coelho anti-mouse IgG diluído na solução de bloqueio. Após 30 minutos, lave as tampas com PBS novamente antes de incuba-las com o anticorpo monoclonal do rato por mais 30 minutos. Em seguida, depois de três lavagens PBS, incubar as tampas com anticorpo igG 2B anti-rato de cabra e phalloidina.Em seguida, após três lavagens PBS, aplique reagente de montagem anti-fade como demonstrado anteriormente. Para rotulagem tripla, depois de bloquear as tampas e incubar com o anticorpo policlonal do rato, seguido de anticorpo anti-rato de cabra, inicie uma nova incubação com anticorpo policlonal de coelho na solução de bloqueio por 30 minutos. Em seguida, depois de três lavagens PBS, incubar as tampas com anticorpo anti-coelho de cabra por 30 minutos.Em seguida, após três lavagens PBS, realize uma etapa de bloqueio com anticorpo anti-rato de coelho AffiniPure diluído em solução de bloqueio por 30 minutos. Em seguida, lave as tampas novamente antes de incubar com qualquer anticorpo monoclonal IgG do mouse por 30 minutos. Após três lavagens PBS, incubar as tampas por 30 minutos com um par específico de anticorpos anti-rato IgG anti-rato de cabra.Após a incubação, lave as tampas três vezes por cinco minutos cada com PBS. Analise as amostras imunofluorescentes usando um microscópio confocal com um objetivo de imersão de óleo 63X e detecte a fluorescência com um tubo fotomultiplier e detector híbrido. Em seguida, adquira todas as imagens confocal com canais separados e realize o processamento de imagens usando o Adobe Photoshop.Estas imagens de microscopia confocal mostram resultados com os experimentos de controle de células infectadas e não infectadas destacando a especificidade dos anticorpos na célula hospedeira e do parasita internalizado. O anticorpo policlonal do camundongo anti-Trypanosoma cruzi FAZ reconheceu a proteína gigante T.cruzi na zona de apego flagelolum no flagelo do parasita, mas não na célula hospedeira. A distribuição da ribonucleoproteína nuclear heterogênea A1 nos núcleos foi observada usando um anticorpo monoclonal comercial que reconhece apenas as células mamíferas hospedeiras, mas não o parasita.Além disso, os núcleos hospedeiros e parasitas e os cinetoplastos parasitas foram manchados com DAPI e o hospedeiro F-actin estava manchado com fhalloidina conjugada à Alexa 594, confirmando a especificidade dos anticorpos. A imunofluorescência de dupla rotulagem mostra as distribuições proteicas no hospedeiro e o parasita analisado pela microscopia confocal. A rotulagem não sugeriu reação cruzada entre anticorpos usando essa metodologia.Em resumo, o protocolo descrito aqui para estudar interações hospedeiro-patógeno apresenta uma técnica básica e elaborada que pode ser adaptada a qualquer combinação de anticorpos. Essa abordagem torna a imunofluorescência econômica e pode ajudar a estudar a localização de duas ou mais proteínas de interesse quando poucos anticorpos estão disponíveis.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Imunologia e Infecção

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Separação de Single-stranded DNA, Double-stranded DNA e RNA de uma Comunidade Ambiental Viral Usando Cromatografia hidroxiapatita

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolamento de duplas Células αβ T negativa do Rim

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Colonoid humana monocamadas para estudar interações entre epitélio Intestinal do hospedeiro, comensais e patógenos

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...