Name: double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) mmab için, Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA MMAB ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - finans kodu 001. CG-C CAPES'ten yüksek lisans ve doktora bursu, LAMT-S ise CNPq'den doktora bursu aldı. Konfokal mikroskopi yardımı için Elizabete R. Milani'ye ve LLC-MK2 hücreleri sağladığı için Dr. Dario Zamboni'ye teşekkür ederiz (Ribeirao Preto Tıp Fakültesi, USP).

1. Hücre ve parazit kültürleri
<ol><li>Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu'ndan (CCL-7) LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epitel) hücrelerini% 10 ısı inac ile desteklenmiş RPMI ortamında bulunan 25 cm2 hücre kültürü şişesinde büyütün %5 CO2 17'de 37 °C'de FBS (Fetal Sığır Serumu) ve antibiyotikler (100 U/mL Penisilin ve 100 μg/mL Streptomisin).</li>
	<li>LlC-MK2 hücrelerini önceki bir protokole göre Trypanosoma cruzi (Y suşu) ile enfekte <sup c...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+natural+antibodies.">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

Burada, aynı konak türlerinden iki farklı antikor kullanarak Trypanosoma cruzi enfekte hücrelerinde çift immünolabeling yapmak için bir protokol sunuyoruz. Daha ayrıntılı olarak, enfeksiyonun etkilerini incelemek için, çekirdek veya sitosoleik organeller gibi konak hücredeki yapılar bu protokol kullanılarak etiketlenebilir. Ayrıca, gömme sonrası ince kesit immüngold etiketleme yönteminde de kullanılabilir. Bu yaklaşım, tripozomatidleri ve diğer parazitleri incelemek için birkaç antikoru...

Patojenin hücresel düzeyde konak hücre ile etkileşimini incelemek için, virüsler, bakteriler ve protozoa gibi farklı gruplar çoğu konak hücre tipini enfekte edebileceğinden, hastalığın altında kalan nedenler hakkında temel bilgiler sağlar1,2,3,4. Ayrıca patojenin büyümesini yavaşlatabilecek veya inhibe edebilecek potansiyel terapötik hedeflerin geliştirilmesine ve tanımlanmasına yardımcı olabilir. Canlı koşullarda, üretilen antikorlar öz bileşenleri, virüslerden antijenleri, bakteriyel bileşenleri veya ürünleri, mantarları, parazitleri ve diğerlerini tanımaktan sorumludur5.
Bu amaçla, antikorlar, esas olarak hücresel yapıların ve proteinlerin yerini ve işlevini anlamak için yaygın olarak kullanılan araçlardır. Çoklu antikor etiketlemesi kullanılarak yapılan çeşitli çalışmalar, ek engelleme adımlarının immünolokalizasyonun özgüllüğüne katkıda bulunduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, açıklanan protokollerin çoğu, aynı konak türlerinden antikorlar da dahil olmak üzere belirli ticari monoklonal antikorlar kullanır6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Genellikle, çift etiketleme immünofluoresans, ilgi çekici hücre yapılarını veya patojenleri ve konak hücreleri aralarındaki etkileşimi görmek için lekelamak için farklı türlerde yetiştirilen iki antikor kullanır. Bununla birlikte, bazı patojenler için özel ticari monoklonal veya poliklonal antikorlar çift etiketleme yapmak için mevcut olmadığında bu bir sorun olabilir. Ayrıca, piyasada bulunan antikor konjugasyon kitleri vardır ve birincil antikorları doğrudan florimidil ester reaksiyonu ile florofora konjuge etmek mümkündür15. Sorun, bu kitlerin genellikle pahalı olması ve onları etiketlemek için yeterli antikora sahip olmak gerekir. Bunu bilerek, Trypanosoma brucei16'da protein lokalizasyonunu incelemek için aynı türde yetiştirilen iki farklı antikoru kullanarak çift immünofluoresans yöntemini başarıyla geliştirdik. Bununla birlikte, Trypanosoma cruzi de dahil olmak üzere hücre içi parazitler için bu yaklaşım gösterilmemiştir. Burada, hücre içi T. cruzi parazitlerini ve konak hücreyi çapraz reaksiyonlar olmadan aynı türde yetiştirilen birincil antikorları kullanarak incelemek için çift etiketleme immünofluoresansının nasıl gerçekleştirildiğini gösteriyoruz. Bu yöntemin yanı sıra, farklı bir türden üçüncü antikorun eklenmesiyle üçlü bir immünofluoresans etiketlemesi kurulmuştur. Bu yaklaşımlar antikor kaynağı sınırlı olduğunda ve herhangi bir hücre tipinde kullanılabildiğinde yardımcı olur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

Günümüzde, parazit konak hücre etkileşimlerini incelemek için çok çeşitli moleküler araçlar bulmak mümkündür. Bununla birlikte, parazitlerdeki belirli hücre yapılarını ve proteinleri tanıyan ticari monoklonal veya poliklonal antikorlar elde etmek için bazı sınırlamalar vardır. Ayrıca, tripozosatomatidleri etiketlemek için çok az ticari antikor vardır. Genellikle, parazitlere karşı poliklonal antikorlar şirket içinde hazırlanır ve aynı türde üretilen diğer antikorlarla birlikte kullanılması daha zor olabilir. Burada protokol, konak hücre ve patojen etkileşimlerini incelemek için çift etiketleme immünofluoresansı gerçekleştirmek için aynı türde yetiştirilen poliklonal ve monoklonal antikorların nasıl kullanılacağını göstermektedir. Çift etiketleme immünoflorooresansı elde etmek için, önce fare poliklonal antikorunu kuluçkaya yatırmak ve daha sonra herhangi bir florroma konjuge edilen ikincil fare IgG antikoru ile inkübasyonu takip etmek çok önemlidir. Bundan sonra, birincil antikorun herhangi bir izinin bir sonraki ikincil antikor tarafından tanınmasını önlemek için ek bir engelleme adımı gereklidir. Daha sonra, bir fare monoklonal antikoru ve farklı bir florokroma konjuge edilen spesifik IgG alt sınıfı ikincil antikor uygun zamanlarda numuneye eklenir. Ek olarak, farklı bir türde yetiştirilen üçüncü bir antikor kullanarak üçlü etiketleme immünofluoresans yapmak mümkündür. Ayrıca, çekirdek ve aksin gibi yapılar daha sonra özel bileşikleri veya etiketleri ile lekelenebilir. Böylece, burada sunulan bu yaklaşımlar, birincil antikor kaynakları sınırlı olan herhangi bir hücre için ayarlanabilir.

Burada, tripozomatidlerdeki belirli yapıları ve proteinleri tanıyan ticari antikorların kullanılabilirliği nedeniyle antikorların kaynağı sınırlı olduğunda immünofluoresans ile konak parazit etkileşimlerinin nasıl incelenerek çalışılacağını gösteriyoruz.
Tripozomatidler arasında, T. cruzi omurgalı ve omurgasız konaklar arasındaki çeşitli gelişim aşamalarını içeren en karmaşık yaşam döngülerinden birine sahiptir 19. T....

Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Burada protokol, konak-patojen etkileşimlerini incelemek için aynı türde yetiştirilen birincil antikorları kullanarak çift etiketleme immünofluoresansının nasıl gerçekleştirildiğini açıklar. Ayrıca, bu protokole farklı bir konaktan gelen üçüncü antikorları da içerebilir. Bu yaklaşım herhangi bir hücre tipinde ve patojende yapılabilir.

Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek için Aynı Türden Antikorlar Kullanarak Çift Etiketleme İmmünofluoresans

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Bu protokolde, aynı konaktan iki antikor, konak hücre ve patojen etkileşimlerini incelemek için immünofluoresans testinde birlikte kullanılabilir. Parazitlerde belirli hücre yapılarını ve proteinleri tanımak için sadece birkaç ticari antikor bulunduğundan, bu protokol çok yararlı olabilir. Bu, aynı türde yetiştirilen poliklonal ve monoklonal antikorları kullanan, gerçekleştirilmesi kolay bir çift etiketleme immünofluoresans protokolüdür.Birçok araştırmacı bunun mümkün olduğunun farkında olmayabilir. Bu yaklaşım, antikorların kaynağı sınırlı olduğunda yardımcı olur. Enfekte konak hücrelerdeki konak hücre proteinlerindeki patojenleri tespit etmek için kullanılabilir ve serbest canlı organizmalara da uygulanabilir.Bu basit bir protokoldür, birinci ve ikinci antikor çifti arasında bir engelleme adımı gerektirir. Prosedür laboratuvarımdan Dr. Camila Gachet-Castro ve doktora öğrencisi Lays Trajano-Silva tarafından gösterilecek. LLC-MK2 hücrelerini Trypanosoma cruzi ile enfekte ettikten üç gün sonra, 15 mililitrelik hücre kültürü konik tüpünde enfekte hücrelerden süpernatant toplayın.Numuneyi hücre kalıntılarını azaltmak için santrifüjlayın, ardından tripomastigotların süpernatanta yüzmesine izin vermek için tüpü oda sıcaklığına yerleştirin. 10 dakika sonra, süpernatantı yeni bir konik tüpte toplayın, ardından örneği santrifüjleyin ve parazitleri içeren peleti tam RPMI ortamında canlandırmadan önce süpernatantı atın. UV sterilize yuvarlak kapaklar içeren 24 kuyulu plakalara LLC-MK2 hücreleri ekleyin ve 16 saat boyunca yerleşmesine izin verin.Daha sonra hücreleri enfekte etmek için, her kuyuya T.Cruzi içeren süpernatant ekleyin ve altı saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, enfekte ve enfekte olmayan hücreleri içeren kapakları PBS ile beş kez yıkayın, ardından PBS'de% 2 paraformaldehit olan hücreleri sabitlayın. 10 dakika sonra, kapakları pbs ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve ardından kapakları iyonik olmayan deterjanla 10 dakika geçirgen hale verin.Üç beş dakikalık PBS yıkamadan sonra, kapakları 30 dakika boyunca blokaj çözeltisinde kuluçkaya yatırın, ardından fare monoklonal veya poliklonal antikor ile 30 dakikalık bir kuluçka daha yapın. PBS yıkandıktan sonra, kapakları bloke çözeltisinde ikincil antikor ve konak hücredeki akrin filamentlerini lekelendirmek için phalloidin ile 30 dakika kuluçkaya bırakın. Ardından, slaytın yüzeyine DAPI ortamlı az miktarda solmaya karşı montaj reaktifi uygulamadan önce kapakları PBS ile üç kez tekrar yıkayın.Tokmakları kullanarak, kabarcık oluşumunu önlemek için örtü kapağını hafifçe ortaya eğin. Çift etiketleme için, kapakları daha önce gösterildiği gibi blokaj çözeltisinde inkübe ettikten sonra, fare poliklonal antikorunda 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kapakları 30 dakika boyunca ikincil antikorla kuluçkaya yatırmadan önce PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.Ardından üç PBS yıkamayı takiben, engelleme çözeltisinde seyreltilmiş AffiniPure tavşan faresi karşıtı IgG ile ikinci bir engelleme adımı gerçekleştirin. 30 dakika sonra, kapakları fare monoklonal antikoru ile 30 dakika daha kuluçkaya yatırmadan önce PBS ile tekrar yıkayın. Daha sonra, üç PBS yıkandıktan sonra, kapak kapaklarını keçi anti-fare IgG 2B antikor ve phalloidin ile kuluçkaya yatırın.Ardından üç PBS yıkamayı takiben, daha önce gösterildiği gibi solmaya karşı montaj reaktifi uygulayın. Üçlü etiketleme için, kapakları bloke ettikten ve fare poliklonal antikor ile inkübasyon yaptıktan sonra, ardından keçi anti-fare antikor, 30 dakika boyunca bloke çözeltisinde tavşan poliklonal antikor ile yeni bir inkübasyon başlatın. Daha sonra üç PBS yıkadıktan sonra, kapak kapaklarını keçi anti-tavşan antikor ile 30 dakika kuluçkaya bırakın.Daha sonra, üç PBS yıkamayı takiben, 30 dakika boyunca blokaj çözeltisinde seyreltilmiş AffiniPure tavşan fare karşıtı antikor ile bir engelleme adımı gerçekleştirin. Daha sonra herhangi bir fare monoklonal IgG alt sınıf antikoru ile kuluçkaya yatırmadan önce kapakları 30 dakika boyunca tekrar yıkayın. Üç PBS yıkamayı takiben, kapak kapaklarını belirli bir çift keçi anti-fare IgG alt sınıf antikoru ile 30 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, kapakları PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. 63X yağ daldırma hedefine sahip bir konfokal mikroskop kullanarak immünofluoresan örnekleri analiz edin ve floresan bir fotomultiplier tüp ve hibrit dedektör ile tespit edin. Ardından, ayrılmış kanallara sahip tüm konfokal görüntüleri alın ve Adobe Photoshop kullanarak görüntü işleme gerçekleştirin.Bu konfokal mikroskopi görüntüleri, konak hücredeki antikorların özgüllüğünü ve içselleştirilmiş paraziti vurgulayan enfekte ve enfekte olmayan hücrelerin kontrol deneyleri ile sonuçları göstermektedir. Fare poliklonal antikor anti-Trypanosoma cruzi FAZ, parazit flagellum'daki flagellum bağlanma bölgesinde T.cruzi dev proteinini tanıdı, ancak konak hücrede tanımadı. Heterojen nükleer ribononiklioprotein A1'in çekirdekteki dağılımı, paraziti değil, sadece konak memeli hücrelerini tanıyan ticari bir fare monoklonal antikoru kullanılarak gözlendi.Ayrıca, konakçı ve parazit çekirdekleri ve parazit kinetoplastları DAPI ile lekelendi ve konak F-actin, antikorların özgüllüğünü doğrulayan Alexa 594'e konjuge edilen phalloidin ile lekelendi. Çift etiketleme immünofluoresansı konakçıdaki protein dağılımlarını ve konfokal mikroskopi ile analiz edilen paraziti gösterir. Etiketleme, bu metodolojiyi kullanan antikorlar arasında çapraz reaksiyon olmadığını öne sürdü.Özetle, konak-patojen etkileşimlerini incelemek için burada açıklanan protokol, antikorların herhangi bir kombinasyonuna uyarlanabilen temel ve ayrıntılı bir teknik sunar. Bu yaklaşım immünofiloresansı uygun maliyetli hale getirir ve az sayıda antikor mevcut olduğunda iki veya daha fazla ilgi proteininin lokalizasyonunu incelemeye yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...