Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) a MMAB, por fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA a MMAB y por Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - código financiero 001. CG-C recibió una beca de maestría y doctorado de CAPES y LAMT-S recibió una beca de doctorado de CNPq. Agradecemos a Elizabete R. Milani por la asistencia en microscopía confocal y al Dr. Darío Zamboni por proporcionar células LLC-MK2 (Facultad de Medicina de Ribeirao Preto, USP).

1. Cultivos celulares y parasitarios
<ol><li>Cultivar células LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) de la American Type Culture Collection (CCL-7) en un matraz de cultivo celular de 25 cm2 que contiene en medio RPMI suplementado con FBS (Fetal Bovine Serum) inactivado por calor al 10% y antibióticos (100 U/mL penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C en 5% CO2 17.</li>
	<li>Infectar células LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi (cepa Y) según un protocolo...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+natural+antibodies.">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un doble inmunoetiquetado en células infectadas por Trypanosoma cruzi utilizando dos anticuerpos diferentes de la misma especie huésped. Para estudiar, con más detalle, las implicaciones de la infección, se pueden etiquetar estructuras en la célula huésped como el núcleo u orgánulos citosólicos utilizando este protocolo. Además, se puede utilizar en el método de etiquetado de inmunogold de sección delgada posterior a la incrustación. Este enfoque ayuda a...

Estudiar la interacción del patógeno con la célula huésped a nivel celular proporciona información esencial sobre las causas subyacentes de la enfermedad, ya que diferentes grupos, como virus, bacterias y protozoos, pueden infectar a la mayoría de los tipos de células huésped1,2,3,4. También puede ayudar a desarrollar e identificar posibles objetivos terapéuticos que pueden retardar o inhibir el crecimiento del patógeno. En condiciones de vida, los anticuerpos producidos son responsables de reconocer autocomponentes, antígenos de virus, componentes o productos bacterianos, hongos, parásitos y otros5.
Para este propósito, los anticuerpos son herramientas ampliamente utilizadas, principalmente para comprender la ubicación y la función de las estructuras celulares y las proteínas. Varios estudios que utilizan el etiquetado de múltiples anticuerpos demuestran que los pasos de bloqueo adicionales contribuyen a la especificidad de la inmunolocalización. Además, la mayoría de los protocolos descritos utilizan anticuerpos monoclonales comerciales específicos, incluidos anticuerpos de la misma especie huésped6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Por lo general, la inmunofluorescencia de doble etiquetado utiliza dos anticuerpos criados en diferentes especies para teñir las estructuras celulares de interés o los patógenos y las células huésped para ver la interacción entre ellos. Sin embargo, esto puede ser un problema cuando no hay anticuerpos monoclonales o policlonales comerciales específicos para algunos patógenos disponibles para realizar el doble etiquetado. Además, existen kits de conjugación de anticuerpos disponibles comercialmente, y es posible conjugar los anticuerpos primarios directamente al fluoróforo mediante una reacción de éster de succinimidil15. El problema es que estos kits suelen ser caros, y es necesario tener suficientes anticuerpos para etiquetarlos. Sabiendo esto, desarrollamos con éxito un método de doble inmunofluorescencia utilizando dos anticuerpos diferentes criados en la misma especie para estudiar la localización de proteínas en Trypanosoma brucei16. Sin embargo, para los parásitos intracelulares, incluido Trypanosoma cruzi, este enfoque no se ha demostrado. Aquí, mostramos cómo realizar la inmunofluorescencia de doble etiquetado para estudiar los parásitos intracelulares de T. cruzi y la célula huésped utilizando anticuerpos primarios criados en la misma especie sin reacciones cruzadas. Además de este método, se ha establecido un etiquetado de triple inmunofluorescencia con la adición del tercer anticuerpo de una especie diferente. Estos enfoques ayudan cuando la fuente de anticuerpos es limitada y se puede utilizar en cualquier tipo de célula.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

Hoy en día, es posible encontrar una amplia gama de herramientas moleculares disponibles para estudiar las interacciones parásito-célula huésped. Sin embargo, existen algunas limitaciones para obtener anticuerpos monoclonales o policlonales comerciales que reconozcan estructuras celulares y proteínas específicas en los parásitos. Además, hay pocos anticuerpos comerciales disponibles para etiquetar tripanosomátidos. Por lo general, los anticuerpos policlonales contra los parásitos se preparan internamente y podrían ser más difíciles de usar en combinación con otros anticuerpos producidos en la misma especie. Aquí, el protocolo demuestra cómo usar anticuerpos policlonales y monoclonales criados en la misma especie para realizar inmunofluorescencia de doble etiquetado para estudiar las interacciones entre la célula huésped y el patógeno. Para lograr la inmunofluorescencia de doble etiquetado, es crucial incubar primero el anticuerpo policlonal de ratón y luego seguir la incubación con el anticuerpo IgG secundario de ratón conjugado a cualquier fluorocromo. Después de eso, es necesario un paso de bloqueo adicional para evitar que cualquier rastro del anticuerpo primario sea reconocido por el siguiente anticuerpo secundario. Luego, un anticuerpo monoclonal de ratón y su anticuerpo secundario de subclase IgG específico conjugado a un fluorocromo diferente se agregan a la muestra en los momentos apropiados. Además, es posible realizar un triple etiquetado de inmunofluorescencia utilizando un tercer anticuerpo criado en una especie diferente. Además, estructuras como los núcleos y la actina se pueden teñir posteriormente con sus compuestos o etiquetas específicas. Por lo tanto, estos enfoques presentados aquí se pueden ajustar para cualquier célula cuyas fuentes de anticuerpos primarios son limitadas.

Aquí, mostramos cómo estudiar las interacciones huésped-parásito por inmunofluorescencia cuando la fuente de anticuerpos es limitada debido a la falta de disponibilidad de anticuerpos comerciales que reconocen estructuras y proteínas específicas en tripanosomátidos.
Entre los tripanosomátidos, T. cruzi tiene uno de los ciclos de vida más complejos que involucran varias etapas de desarrollo entre vertebrados e invertebrados huéspedes 19. Durante el cic...

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Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Aquí, el protocolo describe cómo realizar la inmunofluorescencia de doble etiquetado utilizando anticuerpos primarios criados en la misma especie para estudiar las interacciones huésped-patógeno. Además, puede incluir el tercer anticuerpo de un huésped diferente en este protocolo. Este enfoque se puede hacer en cualquier tipo de célula y patógenos.

Doble etiquetado inmunofluorescencia utilizando anticuerpos de la misma especie para estudiar las interacciones huésped-patógeno

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

En este protocolo, dos anticuerpos del mismo huésped se pueden usar juntos en el ensayo de inmunofluorescencia para estudiar las interacciones entre la célula huésped y el patógeno. Dado que solo hay pocos anticuerpos comerciales disponibles para reconocer estructuras celulares y proteínas específicas en los parásitos, este protocolo puede ser muy útil. Este es un protocolo de inmunofluorescencia de doble etiquetado fácil de realizar que utiliza anticuerpos policlonales y monoclonales criados en la misma especie.Muchos investigadores pueden no ser conscientes de que esto es posible. Este enfoque ayuda cuando la fuente de anticuerpos es limitada. Se puede utilizar para detectar los patógenos en las proteínas de la célula huésped en las células huésped infectadas y también se puede aplicar a los organismos vivos libres.Este es un protocolo simple, requiere un paso de bloqueo entre el primer y segundo par de anticuerpos. El procedimiento será demostrado por la Dra. Camila Gachet-Castro y la estudiante de doctorado Lays Trajano-Silva de mi laboratorio. Tres días después de infectar las células LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi, recoja el sobrenadante de las células infectadas en un tubo cónico de cultivo celular de 15 mililitros.Centrifugue la muestra para reducir los desechos celulares, luego coloque el tubo a temperatura ambiente para permitir que los tripomastigotes naden hasta el sobrenadante. Después de 10 minutos, recoja el sobrenadante en un nuevo tubo cónico, luego centrifugue la muestra y deseche el sobrenadante antes de volver a depositar el gránulo que contiene los parásitos en un medio RPMI completo. Agregue células LLC-MK2 en placas de 24 pocillos que contengan cubiertas redondeadas esterilizadas por UV y permita que el &m se asiente durante 16 horas.Luego, para infectar las células, agregue sobrenadante que contenga T.Cruzi a cada pozo e incube durante seis horas. A continuación, lave las fundas que contienen las células infectadas y no infectadas cinco veces con PBS, luego fije las células con 2% de paraformaldehído en PBS. Después de 10 minutos, lave los cubrehojas tres veces durante cinco minutos cada uno con PBS y luego permeabilice los cubrehojas con detergente no iónico durante 10 minutos.Después de tres lavados de PBS de cinco minutos, incube los cubrehojas en solución de bloqueo durante 30 minutos, seguido de otra incubación de 30 minutos con un anticuerpo monoclonal o policlonal de ratón. Después de los lavados de PBS, incube los cubrehojas durante 30 minutos con anticuerpos secundarios en solución de bloqueo y faloidina para teñir filamentos de actina en la célula huésped. A continuación, lave las fundas con PBS tres veces más antes de aplicar una pequeña cantidad de reactivo de montaje antidesvanecimiento con medio DAPI a la superficie de la corredera.Usando fórceps, incline suavemente el lape en el medio para evitar la formación de burbujas. Para el doble etiquetado, después de incubar los coverslips en solución de bloqueo como se demostró anteriormente, incube en el anticuerpo policlonal de ratón durante 30 minutos. A continuación, lave los cubrehojas tres veces durante cinco minutos cada uno con PBS antes de incubarlos con el anticuerpo secundario durante 30 minutos.Luego, después de tres lavados de PBS, realice un segundo paso de bloqueo con IgG anti-ratón anti-ratón de conejo AffiniPure diluido en solución de bloqueo. Después de 30 minutos, lave las fundas con PBS nuevamente antes de incubarlas con el anticuerpo monoclonal del ratón durante otros 30 minutos. A continuación, después de tres lavados de PBS, incube los cobertores con anticuerpos IgG 2B anti-ratón de cabra y faloidina.Luego, después de tres lavados de PBS, aplique el reactivo de montaje antidesvanecimiento como se demostró anteriormente. Para el triple etiquetado, después de bloquear los cubrehojas e incubar con el anticuerpo policlonal de ratón, seguido del anticuerpo anti-ratón de cabra, comience una nueva incubación con anticuerpo policlonal de conejo en solución de bloqueo durante 30 minutos. Luego, después de tres lavados de PBS, incube los cubrehojas con anticuerpos anti-conejo de cabra durante 30 minutos.A continuación, después de tres lavados de PBS, realice un paso de bloqueo con el anticuerpo anti-ratón de conejo AffiniPure diluido en solución de bloqueo durante 30 minutos. Luego lave las fundas nuevamente antes de incubar con cualquier anticuerpo monoclonal IgG de ratón durante 30 minutos. Después de tres lavados de PBS, incube los recubiertos durante 30 minutos con un par específico de anticuerpos de la subclase IgG anti-ratón de cabra.Después de la incubación, lave los cubrehojas tres veces durante cinco minutos cada uno con PBS. Analizar las muestras inmunofluorescentes utilizando un microscopio confocal con un objetivo de inmersión en aceite 63X y detectar la fluorescencia con un tubo fotomultiplicador y un detector híbrido. A continuación, adquiera todas las imágenes confocales con canales separados y realice el procesamiento de imágenes con Adobe Photoshop.Estas imágenes de microscopía confocal muestran resultados con los experimentos de control de células infectadas y no infectadas destacando la especificidad de los anticuerpos en la célula huésped y el parásito internalizado. El anticuerpo policlonal de ratón anti-Trypanosoma cruzi FAZ reconoció la proteína gigante T.cruzi en la zona de unión del flagelo en el flagelo del parásito, pero no en la célula huésped. La distribución de la ribonucleoproteína A1 nuclear heterogénea en los núcleos se observó utilizando un anticuerpo monoclonal comercial de ratón que reconoce solo las células de mamíferos huéspedes, pero no el parásito.Además, los núcleos del huésped y del parásito y los cinetóticos del parásito se tiñeron con DAPI y la F-actina del huésped se tiñó con faloidina conjugada a Alexa 594, lo que confirma la especificidad de los anticuerpos. La inmunofluorescencia de doble marcado muestra las distribuciones de proteínas en el huésped y el parásito analizados por microscopía confocal. El etiquetado no sugirió ninguna reacción cruzada entre anticuerpos utilizando esta metodología.En resumen, el protocolo aquí descrito para estudiar las interacciones huésped-patógeno presenta una técnica básica y elaborada que puede adaptarse a cualquier combinación de anticuerpos. Este enfoque hace que la inmunofluorescencia sea rentable y puede ayudar a estudiar la localización de dos o más proteínas de interés cuando hay pocos anticuerpos disponibles.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

La separación de una sola hebra de ADN, el ADN de doble cadena y el ARN de una comunidad ambiental viral mediante cromatografía de hidroxiapatita

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Aislamiento de doble negación células T αβ del Riñón

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

El uso de<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...