Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Эта работа была поддержана Фондом Ампаро в Пескизе сан-Паулу (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) для MMAB, Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA для MMAB и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - финансовый код 001. CG-C получил магистерскую и докторскую стипендию от CAPES, а LAMT-S получил докторскую стипендию от CNPq. Мы благодарим Элизабет Р. Милани за помощь в конфокальной микроскопии и доктора Дарио Замбони за предоставление клеток LLC-MK2 (Медицинская школа Рибейрао Прету, USP).

1. Культуры клеток и паразитов
<ol><li>Выращивайте клетки LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) из Американской коллекции культур типа (CCL-7) в колбе для клеточной культуры объемом 25 см2, содержащейся в среде RPMI, дополненной 10% термоинактивированным FBS (фетальная бычья сыворотка) и антибиотиками (100 ЕД...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+natural+antibodies.">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

Здесь мы представляем протокол для выполнения двойной иммуномаркировки инфицированных Trypanosoma cruzi клеток с использованием двух разных антител от одного и того же вида-хозяина. Чтобы изучить более подробно последствия инфекции, структуры в клетке-хозяине, такие как ядро или цитозол...

Изучение взаимодействия патогена с клеткой-хозяином на клеточном уровне предоставляет важную информацию об основных причинах заболевания, поскольку различные группы, такие как вирусы, бактерии и простейшие, могут заражать большинство типов клеток-хозяев 1,2,3,4. Это также может помочь разработать и идентифицировать потенциальные терапевтические цели, которые могут замедлить или ингибировать рост патогена. В живых условиях вырабатываемые антитела отвечают за распознавание самокомпонентов, антигенов из вирусов, бактериальных компонентов или продуктов, грибков, паразитов и др.5.
Для этой цели антитела широко используются инструментами, в основном для понимания расположения и функции клеточных структур и белков. Несколько исследований с использованием множественной маркировки антител показывают, что дополнительные блокирующие этапы способствуют специфичности иммунолокализации. Кроме того, в большинстве описанных протоколов используются специфические коммерческие моноклональные антитела, включая антитела от одного и того же вида хозяина6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Обычно двойная маркировка иммунофлуоресценции использует два антитела, выращенных у разных видов, чтобы окрашивать интересующие клеточные структуры или патогены и клетки-хозяева, чтобы увидеть взаимодействие между ними. Однако это может быть проблемой, когда коммерческие моноклональные или поликлональные антитела, специфичные для некоторых патогенов, недоступны для выполнения двойной маркировки. Кроме того, существуют коммерчески доступные наборы конъюгации антител, и можно конъюгировать первичные антитела непосредственно к флуорофору с помощью реакции сукцинимидилового эфира15. Проблема в том, что эти наборы часто дорогие, и необходимо иметь достаточно антител, чтобы маркировать их. Зная это, мы успешно разработали метод двойной иммунофлуоресценции с использованием двух разных антител, выращенных у одного и того же вида, для изучения локализации белка в Trypanosoma brucei16. Однако для внутриклеточных паразитов, включая Trypanosoma cruzi, такой подход не был продемонстрирован. Здесь мы покажем, как выполнить двойную маркировку иммунофлуоресценции для изучения внутриклеточных паразитов T. cruzi и клетки-хозяина с использованием первичных антител, выращенных у одного и того же вида без перекрестных реакций. Кроме этого метода установлена тройная иммунофлуоресцентная маркировка с добавлением третьего антитела от другого вида. Эти подходы помогают, когда источник антител ограничен и может быть использован в любом типе клеток.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

В настоящее время можно найти широкий спектр молекулярных инструментов, доступных для изучения взаимодействия паразитов и клеток-хозяев. Однако существуют некоторые ограничения для получения коммерческих моноклональных или поликлональных антител, которые распознают специфические клеточные структуры и белки у паразитов. Кроме того, существует мало коммерческих антител, доступных для маркировки трипаносоматидов. Обычно поликлональные антитела против паразитов готовятся собственными силами и могут быть более сложными для использования в сочетании с другими антителами, продуцируемыми у того же вида. Здесь протокол демонстрирует, как использовать поликлональные и моноклональные антитела, выращенные у одного и того же вида, для выполнения двойной маркировки иммунофлуоресценции для изучения взаимодействия клеток хозяина и патогенов. Для достижения двойной маркировки иммунофлуоресценции крайне важно инкубировать сначала поликлональное антитело мыши, а затем следовать за инкубацией с вторичным мышиным антителом IgG, конъюгированным с любым фторхромом. После этого необходим дополнительный блокирующий этап, чтобы предотвратить распознавание любого следа первичного антитела следующим вторичным антителом. Затем к образцу добавляют моноклональное антитело мыши и его специфическое вторичное антитело подкласса IgG, конъюгированное с другим фторхромом. Кроме того, можно выполнить тройную маркировку иммунофлуоресценции с использованием третьего антитела, выращенного у другого вида. Кроме того, такие структуры, как ядра и актин, могут быть окрашены впоследствии их специфическими соединениями или метками. Таким образом, представленные здесь подходы могут быть скорректированы для любой клетки, источники первичных антител которой ограничены.

Здесь мы покажем, как изучать взаимодействия хозяин-паразит путем иммунофлуоресценции, когда источник антител ограничен из-за отсутствия коммерческих антител, которые распознают специфические структуры и белки в трипаносоматидах.
Среди трипаносоматидов T. cruzi име?...

Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Здесь протокол описывает, как выполнить двойную маркировку иммунофлуоресценции с использованием первичных антител, выращенных у одного и того же вида, для изучения взаимодействий хозяина и патогена. Кроме того, он может включать третье антитело от другого хозяина в этот протокол. Такой подход может быть выполнен в любом типе клеток и патогенов.

Двойная маркировка иммунофлуоресценции с использованием антител одного и того же вида для изучения взаимодействий хозяина и патогена

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

В этом протоколе два антитела от одного и того же хозяина могут быть использованы вместе в иммунофлуоресцентном анализе для изучения взаимодействия клеток хозяина и патогенов. Поскольку существует лишь несколько коммерческих антител, доступных для распознавания специфических клеточных структур и белков у паразитов, этот протокол может быть очень полезным. Это простой в исполнении протокол иммунофлуоресценции двойной маркировки, который использует поликлональные и моноклональные антитела, выращенные у одного и того же вида.Многие исследователи могут не знать, что это возможно. Такой подход помогает, когда источник антител ограничен. Он может быть использован для обнаружения патогенов в белках клеток-хозяев в инфицированных клетках-хозяевах, а также может быть применен к свободным живым организмам.Это простой протокол, требующий одного блокирующего шага между первой и второй парой антител. Процедуру продемонстрируют доктор Камила Гаше-Кастро и аспирант Лейс Траяно-Сильва из моей лаборатории. Через три дня после заражения клеток LLC-MK2 Trypanosoma cruzi, соберите супернатант из инфицированных клеток в коническую трубку 15-миллилитровой клеточной культуры.Центрифугируйте образец, чтобы опустить клеточный мусор, затем поместите трубку при комнатной температуре, чтобы трипомастиготы переплыли к супернатанту. Через 10 минут соберите супернатант в новую коническую трубку, затем центрифугируйте образец и выбросьте супернатант перед повторным использованием гранулы, содержащей паразитов, в полной среде RPMI. Добавьте ячейки LLC-MK2 в 24-луночные пластины, содержащие УФ-стерилизованные округлые крышки, и дайте &m осесть в течение 16 часов.Затем, чтобы заразить клетки, добавляют в каждую лунку супернатант, содержащий T.Cruzi, и инкубируют в течение шести часов. Затем промыть крышки, содержащие инфицированные и неинфицированные клетки, пять раз PBS, затем зафиксировать клетки 2% параформальдегидом в PBS. Через 10 минут промыть крышки три раза в течение пяти минут каждая с PBS, а затем пропитать крышки неионным моющим средством в течение 10 минут.После трех пятиминутных промываний PBS инкубируйте крышки в блокирующем растворе в течение 30 минут, а затем еще одну 30-минутную инкубацию с моноклональным или поликлональным антителом мыши. После промывки PBS инкубируют покровы в течение 30 минут с вторичным антителом в блокирующем растворе и фаллоидином для окрашивания актиновых нитей в клетке-хозяине. Затем трижды промойте обшивки PBS, прежде чем наносить небольшое количество анти-выцветающего монтажного реагента со средой DAPI на поверхность слайда.Используя щипцы, осторожно наклоните крышку в среде, чтобы предотвратить образование пузырьков. Для двойной маркировки, после инкубации покровных пластинок в блокирующем растворе, как показано ранее, инкубируют их в мышином поликлональном антителе в течение 30 минут. Затем промывайте крышки три раза в течение пяти минут каждый PBS, прежде чем инкубировать их с вторичным антителом в течение 30 минут.Затем, после трех промывок PBS, выполните второй блокирующий этап с помощью антимышечного антимышечного IgG AffiniPure, разбавленного в блокирующем растворе. Через 30 минут снова промойте обтекатели PBS, прежде чем инкубировать их с моноклональным антителом мыши в течение еще 30 минут. Далее, после трех промывок PBS, инкубируйте крышки с козьим антимышьим антителом IgG 2B и фаллоидином.Затем, после трех промывок PBS, нанесите анти-затухающий монтажный реагент, как показано ранее. Для тройной маркировки, после блокировки покровов и инкубации с мышиным поликлональным антителом, за которым следует козье антимышье антитело, начинают новую инкубацию с кроличьим поликлональным антителом в блокирующем растворе в течение 30 минут. Затем, после трех промывок PBS, инкубируйте покровы с антителами против козьего анти-кролика в течение 30 минут.Затем, после трех промывок PBS, выполните блокирующий этап с анти-мышиным антителом AffiniPure против мыши, разбавленным в блокирующем растворе в течение 30 минут. Затем снова промыть обшивки перед инкубацией с любым мышиным моноклональным антителом подкласса IgG в течение 30 минут. После трех промывок PBS инкубируйте крышки в течение 30 минут со специфической парой анти-мышиных антител подкласса IgG.После инкубации промыть крышки три раза в течение пяти минут каждый с PBS. Анализируйте иммунофлуоресцентные образцы с помощью конфокального микроскопа с 63-кратным масляным погружным объективом и обнаруживайте флуоресценцию с помощью фотоумножителя и гибридного детектора. Затем получите все конфокальные изображения с разделенными каналами и выполните обработку изображений с помощью Adobe Photoshop.Эти изображения конфокальной микроскопии показывают результаты контрольных экспериментов инфицированных и неинфицированных клеток, подчеркивающих специфичность антител в клетке-хозяине и интернализованном паразите. Мышиное поликлональное антитело против Trypanosoma cruzi FAZ распознало гигантский белок T.cruzi в зоне прикрепления жгутика в жгутике паразита, но не в клетке-хозяине. Распределение гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина А1 в ядрах наблюдалось с использованием коммерческого мышиного моноклонального антитела, которое распознает только клетки млекопитающих-хозяев, но не паразита.Кроме того, ядра хозяина и паразита и паразита кинетопласты были окрашены DAPI, а F-актин хозяина был окрашен фаллоидином, конъюгированным с Alexa 594, подтверждая специфичность антител. Двойная маркировка иммунофлуоресценции показывает распределение белка в хозяине и паразите, проанализированное с помощью конфокальной микроскопии. Маркировка не предполагала перекрестной реакции между антителами с использованием этой методологии.Таким образом, протокол, описанный здесь для изучения взаимодействий хозяина и патогена, представляет собой базовую и сложную технику, которая может быть адаптирована к любой комбинации антител. Этот подход делает иммунофлуоресценцию экономически эффективной и может помочь изучить локализацию двух или более белков, представляющих интерес, когда доступно мало антител.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Использование оптической ловушки для изучения хост-Возбудитель Взаимодействие для динамических изображений Живая сотовый

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Разделение одноцепочечных ДНК двухцепочечной ДНК и РНК из экологического сообщества Вирусный Использование гидроксиапатита хроматографии

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Визуализация InlC секрецию по расследованию сотовой инфекции по бактериальным патогеном<em&gt; листерий</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Выделение Double Negative αβ Т-клеток из почек

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Использование<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Для изучения аутофагии-Цитоскелет взаимодействий

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Оценка хост возбудитель ответы и эффективность вакцины в мышей

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Человеческого Colonoid монослои для изучения взаимодействия между патогенов, Комменсалами и принимающих кишечного эпителия

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...