Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

National Natural Science Foundation of China (nr. 81972116, nr. 81972085, nr. 81772394); Key Program of Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (No.2018B0303110003); Guangdong Internationaal Samenwerkingsproject (Nr.2021A0505030011); Shenzhen Wetenschaps- en Technologieprojecten (Nr. GJHZ20200731095606019, Nr. JCYJ20170817172023838, Nr. JCYJ20170306092215436, Nr. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (Nr.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Nr.2021A1515010985); Sanming Project van Geneeskunde in Shenzhen (SZSM201612079); Speciale fondsen voor de bouw van ziekenhuizen op hoog niveau in de provincie Guangdong.

Deze studie werd goedgekeurd door de Human Ethics Committee van Shenzhen Second People's Hospital. Een schematisch diagram van exosomen geïsoleerd uit het hSF-MSCs in vitro protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Menselijke SF-MSC's cultuur en identificatie
<ol><li>Oogst 20 ml SF met behulp van een spuit en naald van klinische artrosepatiënten.<ol><li>Desinfecteer het kniegewricht van de artrosepatiënt. Punctie van de quadriceps femo...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlike+bone,+cartilage+regeneration+remains+elusive.">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration.">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li><li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI.">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li><li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation:+past,+present,+and+future.">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li><li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis.">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li><li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee:+a+proof-of-concept+clinical+trial.">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li><li>Pers, Y. M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy.">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li><li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy.">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+(3D)+spheroids.">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury.">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury.">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 206 (2020).</li></ol>

De mesenchymale stamcellen zijn op grote schaal gebruikt in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun zelfvernieuwing, gedifferentieerd tot weefselcellen met gespecialiseerde functies en paracriene effecten16,17. Met name de paracriene effecten van exosomen hebben veel aandacht getrokken18. Exosomen dragen de bio-informatie van MSC's en vervullen hun biologische functie en overwinnen MSC-tekortkomingen, zoals problematische opslag en verzen...

Artrose (OA), als gevolg van gewrichtskraakbeen en onderliggende botafbraak, blijft een ernstige uitdaging die leidt tot invaliditeit 1,2. Zonder bloed- en zenuwtoevoer is het zelfgenezend vermogen van kraakbeen minimaal als het eenmaal gewond isgeraakt 3,4. In de afgelopen decennia hebben therapieën op basis van autologe chondrocytenimplantatie (ACI) enige vooruitgang geboekt bij de behandeling van artrose5. Voor chondrocytenisolatie en -uitbreiding is het oogsten van klein kraakbeen uit het niet-gewichtdragende gebied van het OA-gewricht noodzakelijk, waardoor verwondingen aan het kraakbeen ontstaan. Ook vereist de procedure een tweede operatie om de uitgebreide chondrocyten te implanteren6. Zo worden eenstapstherapieën voor artrosebehandeling zonder kraakbeenletsels uitgebreid onderzocht.
Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn voorgesteld als veelbelovende alternatieven voor behandeling met artrose 7,8. Afkomstig van meerdere weefsels, kunnen MSC's differentiëren in chondrocyten met specifieke stimulatie. Belangrijk is dat MSC's immuunresponsen kunnen moduleren via anti-ontsteking9. Daarom hebben MSC's aanzienlijke voordelen bij de behandeling van artrose door kraakbeendefecten te repareren en de immuunrespons te moduleren, vooral in het ontstekingsmilieu. Voor de behandeling van artrose hebben MSC's uit synoviale vloeistof (SF-MSC's) onlangs veel aandacht getrokken vanwege hun sterkere chondrocytendifferentiatievermogen dan andere MSC-bronnen10,11. Met name in de orthopedische kliniek is de extractie van inflammatoire SF uit de gewrichtsholte een routinetherapie om het pijnsymptoom van OA-patiënten te verlichten. Geëxtraheerde inflammatoire SF wordt meestal weggegooid als medisch afval. Zowel patiënten als artsen zijn klaar om autologe MSC's geïsoleerd uit de inflammatoire SF te beschouwen als OA-behandeling met zeer weinig ethische conflicten. SF-MSC-therapie is echter gecompromitteerd als gevolg van tumorogene risico's, langdurige opslag en verre verzendbarrières.
Exosomen, uitgescheiden door vele celtypen, waaronder MSC's, dragen het grootste deel van de bio-informatie van de moedercel. Het is diepgaand onderzocht als een celvrije therapie12,13. Volgens de bijgewerkte bronnen die beschikbaar zijn op de website van de overheid van klinische studies (ClinicalTrials.gov), worden uitgebreidere exosoom klinische studies geïnitieerd en uitgevoerd op het gebied van kanker, hypertensie en neurodegeneratieve ziekten. SF-MSC exosoombehandeling kan een spannende en uitdagende studie zijn om met artrose om te gaan. Good manufacturing practice (GMP)-grade en grootschalige exosoomproductie zijn essentieel voor klinische vertaling. Kleinschalige exosoomisolatie is op grote schaal uitgevoerd op basis van tweedimensionale (2D) celcultuur. Grootschalige exosoomproductiestrategieën moeten echter worden geoptimaliseerd. In deze studie werd een grootschalige productiemethode voor exosomen ontwikkeld, gebaseerd op massale SF-MSC-cultuur in xenovrije omstandigheden. Na ultracentrifugatie van celkweeksupernatanten werden de veiligheid en functie van exosoom gevalideerd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

Exosomen uitgescheiden door mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn gesuggereerd als veelbelovende kandidaten voor kraakbeenletsels en artrosebehandeling. Exosomen voor klinische toepassing vereisen grootschalige productie. Daartoe werden menselijke synoviale vloeistof-MSC's (hSF-MSC's) gekweekt op microcarrierparels en vervolgens gekweekt in een dynamisch driedimensionaal (3D) kweeksysteem. Door gebruik te maken van 3D dynamische cultuur, heeft dit protocol met succes grootschalige exosomen verkregen uit SF-MSC-cultuursupernatanten. Exosomen werden geoogst door ultracentrifugatie en geverifieerd door een transmissie-elektronenmicroscoop, nanodeeltjestransmissietest en western blotting. Ook werd de microbiologische veiligheid van exosomen gedetecteerd. Resultaten van exosoomdetectie suggereren dat deze aanpak een groot aantal good manufacturing practices (GMP)-grade exosomen kan produceren. Deze exosomen kunnen worden gebruikt in exosoombiologisch onderzoek en klinische artrosebehandeling.

Flowcytometrie werd gebruikt om de oppervlaktemarkers van SF-MSC's te identificeren, volgens de minimale criteria om menselijke MSC's te definiëren die worden aanbevolen door de International Society for Cellular Therapy14,15. Flowcytometrie-analyse toonde aan dat SF-MSC's gekweekt in deze studie voldeden aan de identificatiecriteria van MSC's. Ze waren negatief voor CD34, CD45 en HLA-DR (minder dan 3%) en positief voor CD73, CD90 en CD105 (boven 95%) (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Hier presenteren we een protocol om een groot aantal GMP-grade exosomen te produceren uit synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen met behulp van een 3D-bioreactor.

Grootschalige bereiding van synoviale vloeistof Mesenchymale stamcel-afgeleide exosomen door 3D Bioreactor Cultuur

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

We presenteren een protocol om een groot aantal GMP-grade exosomen te produceren uit synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen met behulp van onze 3D-bioreactor. Deze exosomen kunnen worden gebruikt in exosoombiologisch onderzoek en klinische artritisbehandeling. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr.Yujie Liang.Begin met het verzamelen van de menselijke mesenchymale cellen, of MSC's, door de synoviale vloeistof te centrifugeren op 1, 500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi na centrifugatie het supernatant weg en resuspenseer de celpellet met 10 milliliter PBS. Centrifugeer de geresuspendeerde cellen op 1.500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en gooi PBS weg voordat u de pellet resuspendeert met 10 milliliter menselijk MSC-kweekmedium bij een celdichtheid van vijf keer 10 tot de vierde cellen per milliliter en plaats de suspensie vervolgens in een schaal van 100 millimeter.Incubeer het gerecht bij 37 graden Celsius in een atmosfeer die 5% koolstofdioxide bevat. Verzamel na twee weken het celkweeksupernatant om synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen of SF-MSC's te identificeren met behulp van flowcytometrie. Om dit te doen, verteer de derde generatie passage drie van SF-MSC's door centrifugatie op 1.000 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Gooi vervolgens het supernatant weg voordat u de celpellet verzamelt. Voeg vervolgens 400 microliter van de blokkerende buffer toe aan de celpellet in de concentratie van vijf keer 10 tot de vierde en laat de pellet 15 minuten op kamertemperatuur staan. Na 15 minuten centrifugeert u de celsuspensie zoals eerder beschreven en resuspendeert u de gescheiden pellet vervolgens in 100 microliter 1X PBS.Voeg één microliter van het monoklonale fluorescerende antilichaam toe met een verdunningsverhouding van 1:100 per buis zoals beschreven in het manuscript en plaats de buis voor incubatie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was de cellen na incubatie tweemaal met 1X PBS en resuspenseer de cellen in 100 microliter 1X PBS. Detecteer vervolgens de fluoroforen in maximaal 10.000 cellen op een flowcytometer met behulp van rode en FITC-kanalen.Om de microdragers te bereiden, zwellen en hydrateren droog 0,75 gram van de microdragers in 1X DPBS in de concentratie van 50 milligram per gram gedurende ten minste drie uur bij kamertemperatuur. Decanteer vervolgens het supernatant om de microdragers gedurende vijf minuten in verse DPBS te wassen. Na het medium te hebben vervangen door verse 1X DPBS bij 50 milligram van de microdragers per gram, steriliseer de microdragers door 15 minuten te autoclaveren bij 121 graden Celsius bij 15 pond per vierkante inch.Laat vervolgens de gesteriliseerde microdragers bezinken voordat u het supernatant decanteert. Spoel de microdragers in het kweekmedium in de concentratie van 50 milligram van de microdragers per gram bij kamertemperatuur. Wanneer de microdragers zijn bezonken, gooit u het supernatant weg.Om perfusiebioreactor voor te bereiden, steriliseert u de bioreactor door autoclaveren zoals eerder beschreven. Als u klaar bent, telt u het aantal SF-MSC's om 2,5 keer 10 toe te wijzen aan de zevende SF-MSC's en microcarriers aan de bioreactor doordrenkt met 250 milliliter van het GMP-grade MSC-kweekmedium. Plaats de bioreactor in een incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius met een snelheid van 15 rotaties per minuut.Verander het cultuurmedium om de zes dagen. Verzamel na 14 dagen de celkweeksupernatanten en microdragers voor verdere analyse. Centrifugeer het celkweeksupernatant op 300 maal G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant terwijl het cellulaire vuil wordt weggegooid.Bij vier graden Celsius centrifugeer je het supernatant achtereenvolgens op 2.000 keer G gedurende 10 minuten en vervolgens op 10.000 keer G gedurende 30 minuten om de grotere blaasjes weg te gooien en de pellet te verzamelen. Na het resuspenderen van de pellet in 40 milliliter PBS, centrifugeert u de celsuspensie op 120.000 maal G gedurende 70 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer vervolgens de verzamelde pellet met exosomen in 500 microliter PBS.Verdun de vers geïsoleerde exosoommonsters met steriele PBS tot de concentratie van 10 tot de zevende tot 10 tot de negende deeltjes per milliliter en injecteer 500 microliter van het monster voor elke run in de nanodeeltjesvolganalyse, of NTA-systeem, met 30 microliter per minuut en 24,4 tot 24,5 graden Celsius. Stel het opname- en analysesysteem handmatig in volgens het protocol van de fabrikant. Visualiseer de deeltjes door laserlichtverstrooiing en leg hun Brownse beweging vast op digitale video.Analyseer vervolgens de opgenomen videobanden met behulp van software en volg ten minste 200 individuele deeltjes per run. Voeg voor Western blotting 300 microliter van de lysisbuffer en proteaseremmerscocktail toe aan de exosomen met mengen door op en neer te pipetteren. Laat het vervolgens 20 minuten op ijs staan.Na centrifugeren van het mengsel op 9, 391 maal G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, meet u de eiwitconcentratie in het supernatant met behulp van een eiwittestkit. Verwarm het monster na de test met 100 microliter 4X eiwitbelastingsbuffer bij 100 graden Celsius gedurende 10 minuten. Laad vervolgens 15 microliter eiwitten in een concentratie van 10 milligram per milliliter om gedurende 70 minuten te draaien door gel-elektroforese op 120 volt en elektro-blotting op 100 volt gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius.Detecteer de niet-exosoomspecifieke markers, zoals calnexin en de exosomale biomarkers zoals CD9, CD63 en CD81 door fluorescerende Western blotting. In de studie werd flowcytometrie gebruikt om de oppervlaktemarkers van SF-MSC's te identificeren. Flowcytometrie-analyse toonde aan dat de gekweekte SF-MSC's negatief waren voor CD34, CD45 en HLA-DR, en positief voor CD73, CD90 en CD105, die voldeden aan de identificatiecriteria van MSC's.Onder omgekeerde microscopie werd opgemerkt dat de SF-MSC's zich verspreiden op microdragers. De SF-MSC verspreidde zich vanaf zes dagen sneller in de 3D-cultuur in vergelijking met de 2D-cultuur. De exosomen van SF-MSC's van 2D- en 3D-cultuur werden geïdentificeerd met behulp van Western blotting en de exosomen bleken CD63, CD9 en CD81 tot expressie te brengen terwijl ze negatief waren voor calnexin.De nanocytenanalyse toonde aan dat de diameter van 2D- en 3D-exosomen ongeveer 120 nanometer was. De microscopische analyse van transmissie-elektronen onthulde de morfologie van 2D- en 3D-exosomen, die ruwweg bolvormige blaasjes vertonen. Met behulp van NTA-analyse werd de concentratie van deeltjes van 30 tot 160 nanometer geanalyseerd.Na 3D-cultuur was de deeltjesconcentratie 4,0 keer 10 tot de zes per milliliter. Na de 2D-cultuur was de concentratie van deeltjes van dezelfde grootte echter 2,5 keer 10 tot de zes per milliliter. Bovendien produceerde 3D-cultuur meer exosoomeiwit dan 2D-cultuur.De representatieve analyse toont de internalisatie van Dil-gelabelde exosomen door primaire chondrocyten. Dil-gelabelde exosomen die primaire chondrocyten binnendrongen, zijn te zien met een piek van drie uur. In vitro leveringsstudie toonde aan dat exosomen sulfo-cyanine3-gelabeld microRNA-140 aan chondrocyten konden leveren.Het plating van de cellen, het starten van de reactie in de bioreactor en het supernatant zijn de belangrijkste stappen in dit protocol. 3D-cultuur wordt vaak gebruikt voor grootschalige kweek van aanhangende cellen. Andere methoden zoals spin flex kunnen ook worden gebruikt voor grootschalige productie van exosomen.Onze methode verbetert de opbrengst van exosomen, waardoor msc exosoom-gebaseerde preklinische toepassing mogelijk wordt.

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Grootschalige Schermen van Metagenomic Bibliotheken

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale zebravis-Based In vivo Kleine Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Een 3D-systeem voor het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in gewrichtsvloeistof

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium Assay voor grootschalige SNP genotypering Toepassingen

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identificatie van nieuwe regulatoren van plantaardige transpiratie door grootschalige thermische beeldvorming screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Een semiautomatiseerde ChIP-Seq-procedure voor grootschalige epigenetische studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...