Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) till MMAB, av Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA till MMAB och av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - finanskod 001. CG-C fick ett master- och doktorandstipendium från CAPES och LAMT-S fick doktorandstipendium från CNPq. Vi tackar Elizabete R. Milani för konfokal mikroskopihjälp och Dr Dario Zamboni för att ha tillhandahållit LLC-MK2-celler (Ribeirao Preto Medical School, USP).

1. Cell- och parasitkulturer
<ol><li>Odla LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) celler från American Type Culture Collection (CCL-7) i en 25 cm2 cellodlingkolv som innehåller i RPMI-medium kompletterad med 10% värmeinaktiverad FBS (Fetal Bovine Serum) och antibiotika (100 U/ mL Penicillin och 100 μg / mL Streptomycin) vid 37 °C i 5% CO2 17.</li>
	<li>Infektera LLC-MK2 celler med Trypanosoma cruzi (Y stam) enligt ett tidigare protokoll 18<...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+natural+antibodies.">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra dubbel immunmärkning i Trypanosoma cruzi infekterade celler med två olika antikroppar från samma värdart. För att studera, med mer detaljer, infektionens konsekvenser, kan strukturer i värdcellen som kärnan eller cytosoliska organeller märkas med hjälp av detta protokoll. Det kan också användas i den postinbäddning av tunn sektion immunogold märkningsmetod. Detta tillvägagångssätt hjälper till att övervinna hindret för att ha få antikroppar t...

Att studera patogenens interaktion med värdcellen på cellnivå ger viktig information om de underliggande orsakerna till sjukdomen eftersom olika grupper, såsom virus, bakterier och protozoer, kan infektera de flesta värdcelltyper1,2,3,4. Det kan också hjälpa till att utveckla och identifiera potentiella terapeutiska mål som kan bromsa eller hämma patogenens tillväxt. I levande förhållanden är de producerade antikropparna ansvariga för att känna igen självkomponenter, antigener från virus, bakteriella komponenter eller produkter, svampar, parasiter och andra5.
För detta ändamål används antikroppar i stor utsträckning, främst för att förstå placeringen och funktionen av cellulära strukturer och proteiner. Flera studier med multipla antikroppsmärkning visar att ytterligare blockeringssteg bidrar till immunlokaliseringens specificitet. Dessutom använder de flesta beskrivna protokoll specifika kommersiella monoklonala antikroppar, inklusive antikroppar från samma värdart6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Vanligtvis använder dubbelmärkning av immunofluorescens två antikroppar uppfödda i olika arter för att färga cellstrukturerna av intresse eller patogenerna och värdcellerna för att se interaktionen mellan dem. Detta kan dock vara ett problem när inga kommersiella monoklonala eller polyklonala antikroppar som är specifika för vissa patogener är tillgängliga för att utföra dubbelmärkning. Det finns också kommersiellt tillgängliga antikroppskonjugationssatser, och det är möjligt att konjugera de primära antikropparna direkt till fluoroforen genom en succinimidylestersreaktion15. Problemet är att dessa kit ofta är dyra, och det är nödvändigt att ha tillräckligt med antikroppar för att märka dem. Med vetskap om detta utvecklade vi framgångsrikt en dubbel immunofluorescensmetod med hjälp av två olika antikroppar uppfödda i samma art för att studera proteinlokalisering i Trypanosoma brucei16. För intracellulära parasiter, inklusive Trypanosoma cruzi, har detta tillvägagångssätt dock inte visats. Här visar vi hur man utför dubbelmärkning av immunofluorescens för att studera intracellulära T. cruzi parasiter och värdcellen med primära antikroppar uppfödda i samma art utan korsreaktioner. Förutom denna metod har en trippel immunofluorescensmärkning fastställts med tillsats av den tredje antikroppen från en annan art. Dessa metoder hjälper när källan till antikroppar är begränsad och kan användas i alla celltyper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

Numera är det möjligt att hitta ett brett utbud av molekylära verktyg tillgängliga för att studera parasit-värd cellinteraktioner. Vissa begränsningar finns dock för att erhålla kommersiella monoklonala eller polyklonala antikroppar som känner igen specifika cellstrukturer och proteiner i parasiter. Dessutom finns det få kommersiella antikroppar tillgängliga för att märka trypanosomatids. Vanligtvis framställs polyklonala antikroppar mot parasiter internt och kan vara mer utmanande att använda i kombination med andra antikroppar som produceras i samma art. Här visar protokollet hur man använder polyklonala och monoklonala antikroppar uppfödda i samma art för att utföra dubbelmärkning av immunofluorescens för att studera värdcells- och patogeninteraktioner. För att uppnå dubbelmärkning av immunofluorescens är det viktigt att först inkubera musens polyklonala antikropp och sedan följa inkubationen med den sekundära musen IgG-antikroppen konjugerad till någon fluorokrom. Därefter är ett ytterligare blockeringssteg nödvändigt för att förhindra att spår av den primära antikroppen känns igen av nästa sekundära antikropp. Därefter tillsätts en monoklonal antikropp för mus och dess specifika sekundär antikropp i IgG som konjugerats till en annan fluorokrom i provet vid lämpliga tidpunkter. Dessutom är det möjligt att utföra trippelmärkning av immunofluorescens med hjälp av en tredje antikropp uppfödd i en annan art. Strukturer som atomkärnor och aktin kan också färgas senare med sina specifika föreningar eller etiketter. Således kan dessa metoder som presenteras här justeras för alla celler vars källor till primära antikroppar är begränsade.

Här visar vi hur man studerar värd-parasitinteraktioner genom immunofluorescens när källan till antikroppar är begränsad på grund av otillgängligheten av kommersiella antikroppar som känner igen specifika strukturer och proteiner i trypanosomatids.
Bland trypanosomatids har T. cruzi en av de mest komplexa livscyklerna som involverar olika utvecklingsstadier mellan ryggradsdjur och ryggradslösa djur värdar 19. Under T. cruzi livscykeln, i ett...

Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Här beskriver protokollet hur man utför dubbelmärkning av immunofluorescens med hjälp av primära antikroppar uppfödda i samma art för att studera värdpatogeninteraktioner. Det kan också inkludera den tredje antikroppen från en annan värd i detta protokoll. Detta tillvägagångssätt kan göras i alla celltyper och patogener.

Dubbelmärkning av immunofluorescens med antikroppar från samma art för att studera värdpatogeninteraktioner

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

I detta protokoll kan två antikroppar från samma värd användas tillsammans i immunofluorescensanalysen för att studera värdcells- och patogeninteraktioner. Eftersom det bara finns få kommersiella antikroppar tillgängliga för att känna igen specifika cellstrukturer och proteiner i parasiter, kan detta protokoll vara mycket användbart. Detta är ett lätt att utföra dubbelmärkning immunfluorescensprotokoll som använder polyklonala och monoklonala antikroppar uppfödda i samma art.Många forskare kanske inte är medvetna om att detta är möjligt. Detta tillvägagångssätt hjälper när källan till antikroppar är begränsad. Det kan användas för att upptäcka patogenerna i värdcellproteinerna i infekterade värdceller och kan också appliceras på fria levande organismer.Detta är ett enkelt protokoll, kräver ett blockerande steg mellan det första och andra paret av antikroppar. Förfarandet kommer att demonstreras av Dr.Camila Gachet-Castro och doktoranden Lays Trajano-Silva från mitt laboratorium. Tre dagar efter att ha infekterat LLC-MK2 celler med Trypanosoma cruzi, samla supernatant från de infekterade cellerna i en 15 milliliter cell kultur koniska rör.Centrifugera provet till lägre cellrester och placera sedan röret i rumstemperatur så att trypomastigotes kan simma till supernatanten. Efter 10 minuter samlar du in supernatanten i ett nytt koniskt rör, centrifugerar sedan provet och kasserar supernatanten innan du återanvänder pelleten som innehåller parasiterna i fullständigt RPMI-medium. Tillsätt LLC-MK2-celler i 24-brunnsplattor som innehåller UV-steriliserade rundade täcken och låt &m att bosätta sig i 16 timmar.För att sedan infektera cellerna, tillsätt supernatant som innehåller T.Cruzi till varje brunn och inkubera i sex timmar. Tvätta sedan täcksliparna som innehåller de infekterade och icke-infekterade cellerna fem gånger med PBS och fixa sedan cellerna med 2% paraformaldehyd i PBS. Efter 10 minuter, tvätta täckena tre gånger i fem minuter vardera med PBS och permeabilisera sedan täcksliparna med icke-joniskt tvättmedel i 10 minuter.Efter tre fem minuters PBS-tvättar, inkubera täckbladen i blockerande lösning i 30 minuter, följt av ytterligare en 30-minuters inkubation med antingen en mus monoklonal eller polyklonal antikropp. Efter PBS tvättar, inkubera täcksläp i 30 minuter med sekundär antikropp i blockerande lösning och falloidin för att fläcka aktinfilament i värdcellen. Tvätta sedan täcksläparna med PBS tre gånger igen innan du applicerar en liten mängd anti-fade monteringsreagens med DAPI-medium på bildens yta.Använd tång, luta försiktigt täckslipet i mediet för att förhindra bubbelbildning. För dubbelmärkning, efter inkubation av täckena i blockerande lösning som visats tidigare, inkubera dem i musens polyklonala antikropp i 30 minuter. Tvätta sedan täcksliparna tre gånger i fem minuter vardera med PBS innan du inkuberar dem med den sekundära antikroppen i 30 minuter.Sedan efter tre PBS tvättar, utför ett andra blockerande steg med AffiniPure kanin anti-mus IgG utspädd i blockerande lösning. Efter 30 minuter, tvätta täckbladen med PBS igen innan du inkuberar dem med musens monoklonala antikropp i ytterligare 30 minuter. Därefter, efter tre PBS tvättar, inkubera täckbenen med get anti-mus IgG 2B antikropp och falloidin.Sedan efter tre PBS tvättar, applicera anti-fade montering reagens som visats tidigare. För trippelmärkning, efter att ha blockerat täckena och inkuberat med musens polyklonala antikropp, följt av getantiantikropp, starta en ny inkubation med kaninpolyklonal antikropp i blockerande lösning i 30 minuter. Sedan efter tre PBS tvättar, inkubera täcksliparna med get anti-kanin antikropp i 30 minuter.Därefter, efter tre PBS-tvättar, utför ett blockerande steg med AffiniPure kanin antimusantikropp utspädd i blockerande lösning i 30 minuter. Tvätta sedan täcksliparna igen innan du inkuberar med någon mus monoklonal IgG-subklassantikropp i 30 minuter. Efter tre PBS-tvättar, inkubera täckbeskeden i 30 minuter med ett specifikt par getantimus IgG-underklassantikroppar.Tvätta täcksläparna tre gånger i fem minuter vardera med PBS efter inkubation. Analysera de immunofluorescenta proverna med hjälp av ett konfokalt mikroskop med ett 63X oljesänkningsmål och detektera fluorescensen med ett fotomultiplierrör och hybriddetektor. Skaffa sedan alla konfokala bilder med separerade kanaler och utför bildbehandling med Adobe Photoshop.Dessa konfokala mikroskopibilder visar resultat med kontrollexperiment av infekterade och icke-infekterade celler som belyser specificiteten hos antikropparna i värdcellen och den internaliserade parasiten. Musen polyklonal antikropp anti-Trypanosoma cruzi FAZ kände igen T.cruzi jätte protein i flagellum bilaga zonen vid parasiten flagellum, men inte i värdcellen. Distribution av heterogena nukleära ribonucleoprotein A1 i atomkärnorna observerades med hjälp av en kommersiell mus monoklonal antikropp som känner igen endast värd däggdjur celler, men inte parasiten.Värden och parasitkärnor och parasit kinetoplasts var också färgade med DAPI och värd F-aktin var färgade med falloidin konjugerade till Alexa 594, bekräftar specificiteten hos antikropparna. Dubbelmärkning av immunofluorescens visar proteinfördelningarna i värden och parasiten analyseras av konfokal mikroskopi. Märkning föreslog ingen korsreaktion mellan antikroppar med denna metod.Sammanfattningsvis presenterar protokollet som beskrivs här för att studera värdpatogena interaktioner en grundläggande och utarbetad teknik som kan anpassas till alla kombinationer av antikroppar. Detta tillvägagångssätt gör immunofluorescens kostnadseffektivt och kan hjälpa till att studera lokalisering av två eller flera proteiner av intresse när få antikroppar finns tillgängliga.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Användning av en optisk fälla för studier av Host-patogen interaktioner för Dynamic levande cell imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Separation av enda DNA, dubbel-strängat DNA och RNA ur miljösynpunkt Viral gemenskapen med hjälp av hydroxyapatit Kromatografi

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Användning av EpiAirway modell för att karakterisera Långfristiga Värd-patogen interaktioner

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ metod för att karakterisera Landskap av värdpatogen Protein-protein interaktioner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging INLC Sekre att undersöka Cellular Infektion av bakteriell patogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolering av Double Negative αβ T-celler från njure

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Användning av<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Att studera autophagy-Cytoskeleton interaktioner

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analys av vidhäftning under Shear stress för studier av T-lymfocyter-adhesionsmolekyl interaktioner

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Utvärdering av värd-patogen svaren och vaccinets effekt hos möss

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Mänskliga Colonoid enskiktslager att studera interaktioner mellan patogener, förknippas och värd Intestinal epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...