Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
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Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81972116, n° 81972085, n° 81772394); Programme clé de la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (n ° 2018B0303110003); Projet de coopération internationale du Guangdong (No.2021A0505030011); Projets scientifiques et technologiques de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Fondation chinoise des sciences postdoctorales (No.2020M682907); Fondation pour la recherche fondamentale et appliquée du Guangdong (n° 2021A1515010985); Projet Sanming de médecine à Shenzhen (SZSM201612079); Fonds spéciaux pour la construction d’hôpitaux de haut niveau dans la province du Guangdong.

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique humaine du deuxième hôpital populaire de Shenzhen. Un diagramme schématique des exosomes isolés à partir du protocole in vitro hSF-MSCs est présenté à la figure 1.
1. Culture et identification des SF-MSC humaines
<ol><li>Prélever 20 mL de SF à l’aide d’une seringue et d’une aiguille provenant de patients atteints d’arthrose clinique.<ol><li>Désinfecter l’ar...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. 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M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy.">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li><li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy.">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+(3D)+spheroids.">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury.">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury.">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 206 (2020).</li></ol>

Les cellules souches mésenchymateuses ont été largement utilisées en médecine régénérative en raison de leur auto-renouvellement, différenciées en cellules tissulaires ayant des fonctions spécialisées et des effets paracrines16,17. Notamment, les effets paracrines exercés par les exosomes ont attiré beaucoup d’attention18. Les exosomes transportent la bio-information des CSM et remplissent leur fonction biologique et surmon...

L’arthrose, résultant du cartilage articulaire et de la dégradation osseuse sous-jacente, demeure un défi de taille menant à l’invalidité 1,2. Sans apport sanguin et nerveux, la capacité d’auto-guérison du cartilage est minime une fois blessé 3,4. Au cours des dernières décennies, les thérapies basées sur l’implantation de chondrocytes autologues (ICA) ont fait des progrès dans le traitement de l’arthrose5. Pour l’isolement et l’expansion des chondrocytes, il est nécessaire de prélever le petit cartilage de la zone non portante de l’articulation arthrose, ce qui provoque des lésions au cartilage. En outre, la procédure nécessitera une deuxième opération pour implanter les chondrocytes dilatés6. Ainsi, les thérapies en une étape pour le traitement de l’arthrose sans lésions cartilagineuses font l’objet d’une exploration approfondie.
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été suggérées comme alternatives prometteuses pour le traitement de l’arthrose 7,8. Provenant de plusieurs tissus, les CSM peuvent se différencier en chondrocytes avec une stimulation spécifique. Il est important de noter que les CSM peuvent moduler les réponses immunitaires via un anti-inflammation9. Par conséquent, les CSM présentent des avantages significatifs dans le traitement de l’arthrose en réparant les défauts du cartilage et en modulant la réponse immunitaire, en particulier dans le milieu de l’inflammation. Pour le traitement de l’arthrose, les CSM du liquide synovial (SF-MSC) ont récemment attiré beaucoup d’attention en raison de leur capacité de différenciation des chondrocytes plus forte que les autres sources de CSM10,11. Notamment, à la clinique orthopédique, l’extraction de SF inflammatoire de la cavité articulaire est une thérapie de routine pour soulager le symptôme de douleur des patients atteints d’arthrose. Le SF inflammatoire extrait est généralement éliminé comme un déchet médical. Les patients et les médecins sont prêts à considérer les CSM autologues isolées du SF inflammatoire comme traitement de l’arthrose avec très peu de conflits éthiques. Cependant, le traitement SF-MSC est compromis en raison des risques tumorigènes, du stockage à long terme et des barrières d’expédition éloignées.
Les exosomes, sécrétés par de nombreux types de cellules, y compris les CSM, transportent la plupart des informations biologiques de la cellule mère. Il a été étudié en profondeur en tant que thérapie acellulaire12,13. Selon les ressources mises à jour disponibles sur le site Web du gouvernement des essais cliniques (ClinicalTrials.gov), des études cliniques plus approfondies sur les exosomes sont lancées et entreprises dans les domaines de recherche du cancer, de l’hypertension et des maladies neurodégénératives. Le traitement par exosomes SF-MSC pourrait être un essai passionnant et difficile pour faire face à l’arthrose. Les bonnes pratiques de fabrication (BPF) et la production d’exosomes à grande échelle sont essentielles pour la traduction clinique. L’isolement d’exosomes à petite échelle a été largement réalisé sur la base d’une culture cellulaire bidimensionnelle (2D). Cependant, les stratégies de production d’exosomes à grande échelle doivent être optimisées. Une méthode de fabrication d’exosomes à grande échelle a été développée dans cette étude, basée sur une culture massive de SF-MSC dans des conditions sans xéno. Après ultracentrifugation à partir de surnageants de culture cellulaire, l’innocuité et la fonction des exosomes ont été validées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

Les exosomes sécrétés par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été suggérés comme des candidats prometteurs pour les lésions cartilagineuses et le traitement de l’arthrose. Les exosomes pour application clinique nécessitent une production à grande échelle. À cette fin, des CSM du liquide synovial humain (hSF-MSC) ont été cultivées sur des billes microporteuses, puis cultivées dans un système de culture dynamique en trois dimensions (3D). En utilisant la culture dynamique 3D, ce protocole a réussi à obtenir des exosomes à grande échelle à partir de surnageants de culture SF-MSC. Les exosomes ont été récoltés par ultracentrifugation et vérifiés par un microscope électronique à transmission, un test de transmission de nanoparticules et un transfert Western. En outre, la sécurité microbiologique des exosomes a été détectée. Les résultats de la détection des exosomes suggèrent que cette approche peut produire un grand nombre d’exosomes de qualité Bonnes pratiques de fabrication (BPF). Ces exosomes pourraient être utilisés dans la recherche sur la biologie des exosomes et le traitement clinique de l’arthrose.

La cytométrie en flux a été utilisée pour identifier les marqueurs de surface des SF-MSC, selon les critères minimaux pour définir les CSM humaines recommandés par l’International Society for Cellular Therapy14,15. L’analyse par cytométrie en flux a révélé que les CSF-CSF cultivées dans cette étude répondaient aux critères d’identification des CSM. Ils étaient négatifs pour CD34, CD45 et HLA-DR (inférieurs à 3 %) et positifs pour CD73, CD...

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Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Ici, nous présentons un protocole pour produire un grand nombre d’exosomes de qualité GMP à partir de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial à l’aide d’un bioréacteur 3D.

Préparation à grande échelle d’exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial par culture de bioréacteur 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Nous présentons un protocole pour produire un grand nombre d’exosomes de qualité GMP à partir de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial à l’aide de notre bioréacteur 3D. Ces exosomes pourraient être utilisés dans la recherche sur la biologie des exosomes et le traitement clinique de l’arthrite. La démonstration de la procédure sera le Dr Yujie Liang.Commencez à recueillir les cellules mésenchymateuses humaines, ou CSM, en centrifugeant le liquide synovial à 1 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule avec 10 millilitres de PBS. Centrifuger les cellules en suspension à 1 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le PBS avant de remettre en suspension la pastille avec 10 millilitres de milieu de culture CSM humain à une densité cellulaire de cinq fois 10 à la quatrième cellule par millilitre, puis plaquer la suspension dans une boîte de 100 millimètres.Incuber le plat à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone. Après deux semaines, prélever le surnageant de culture cellulaire pour identifier les cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial, ou SF-MSC, en utilisant la cytométrie en flux. Pour ce faire, digérer le passage de troisième génération de SF-MSC par centrifugation à 1 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, jetez le surnageant avant de recueillir la pastille de cellule. Ensuite, ajoutez 400 microlitres du tampon de blocage à la pastille de cellule à la concentration de cinq fois 10 à la quatrième et laissez la pastille reposer pendant 15 minutes à température ambiante. Après 15 minutes, centrifuger la suspension cellulaire comme décrit précédemment, puis remettre en suspension la pastille séparée dans 100 microlitres de 1X PBS.Ajouter un microlitre de l’anticorps fluorescent monoclonal à un rapport de dilution de 1:100 par tube, comme décrit dans le manuscrit, et placer le tube pour l’incubation à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, laver les cellules deux fois avec 1X PBS et remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de 1X PBS. Ensuite, détectez les fluorophores dans jusqu’à 10 000 cellules sur un cytomètre en flux en utilisant les canaux rouge et FITC.Pour préparer les microporteurs, gonfler et hydrater à sec 0,75 gramme des microporteurs dans 1X DPBS à la concentration de 50 milligrammes par gramme pendant au moins trois heures à température ambiante. Ensuite, décanter le surnageant pour laver les microporteurs dans du DPBS frais pendant cinq minutes. Après avoir remplacé le milieu par du 1X DPBS frais à 50 milligrammes de microporteurs par gramme, stérilisez les microporteurs par autoclavage à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes à 15 livres par pouce carré.Ensuite, laissez les microporteurs stérilisés se déposer avant de décanter le surnageant. Rincer les microtransporteurs dans le milieu de culture à la concentration de 50 milligrammes de microtransporteurs par gramme à température ambiante. Lorsque les microporteurs sont installés, jetez le surnageant.Pour préparer le bioréacteur de perfusion, stérilisez le bioréacteur par autoclavage comme décrit précédemment. Lorsque cela est fait, comptez le nombre de SF-MSC à allouer 2,5 fois 10 aux septièmes SF-MSC et microtransporteurs au bioréacteur perfusé avec 250 millilitres du milieu de culture MSC de qualité GMP. Placez le bioréacteur dans un incubateur contenant 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius à une vitesse de 15 rotations par minute.Changez le milieu de culture tous les six jours. Après 14 jours, prélever les surnageants de culture cellulaire et les microporteurs pour une analyse plus approfondie. Centrifuger le surnageant de culture cellulaire à 300 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et recueillir le surnageant tout en éliminant les débris cellulaires.À quatre degrés Celsius, centrifuger séquentiellement le surnageant à 2 000 fois G pendant 10 minutes, puis à 10 000 fois G pendant 30 minutes pour éliminer les vésicules plus grosses et recueillir la pastille. Après avoir remis en suspension la pastille dans 40 millilitres de PBS, centrifuger la suspension cellulaire à 120 000 fois G pendant 70 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, remettez en suspension la pastille collectée contenant des exosomes dans 500 microlitres de PBS.Diluer les échantillons d’exosomes fraîchement isolés avec du PBS stérile à la concentration de 10 à la septième à 10 à la neuvième particules par millilitre et injecter 500 microlitres de l’échantillon pour chaque passage dans l’analyse de suivi des nanoparticules, ou système NTA, à 30 microlitres par minute et 24,4 à 24,5 degrés Celsius. Réglez manuellement le système de capture et d’analyse selon le protocole du fabricant. Visualisez les particules par diffusion laser de la lumière et capturez leur mouvement brownien sur vidéo numérique.Ensuite, analysez les bandes vidéo enregistrées à l’aide d’un logiciel, en suivant au moins 200 particules individuelles par exécution. Pour le Western blot, ajoutez 300 microlitres du tampon de lyse et du cocktail d’inhibiteurs de protéase aux exosomes en mélangeant en pipetant de haut en bas. Ensuite, laissez le laisser reposer sur la glace pendant 20 minutes.Après centrifugation du mélange à 9 391 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, mesurer la concentration de protéines dans le surnageant à l’aide d’un kit de dosage des protéines. Après le test, chauffer l’échantillon avec 100 microlitres de tampon de charge protéique 4X à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, chargez 15 microlitres de protéines à une concentration de 10 milligrammes par millilitre pour faire fonctionner par électrophorèse sur gel à 120 volts pendant 70 minutes et électrobuvardage à 100 volts pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius.Détecter les marqueurs spécifiques non exosomes, tels que la calnexine et les biomarqueurs exosomiques tels que CD9, CD63 et CD81 par transfert Western fluorescent. Dans l’étude, la cytométrie en flux a été utilisée pour identifier les marqueurs de surface des SF-MSC. L’analyse par cytométrie en flux a révélé que les CSF-MSC en culture étaient négatives pour CD34, CD45 et HLA-DR, et positives pour CD73, CD90 et CD105, répondant aux critères d’identification des CSM.En microscopie inversée, on a remarqué que les SF-MSC prolifèrent sur les microporteurs. Le SF-MSC a proliféré dans la culture 3D plus rapidement à partir de six jours par rapport à la culture 2D. Les exosomes des SF-MSC de culture 2D et 3D ont été identifiés par transfert Western et les exosomes se sont avérés exprimer CD63, CD9 et CD81 tout en étant négatifs pour la calnexine.L’analyse des nanocytes a démontré que le diamètre des exosomes 2D et 3D était d’environ 120 nanomètres. L’analyse au microscope électronique à transmission a révélé la morphologie des exosomes 2D et 3D, montrant des vésicules grossièrement sphéroïdales. À l’aide de l’analyse NTA, la concentration de particules de 30 à 160 nanomètres a été analysée.Après culture 3D, la concentration de particules était de 4,0 fois 10 à six par millilitre. Cependant, après la culture 2D, la concentration de particules de même taille était de 2,5 fois 10 à six par millilitre. De plus, la culture 3D a produit plus de protéines exosomiques que la culture 2D.L’analyse représentative montre l’internalisation des exosomes marqués par Dil par les chondrocytes primaires. Les exosomes marqués par Dil entrés dans les chondrocytes primaires peuvent être vus avec un pic à trois heures. Une étude in vitro a démontré que les exosomes pouvaient délivrer du microARN-140 marqué par la sulfo-cyanine3 aux chondrocytes.Le placage des cellules, le démarrage de la réaction dans le bioréacteur et le surnageant sont les étapes les plus importantes de ce protocole. La culture 3D est couramment utilisée pour la culture à grande échelle de cellules adhérentes. D’autres méthodes telles que le spin flex peuvent également être utilisées pour la production à grande échelle d’exosomes.Notre méthode améliore le rendement des exosomes, permettant ainsi une application préclinique basée sur les exosomes MSC.

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