Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81972116، رقم 81972085، رقم 81772394)؛ البرنامج الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ (No.2018B0303110003) ؛ مشروع قوانغدونغ للتعاون الدولي (No.2021A0505030011)؛ مشاريع شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (No.2020M682907) ؛ مؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية الأساسية (رقم 2021A1515010985) ؛ مشروع سانمينغ للطب في شنتشن (SZSM201612079) ؛ صناديق خاصة لبناء مستشفيات رفيعة المستوى في مقاطعة قوانغدونغ.

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات الإنسان في مستشفى شنتشن الثاني للشعب. يوضح الشكل 1 مخططا تخطيطيا للإكسوسومات المعزولة من hSF-MSCs في بروتوكول المختبر.
1. ثقافة SF-MSCs البشرية وتحديد الهوية
<ol><li>حصاد 20 مل من SF باستخدام حقنة وإبرة من م...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlike+bone,+cartilage+regeneration+remains+elusive.">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration.">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li><li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI.">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li><li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation:+past,+present,+and+future.">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li><li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis.">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li><li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee:+a+proof-of-concept+clinical+trial.">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li><li>Pers, Y. M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy.">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li><li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy.">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+(3D)+spheroids.">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury.">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury.">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 206 (2020).</li></ol>

تم استخدام الخلايا الجذعية الوسيطة على نطاق واسع في الطب التجديدي بسبب تجديدها الذاتي ، وتمييزها إلى خلايا الأنسجة ذات الوظائف المتخصصة ، وتأثيرات paracrine16,17. ومن الجدير بالذكر أن تأثيرات الباراكرين التي تمارسها الإكسوسومات قد جذبت الكثير من الاهتمام<sup class="...

لا يزال الفصال العظمي (OA) ، الناتج عن غضروف المفاصل وانهيار العظام الأساسي ، يمثل تحديا شديدا يؤدي إلى الإعاقة 1,2. بدون إمدادات الدم والأعصاب ، تكون قدرة الغضروف على الشفاء الذاتي ضئيلة بمجرد الإصابة 3,4. في العقود الماضية ، حققت العلاجات القائمة على زرع الخلايا الغضروفية الذاتية (ACI) بعض التقدم في علاج OA5. لعزل الخلايا الغضروفية وتوسيعها ، من الضروري حصاد غضروف صغير من المنطقة غير الحاملة للوزن في مفصل OA ، مما يسبب إصابات في الغضروف. أيضا ، سيتطلب الإجراء عملية ثانية لزرع الخلايا الغضروفية الموسعة6. وبالتالي ، فإن العلاجات المكونة من خطوة واحدة لعلاج OA دون إصابات الغضروف تخضع لاستكشاف مكثف.
تم اقتراح الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كبدائل واعدة لعلاج OA 7,8. تنشأ MSCs من أنسجة متعددة ، ويمكن أن تتمايز إلى خلايا غضروفية مع تحفيز محدد. الأهم من ذلك ، يمكن ل MSCs تعديل الاستجابات المناعية عبر مضاد للالتهابات9. لذلك ، فإن MSCs لها مزايا كبيرة في علاج OA عن طريق إصلاح عيوب الغضروف وتعديل الاستجابة المناعية ، خاصة في بيئة الالتهاب. بالنسبة لعلاج OA ، جذبت MSCs من السائل الزليلي (SF-MSCs) مؤخرا الكثير من الاهتمام بسبب قدرتها على تمايز الخلايا الغضروفية الأقوى من مصادر MSC الأخرى10,11. والجدير بالذكر أنه في عيادة العظام ، يعد استخراج SF الالتهابي من تجويف المفصل علاجا روتينيا لتخفيف أعراض الألم لدى مرضى OA. عادة ما يتم التخلص من SF الالتهابي المستخرج كنفايات طبية. كل من المرضى والأطباء على استعداد للنظر في MSCs الذاتية المعزولة عن SF الالتهابية كعلاج OA مع عدد قليل جدا من الصراعات الأخلاقية. ومع ذلك ، فإن علاج SF-MSC معرض للخطر بسبب المخاطر السرطانية ، والتخزين طويل الأمد ، وحواجز الشحن البعيدة.
تحمل الإكسوسومات ، التي تفرزها العديد من أنواع الخلايا ، بما في ذلك MSCs ، معظم المعلومات الحيوية للخلية الأم. وقد تم التحقيق فيه بشكل متعمق كعلاج خال من الخلايا12,13. وفقا للموارد المحدثة المتاحة على موقع حكومة التجارب السريرية (ClinicalTrials.gov) ، يتم بدء دراسات سريرية أكثر شمولا وإجراؤها في مجالات أبحاث السرطان وارتفاع ضغط الدم والأمراض العصبية التنكسية. يمكن أن يكون علاج الإكسوسوم SF-MSC تجربة مثيرة وصعبة للتعامل مع OA. يعد إنتاج الإكسوسومات من فئة ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) والإنتاج الخارجي على نطاق واسع أمرا ضروريا للترجمة السريرية. تم إجراء عزل الإكسوسوم على نطاق صغير على نطاق واسع على أساس زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D). ومع ذلك ، تحتاج استراتيجيات إنتاج exosome واسعة النطاق إلى التحسين. تم تطوير طريقة تصنيع إكسوسوم واسعة النطاق في هذه الدراسة ، استنادا إلى ثقافة SF-MSC الضخمة في ظروف خالية من الأجانب. بعد الطرد المركزي الفائق من المواد الفائقة لزراعة الخلايا ، تم التحقق من سلامة ووظيفة الإكسوزوم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

تم اقتراح الإكسوسومات التي تفرزها الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كمرشحين واعدين لإصابات الغضاريف وعلاج هشاشة العظام. تتطلب الإكسوسومات للتطبيق السريري إنتاجا واسع النطاق. وتحقيقا لهذا الهدف، نمت مركبات MSCs للسائل الزليلي البشري (hSF-MSCs) على حبات حاملة للصغر، ثم زرعت في نظام استزراع ديناميكي ثلاثي الأبعاد (3D). من خلال استخدام الثقافة الديناميكية 3D ، نجح هذا البروتوكول في الحصول على إكسوسومات واسعة النطاق من سوبرناتورز ثقافة SF-MSC. تم حصاد الإكسوسومات عن طريق الطرد المركزي الفائق والتحقق منها بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل ، وفحص انتقال الجسيمات النانوية ، والنشاف الغربي. أيضا ، تم الكشف عن السلامة الميكروبيولوجية للإكسوسومات. تشير نتائج الكشف عن الإكسوسومات إلى أن هذا النهج يمكن أن ينتج عددا كبيرا من الإكسوسومات الجيدة من فئة ممارسات التصنيع (GMP). يمكن استخدام هذه الإكسوسومات في أبحاث البيولوجيا الإكسوسومية وعلاج هشاشة العظام السريرية.

تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد العلامات السطحية ل SF-MSCs ، وفقا للحد الأدنى من المعايير لتحديد MSCs البشرية الموصى بها من قبل الجمعية الدولية للعلاج الخلوي14,15. كشف تحليل قياس التدفق الخلوي أن SF-MSCs المستزرعة في هذه الدراسة استوفت معايير تحديد MSCs. وكانت سلب?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

هنا ، نقدم بروتوكولا لإنتاج عدد كبير من الإكسوسومات من الدرجة GMP من الخلايا الجذعية الوسيطة للسائل الزليلي باستخدام مفاعل حيوي 3D.

إعداد واسع النطاق للسائل الزليلي الوسيط الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة بواسطة ثقافة المفاعل الحيوي 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

نحن نقدم بروتوكولا لإنتاج عدد كبير من الإكسوسومات من الدرجة GMP من الخلايا الجذعية الوسيطة للسائل الزليلي باستخدام مفاعلنا الحيوي 3D. يمكن استخدام هذه الإكسوسومات في أبحاث بيولوجيا الإكسوسوم وعلاج التهاب المفاصل السريري. سيتم عرض الإجراء الدكتور يوجي ليانغ.ابدأ في جمع الخلايا الوسيطة البشرية ، أو MSCs ، عن طريق الطرد المركزي للسائل الزليلي عند 1،500 مرة من G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبة الخلية ب 10 ملليلتر من PBS. قم بالطرد المركزي للخلايا المعاد تعليقها عند 1،500 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من PBS قبل إعادة تعليق الكريات ب 10 ملليلتر من وسط ثقافة MSC البشري بكثافة خلية تبلغ خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر ثم قم بطلاء التعليق في طبق 100 ملم.احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد أسبوعين ، اجمع السوبرناتانت المزروع الخلوي لتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة للسائل الزليلي ، أو SF-MSCs ، باستخدام قياس التدفق الخلوي. للقيام بذلك ، قم بهضم الجيل الثالث من مرور ثلاثة من SF-MSCs عن طريق الطرد المركزي عند 1000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.ثم ، تخلص من supernatant قبل جمع بيليه الخلية. بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع إلى حبيبة الخلية بتركيز خمسة أضعاف 10 إلى الرابع واسمح للحبيبة بالوقوف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 15 دقيقة ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية كما هو موضح سابقا ، ثم أعد تعليق الكريات المنفصلة في 100 ميكرولتر من 1X PBS.أضف ميكرولتر واحد من الجسم المضاد الفلوري أحادي النسيلة بنسبة تخفيف 1:100 لكل أنبوب كما هو موضح في المخطوطة ، وضع الأنبوب للحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1X PBS وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 1X PBS. بعد ذلك ، اكتشف الفلوروفورات في ما يصل إلى 10000 خلية على مقياس التدفق الخلوي باستخدام القنوات الحمراء وقنوات FITC.لإعداد الناقلات الدقيقة ، قم بنفخ وترطيب 0.75 جرام جاف من الناقلات الدقيقة في 1X DPBS بتركيز 50 ملليغرام لكل جرام لمدة ثلاث ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ثم ، صب supernatant لغسل microcarriers في DPBS جديدة لمدة خمس دقائق. بعد استبدال الوسط ب 1X DPBS طازج عند 50 ملليغرام من الناقلات الدقيقة لكل غرام ، قم بتعقيم الناقلات الدقيقة عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة عند 15 رطلا لكل بوصة مربعة.ثم ، اسمح للناقلات الدقيقة المعقمة بالاستقرار قبل صب السوبرناتانت. شطف الناقلات الدقيقة في وسط الثقافة بتركيز 50 ملليغرام من الناقلات الدقيقة لكل غرام في درجة حرارة الغرفة. عندما يتم تسوية الناقلات الدقيقة ، تخلص من supernatant.لإعداد المفاعل الحيوي التروية ، قم بتعقيم المفاعل الحيوي عن طريق التعقيم كما هو موضح سابقا. عند الانتهاء، احسب عدد SF-MSCs لتخصيص 2.5 في 10 إلى SF-MSCs السابع والناقلات الدقيقة إلى المفاعل الحيوي الذي يتم تشغيله مع 250 ملليلتر من وسط استزراع MSC من فئة GMP. ضع المفاعل الحيوي في حاضنة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية بسرعة 15 دورة في الدقيقة.تغيير الوسط الثقافي كل ستة أيام. بعد 14 يوما ، اجمع الخارقين لزراعة الخلايا والناقلات الدقيقة لمزيد من التحليل. الطرد المركزي لمزرعة الخلايا الفائقة في 300 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وجمع supernatant مع التخلص من الحطام الخلوي.عند أربع درجات مئوية ، قم بالطرد المركزي بالتتابع للجهاز الفائق عند 2،000 مرة G لمدة 10 دقائق ثم في 10،000 مرة G لمدة 30 دقيقة للتخلص من الحويصلات الأكبر وجمع الكريات. بعد تعليق الكريات في 40 ملليلتر من PBS ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 120،000 مرة G لمدة 70 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم ، أعد تعليق الكريات التي تم جمعها والتي تحتوي على إكسوسومات في 500 ميكرولتر من PBS.قم بتخفيف عينات الإكسوسوم المعزولة حديثا باستخدام PBS المعقمة إلى تركيز 10 إلى السابع إلى 10 إلى الجسيمات التاسعة لكل ملليلتر وحقن 500 ميكرولتر من العينة لكل منها في تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، أو نظام NTA ، عند 30 ميكرولتر في الدقيقة و 24.4 إلى 24.5 درجة مئوية. اضبط نظام الالتقاط والتحليل يدويا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تصور الجسيمات عن طريق تشتت ضوء الليزر والتقاط حركتها البراونية على الفيديو الرقمي.بعد ذلك ، قم بتحليل أشرطة الفيديو المسجلة باستخدام البرنامج ، وتتبع ما لا يقل عن 200 جسيم فردي لكل تشغيل. بالنسبة للنشاف الغربي ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل وكوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني إلى الإكسوسومات مع الخلط عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ثم ، اسمح للوقوف على الجليد لمدة 20 دقيقة.بعد الطرد المركزي للخليط عند 9،391 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، قم بقياس تركيز البروتين في supernatant باستخدام مجموعة فحص البروتين. بعد الفحص ، قم بتسخين العينة مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل البروتين 4X عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتحميل 15 ميكرولتر من البروتينات بتركيز 10 ملليغرام لكل ملليلتر لتشغيلها بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي عند 120 فولت لمدة 70 دقيقة ، والنشاف الكهربائي عند 100 فولت لمدة 60 دقيقة عند أربع درجات مئوية.اكتشف العلامات المحددة غير الإكسوسومية ، مثل الكالنكسين والمؤشرات الحيوية الخارجية مثل CD9 و CD63 و CD81 عن طريق النشاف الغربي الفلورسنت. في الدراسة ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد العلامات السطحية ل SF-MSCs. كشف تحليل قياس التدفق الخلوي أن SF-MSCs المستزرعة كانت سلبية ل CD34 و CD45 و HLA-DR ، وإيجابية ل CD73 و CD90 و CD105 ، مستوفية لمعايير تحديد MSCs.تحت المجهر المقلوب ، لوحظ أن SF-MSCs تنتشر على الناقلات الدقيقة. انتشرت SF-MSC في ثقافة 3D بسرعة أكبر من ستة أيام فصاعدا مقارنة بثقافة 2D. تم تحديد الإكسوسومات من SF-MSCs من ثقافة 2D و 3D باستخدام النشاف الغربي ووجد أن الإكسوسومات تعبر عن CD63 و CD9 و CD81 بينما تكون سلبية للكالنكسين.أظهر تحليل الخلايا النانوية أن قطر الإكسوسومات 2D و 3D كان حوالي 120 نانومتر. كشف التحليل المجهري الإلكتروني للانتقال عن مورفولوجيا الإكسوسومات 2D و 3D ، مما يدل على الحويصلات الكروية تقريبا. باستخدام تحليل NTA ، تم تحليل تركيز الجسيمات بحجم 30 إلى 160 نانومتر.بعد الثقافة ثلاثية الأبعاد ، كان تركيز الجسيمات 4.0 مرات 10 إلى ستة لكل ملليلتر. ومع ذلك ، بعد ثقافة 2D ، كان تركيز الجسيمات بنفس الحجم 2.5 مرة 10 إلى ستة لكل ملليلتر. علاوة على ذلك ، أنتجت ثقافة 3D بروتينا خارجيا أكثر من ثقافة 2D.يظهر التحليل التمثيلي استيعاب الإكسوسومات التي تحمل علامة ديل بواسطة الخلايا الغضروفية الأولية. يمكن رؤية الإكسوسومات التي تحمل علامة ديل والتي دخلت الخلايا الغضروفية الأولية مع ذروة في ثلاث ساعات. أظهرت دراسة التسليم في المختبر أن الإكسوسومات يمكن أن توصل السلفو سيانين3 microRNA-140 المسمى بالسلو إلى الخلايا الغضروفية.إن طلاء الخلايا ، وبدء التفاعل في المفاعل الحيوي ، و supernatant هي أهم الخطوات في هذا البروتوكول. تستخدم ثقافة 3D بشكل شائع للزراعة واسعة النطاق للخلايا الملتصقة. يمكن أيضا استخدام طرق أخرى مثل spin flex لإنتاج الإكسوسومات على نطاق واسع.تعمل طريقتنا على تحسين إنتاجية الإكسوسومات ، وبالتالي تمكين التطبيق قبل السريري القائم على MSC exosome.

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

ونظام 3D لغضروفية التثقيف مفصلي الإنسان في السائل الزليلي

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium الفحص على نطاق واسع لتطبيقات SNP التنميط الجيني

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

تحديد المنظمين رواية نتح النبات من خلال فحص التصوير الحراري على نطاق واسع في Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

إجراء سيميومتوميد ChIP-Seq للدراسات اللاجينية على نطاق واسع

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...