Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

National Natural Science Foundation of China (nr. 81972116, nr. 81972085, nr. 81772394); Nøgleprogram for naturvidenskabsfonden i Guangdong-provinsen (nr. 2018B0303110003); Guangdong internationalt samarbejdsprojekt (nr. 2021A0505030011); Shenzhen videnskabs- og teknologiprojekter (nr. GJHZ20200731095606019, nr. JCYJ20170817172023838, nr. JCYJ20170306092215436, nr. JCYJ20170413161649437); Kina Postdoctoral Science Foundation (nr. 2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (nr. 2021A1515010985); Sanming Projekt af Medicin i Shenzhen (SZSM201612079); Særlige midler til opførelse af hospitaler på højt niveau i Guangdong-provinsen.

Denne undersøgelse blev godkendt af Human Ethics Committee of Shenzhen Second People's Hospital. Figur 1 viser et skematisk diagram over exosomer isoleret fra hSF-MSC'er in vitro-protokollen.
1. Menneskets SF-MSC'ers kultur og identifikation
<ol><li>Høst 20 ml SF ved hjælp af en sprøjte og nål fra kliniske OA-patienter.<ol><li>Desinficer knæleddet hos OA-patienten. Punktering fra quadriceps femoris senen uden for patellaen ind i l...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlike+bone,+cartilage+regeneration+remains+elusive.">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration.">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li><li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI.">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li><li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation:+past,+present,+and+future.">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li><li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis.">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li><li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee:+a+proof-of-concept+clinical+trial.">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li><li>Pers, Y. M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy.">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li><li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy.">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+(3D)+spheroids.">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury.">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury.">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 206 (2020).</li></ol>

De mesenkymale stamceller er blevet meget udbredt i regenerativ medicin på grund af deres selvfornyelse, differentieret til vævsceller med specialiserede funktioner og parakrine virkninger16,17. Især har de parakrine virkninger, der udøves af exosomer, tiltrukket sig stor opmærksomhed18. Exosomer bærer bioinformation fra MSC'er og udfører deres biologiske funktion og overvinder MSC-mangler, såsom besværlig opbevaring og forsendels...

Slidgigt (OA), der skyldes ledbrusk og underliggende knoglenedbrydning, er fortsat en alvorlig udfordring, der fører til handicap 1,2. Uden blod og nerveforsyning er brusk selvhelbredende evne minimal, når man først er blevet skadet 3,4. I de sidste årtier har terapier baseret på autolog chondrocytimplantation (ACI) gjort nogle fremskridt i OA-behandling5. For chondrocytisolering og ekspansion er det nødvendigt at høste lille brusk fra OA-leddets ikke-vægtbærende område, hvilket forårsager skader på brusk. Proceduren vil også kræve en anden operation for at implantere de ekspanderede kondrocytter6. Således er et-trins terapier til OA-behandling uden bruskskader under omfattende udforskning.
Mesenkymale stamceller (MSC'er) er blevet foreslået som lovende alternativer til OA-behandling 7,8. MSC'er stammer fra flere væv og kan differentiere sig til kondrocytter med specifik stimulering. Det er vigtigt, at MSC'er kan modulere immunresponser via anti-inflammation9. Derfor har MSC'er betydelige fordele ved OA-behandling ved at reparere bruskdefekter og modulere immunresponset, især i inflammationsmiljøet. Til OA-behandling har MSC'er fra synovialvæske (SF-MSC'er) for nylig tiltrukket sig stor opmærksomhed på grund af deres stærkere chondrocytdifferentieringsevne end andre MSC-kilder10,11. Især på ortopædisk klinik er ekstraktionen af inflammatorisk SF fra ledhulen en rutinemæssig terapi for at lindre smertesymptomet hos OA-patienter. Ekstraheret inflammatorisk SF bortskaffes normalt som medicinsk affald. Både patienter og læger er klar til at betragte autologe MSC'er isoleret fra den inflammatoriske SF som OA-behandling med meget få etiske konflikter. Imidlertid er SF-MSC-terapi kompromitteret på grund af tumorfremkaldende risici, langvarig opbevaring og fjerne forsendelsesbarrierer.
Exosomer, der udskilles af mange celletyper, herunder MSC'er, bærer det meste af forældrecellens bioinformation. Det er blevet undersøgt i dybden som en cellefri terapi12,13. Ifølge de opdaterede ressourcer, der er tilgængelige på webstedet for klinisk forsøgsregering (ClinicalTrials.gov), indledes og gennemføres mere omfattende exosome kliniske undersøgelser inden for forskningsområderne kræft, hypertension og neurodegenerative sygdomme. SF-MSC exosome-behandling kan være et spændende og udfordrende forsøg til at klare OA. God fremstillingspraksis (GMP) og storstilet exosomproduktion er afgørende for klinisk oversættelse. Exosomisolering i lille skala er blevet udført bredt baseret på todimensionel (2D) cellekultur. Imidlertid skal store exosomproduktionsstrategier optimeres. En storstilet exosomfremstillingsmetode blev udviklet i denne undersøgelse baseret på massiv SF-MSC-kultur under xeno-fri forhold. Efter ultracentrifugering fra cellekultursupernatanter blev exosomsikkerhed og funktion valideret.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

Exosomer udskilt af mesenkymale stamceller (MSC'er) er blevet foreslået som lovende kandidater til bruskskader og slidgigtbehandling. Exosomer til klinisk anvendelse kræver produktion i stor skala. Til dette formål blev humane synovialvæske MSC'er (hSF-MSC'er) dyrket på mikrocarrierperler og derefter dyrket i et dynamisk tredimensionelt (3D) kultursystem. Ved at bruge 3D-dynamisk kultur opnåede denne protokol med succes store exosomer fra SF-MSC-kultursupernatanter. Exosomer blev høstet ved ultracentrifugering og verificeret af et transmissionselektronmikroskop, nanopartikeltransmissionsanalyse og western blotting. Også den mikrobiologiske sikkerhed af exosomer blev detekteret. Resultater af exosomdetektion tyder på, at denne tilgang kan producere et stort antal exosomer af god fremstillingspraksis (GMP) kvalitet. Disse exosomer kunne anvendes i exosombiologi forskning og klinisk slidgigt behandling.

Flowcytometri blev brugt til at identificere overflademarkører for SF-MSC'er i henhold til de minimale kriterier for at definere humane MSC'er anbefalet af International Society for Cellular Therapy14,15. Flowcytometrianalyse afslørede, at SF-MSC'er dyrket i denne undersøgelse opfyldte identifikationskriterierne for MSC'er. De var negative for CD34, CD45 og HLA-DR (under 3%) og positive for CD73, CD90 og CD105 (over 95%) (figur 2)...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Her præsenterer vi en protokol til fremstilling af et stort antal GMP-grade exosomer fra synovialvæskemesenkymale stamceller ved hjælp af en 3D-bioreaktor.

Storskala forberedelse af synovialvæske mesenkymale stamcelleafledte exosomer ved 3D bioreaktorkultur

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Vi præsenterer en protokol til fremstilling af et stort antal GMP-grade exosomer fra synovialvæske mesenkymale stamceller ved hjælp af vores 3D-bioreaktor. Disse exosomer kunne bruges i exosombiologi forskning og klinisk arthritis behandling. Demonstrerer proceduren vil være Dr.Yujie Liang.Begynd at indsamle de humane mesenkymale celler eller MSC'er ved at centrifugere synovialvæsken ved 1.500 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Efter centrifugering kasseres supernatanten og resuspenderer cellepelleten med 10 ml PBS. Centrifuge de resuspenderede celler ved 1.500 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius og kassér PBS, før pelleten genanvendes med 10 ml humant MSC-kulturmedium ved en celletæthed på fem gange 10 til de fjerde celler pr. milliliter og plade derefter suspensionen i en 100 millimeter skål.Inkuber skålen ved 37 grader Celsius i en atmosfære, der indeholder 5% kuldioxid. Efter to uger indsamles cellekulturens supernatant for at identificere synovialvæskemesenkymale stamceller eller SF-MSC'er ved hjælp af flowcytometri. For at gøre det fordøjes tredje generations passage tre af SF-MSC'er ved centrifugering ved 1.000 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius.Kassér derefter supernatanten, inden cellepelleten opsamles. Derefter tilsættes 400 mikroliter af blokeringsbufferen til cellepelleten i koncentrationen på fem gange 10 til den fjerde og lad pelleten stå i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter 15 minutter centrifugeres cellesuspensionen som beskrevet tidligere, og den separerede pille resuspenderes derefter i 100 mikroliter 1X PBS.Tilsæt en mikroliter af det monoklonale fluorescerende antistof ved et fortyndingsforhold på 1:100 pr. rør som beskrevet i manuskriptet, og anbring røret til inkubation ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter inkubation vaskes cellerne to gange med 1X PBS og cellerne resuspenderes i 100 mikroliter 1X PBS. Derefter detekteres fluorophorerne i op til 10.000 celler på et flowcytometer ved hjælp af røde og FITC-kanaler.For at forberede mikrobærerne svulmes og hydreres 0,75 gram mikrocarriers i 1X DPBS i en koncentration på 50 milligram pr. gram i mindst tre timer ved stuetemperatur. Dekanter derefter supernatanten for at vaske mikrocarriers i frisk DPBS i fem minutter. Efter udskiftning af mediet med frisk 1X DPBS ved 50 milligram mikrocarriers pr. Gram, steriliseres mikrocarriererne ved autoklavering ved 121 grader Celsius i 15 minutter ved 15 pund pr. Kvadrattomme.Lad derefter de steriliserede mikrocarriers slå sig ned, før supernatanten dekanteres. Mikrocarriers skylles i kulturmediet i en koncentration på 50 milligram mikrocarriers pr. gram ved stuetemperatur. Når mikrocarriers er afgjort, skal du kassere supernatanten.For at forberede perfusionsbioreaktor steriliseres bioreaktoren ved autoklavering som beskrevet tidligere. Når du er færdig, skal du tælle antallet af SF-MSC'er for at allokere 2,5 gange 10 til de syvende SF-MSC'er og mikrocarriers til bioreaktoren, der er perfunderet med 250 ml af GMP-kvalitet MSC-kulturmediet. Placer bioreaktoren i en inkubator med 5% kuldioxid ved 37 grader Celsius med en hastighed på 15 rotationer pr. Minut.Skift kulturmediet hver sjette dag. Efter 14 dage indsamles cellekultursupernatanter og mikrocarriers til yderligere analyse. Centrifuger cellekulturens supernatant ved 300 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius, og opsaml supernatanten, mens cellulære affald kasseres.Ved fire grader Celsius centrifugeres supernatanten sekventielt ved 2.000 gange G i 10 minutter og derefter ved 10.000 gange G i 30 minutter for at kassere de større vesikler og opsamle pelleten. Efter at have resueret pelleten i 40 ml PBS, centrifugeres cellesuspensionen ved 120.000 gange G i 70 minutter ved fire grader Celsius. Derefter resuspenderes den opsamlede pellet indeholdende exosomer i 500 mikroliter PBS.Fortynd de friskisolerede exosomprøver med steril PBS til koncentrationen fra 10 til syvende til 10 til niende partikler pr. milliliter og injicer 500 mikroliter af prøven for hver løb ind i nanopartikelsporingsanalysen eller NTA-systemet ved 30 mikroliter i minuttet og 24,4 til 24,5 grader Celsius. Indstil manuelt optagelses- og analysesystemet i henhold til producentens protokol. Visualiser partiklerne ved hjælp af laserlysspredning og optag deres brownske bevægelse på digital video.Analysér derefter de optagede videobånd ved hjælp af software og sporing af mindst 200 individuelle partikler pr. Kørsel. Til Western blotting tilsættes 300 mikroliter lysisbuffer og proteasehæmmere cocktail til exosomerne med blanding ved pipettering op og ned. Lad den derefter stå på is i 20 minutter.Efter centrifugering af blandingen ved 9.391 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius måles proteinkoncentrationen i supernatanten ved hjælp af et proteinanalysesæt. Efter analysen opvarmes prøven med 100 mikroliter 4X proteinbelastningsbuffer ved 100 grader Celsius i 10 minutter. Derefter indlæses 15 mikroliter proteiner i en koncentration på 10 milligram pr. milliliter for at køre ved gelelektroforese ved 120 volt i 70 minutter og elektroblotting ved 100 volt i 60 minutter ved fire grader Celsius.Detekter de ikke-exosomspecifikke markører, såsom calnexin og de exosomale biomarkører såsom CD9, CD63 og CD81 ved fluorescerende Western blotting. Flowcytometrianalyse afslørede, at de dyrkede SF-MSC'er var negative for CD34, CD45 og HLA-DR og positive for CD73, CD90 og CD105, der opfyldte identifikationskriterierne for MSC'er.Under omvendt mikroskopi blev det bemærket, at SF-MSC'erne spredes på mikrocarriers. SF-MSC spredte sig hurtigere i 3D-kultur fra seks dage og fremefter sammenlignet med 2D-kultur. Exosomerne fra SF-MSC'er af 2D- og 3D-kultur blev identificeret ved hjælp af Western blotting, og exosomerne viste sig at udtrykke CD63, CD9 og CD81, mens de var negative for calnexin.Nanocytanalysen viste, at diameteren af 2D- og 3D-exosomer var ca. 120 nanometer. Transmissionselektronmikroskopisk analyse afslørede morfologien af 2D- og 3D-exosomer, der viser omtrent sfæriske vesikler. Ved hjælp af NTA-analyse blev koncentrationen af partikler på 30 til 160 nanometer analyseret.Efter 3D-kultur var partikelkoncentrationen 4,0 gange 10 til seks pr. milliliter. Efter 2D-kulturen var koncentrationen af partikler af samme størrelse imidlertid 2, 5 gange 10 til seks pr. Milliliter. Desuden producerede 3D-kultur mere exosomprotein end 2D-kultur.Den repræsentative analyse viser internaliseringen af Dil-mærkede exosomer af primære chondrocytter. Dil-mærkede exosomer kom ind i primære kondrocytter kan ses med en top på tre timer. In vitro leveringsundersøgelse viste, at exosomer kunne levere sulfo-cyanin3-mærket mikroRNA-140 til chondrocytter.Plating af cellerne, start af reaktionen i bioreaktoren og supernatanten er de vigtigste trin i denne protokol. 3D-kultur bruges almindeligvis til storskala kultur af klæbende celler. Andre metoder såsom spin flex kan også bruges til storskala produktion af exosomer.Vores metode forbedrer udbyttet af exosomer og muliggør dermed MSC exosombaseret præklinisk anvendelse.

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

En 3D-system til dyrkning Menneskelige artikulær chondrocytter i synovialvæske

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium Assay for Storstilet SNP Genotypebestemmelse Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

En strategi for følsomme, Large Scale Kvantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Forberedelse af prøver og billeddannelse af Exosomes af transmissions Elektron Mikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk aktiveret celle sortering strategier for at isolere og rense Synovial væske-afledte mesenkymale stamceller fra en kanin Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identifikation af nye regulatorer af plantetranspiration ved storstilet termisk billeddannelse screening i Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

En halvautomatisk ChIP-Seq-procedure for store epigenetiske studier

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...