Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
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National Natural Science Foundation of China (Nr. 81972116, Nr. 81972085, Nr. 81772394); Schlüsselprogramm der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Guangdong (No.2018B0303110003); Guangdong International Cooperation Project (No.2021A0505030011); Shenzhen Science and Technology Projects (Nr. GJHZ20200731095606019, Nr. JCYJ20170817172023838, Nr. JCYJ20170306092215436, Nr. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (No.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (No.2021A1515010985); Sanming Projekt der Medizin in Shenzhen (SZSM201612079); Sonderfonds für den Bau von Krankenhäusern auf hohem Niveau in der Provinz Guangdong.

Diese Studie wurde vom Human Ethics Committee des Shenzhen Second People's Hospital genehmigt. Ein schematisches Diagramm der aus hSF-MSCs isolierten Exosomen im vitro-Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Kultur und Identifikation menschlicher SF-MSCs
<ol><li>Ernten Sie 20 ml SF mit einer Spritze und Nadel von klinischen OA-Patienten.<ol><li>Desinfizieren Sie das Kniegelenk des OA-Patienten. Punktion von der Quadrizeps femoris-S...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. 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M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. 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The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. 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Die mesenchymalen Stammzellen sind in der regenerativen Medizin aufgrund ihrer Selbsterneuerung, differenziert in Gewebezellen mit spezialisierten Funktionen und parakrinen Effekten weit verbreitet16,17. Insbesondere die parakrinen Wirkungen von Exosomen haben viel Aufmerksamkeit erregt18. Exosomen tragen die Bioinformationen von MSCs und erfüllen ihre biologische Funktion und überwinden MSC-Mängel wie lästige Lagerung und Transport. S...

Osteoarthritis (OA), die aus Gelenkknorpel und darunterliegendem Knochenabbau resultiert, bleibt eine schwere Herausforderung, die zu Behinderungen führt 1,2. Ohne Blut- und Nervenversorgung ist die Selbstheilungsfähigkeit des Knorpels minimal, sobald er verletzt ist 3,4. In den letzten Jahrzehnten haben Therapien, die auf autologer Chondrozytenimplantation (ACI) basieren, einige Fortschritte in der OA-Behandlung gemacht5. Für die Isolierung und Expansion von Chondrozyten ist die Ernte kleiner Knorpel aus dem nicht belastenden Bereich des OA-Gelenks erforderlich, was zu Verletzungen des Knorpels führt. Außerdem erfordert das Verfahren eine zweite Operation, um die expandierten Chondrozyten zu implantieren6. Daher werden einstufige Therapien für die OA-Behandlung ohne Knorpelverletzungen intensiv erforscht.
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als vielversprechende Alternativen für die OA-Behandlung vorgeschlagen 7,8. MSCs stammen aus mehreren Geweben und können sich mit spezifischer Stimulation in Chondrozyten differenzieren. Wichtig ist, dass MSCs Immunantworten über entzündungshemmende Mittel modulieren können9. Daher haben MSCs signifikante Vorteile bei der OA-Behandlung, indem sie Knorpeldefekte reparieren und die Immunantwort modulieren, insbesondere im Entzündungsmilieu. Für die OA-Behandlung haben MSCs aus Synovialflüssigkeit (SF-MSCs) in letzter Zeit aufgrund ihrer stärkeren Chondrozytendifferenzierungsfähigkeit als andere MSC-Quellen viel Aufmerksamkeit erregt10,11. Insbesondere in der orthopädischen Klinik ist die Extraktion von entzündlicher SF aus der Gelenkhöhle eine Routinetherapie zur Linderung der Schmerzsymptome von OA-Patienten. Extrahierte entzündliche SF wird normalerweise als medizinischer Abfall entsorgt. Sowohl Patienten als auch Ärzte sind bereit, autologe MSCs, die aus der entzündlichen SF isoliert wurden, als OA-Behandlung mit sehr wenigen ethischen Konflikten in Betracht zu ziehen. Die SF-MSC-Therapie ist jedoch aufgrund von tumorigenen Risiken, Langzeitlagerung und entfernten Transportbarrieren beeinträchtigt.
Exosomen, die von vielen Zelltypen, einschließlich MSCs, sezerniert werden, tragen die meisten Bioinformationen der Elternzelle. Es wurde eingehend als zellfreie Therapieuntersucht 12,13. Laut den aktualisierten Ressourcen, die auf der Website der Regierung für klinische Studien (ClinicalTrials.gov) verfügbar sind, werden umfangreichere klinische Exosomenstudien in den Forschungsbereichen Krebs, Bluthochdruck und neurodegenerative Erkrankungen initiiert und durchgeführt. Die SF-MSC-Exosomenbehandlung könnte eine aufregende und herausfordernde Studie sein, um mit OA fertig zu werden. Good Manufacturing Practice (GMP)-Qualität und großflächige Exosomenproduktion sind für die klinische Translation unerlässlich. Die Exosomenisolierung in kleinem Maßstab wurde auf der Grundlage einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur durchgeführt. Großflächige Exosomenproduktionsstrategien müssen jedoch optimiert werden. In dieser Studie wurde eine groß angelegte Exosomenherstellungsmethode entwickelt, die auf einer massiven SF-MSC-Kultur unter xenofreien Bedingungen basiert. Nach Ultrazentrifugation aus Zellkulturüberständen wurden die Sicherheit und Funktion von Exosomen validiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

Exosomen, die von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) abgesondert werden, wurden als vielversprechende Kandidaten für Knorpelverletzungen und die Behandlung von Arthrose vorgeschlagen. Exosomen für die klinische Anwendung erfordern eine großtechnische Produktion. Zu diesem Zweck wurden humane Synovialflüssigkeits-MSCs (hSF-MSCs) auf Mikroträgerperlen gezüchtet und dann in einem dynamischen dreidimensionalen (3D) Kultursystem kultiviert. Durch die Verwendung einer dynamischen 3D-Kultur gelang es diesem Protokoll, großräumige Exosomen aus SF-MSC-Kulturüberständen zu erhalten. Exosomen wurden durch Ultrazentrifugation geerntet und durch ein Transmissionselektronenmikroskop, Nanopartikel-Transmissionsassay und Western Blotting verifiziert. Auch die mikrobiologische Sicherheit von Exosomen wurde nachgewiesen. Die Ergebnisse des Exosomennachweises deuten darauf hin, dass dieser Ansatz eine große Anzahl von GMP-Exosomen (Good Manufacturing Practices) hervorbringen kann. Diese Exosomen könnten in der Exosomenbiologie und der klinischen Arthrosebehandlung verwendet werden.

Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Oberflächenmarker von SF-MSCs gemäß den von der Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie14,15 empfohlenen Mindestkriterien zur Definition humaner MSCs zu identifizieren. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab, dass SF-MSCs, die in dieser Studie kultiviert wurden, die Identifizierungskriterien von MSCs erfüllten. Sie waren negativ für CD34, CD45 und HLA-DR (unter 3%) und positiv für CD73, CD90 und CD105 ...

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Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-konformen Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit unter Verwendung eines 3D-Bioreaktors.

Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Wir präsentieren ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit mit unserem 3D-Bioreaktor. Diese Exosomen könnten in der Exosomenbiologie und der klinischen Arthritisbehandlung verwendet werden. Das Verfahren wird von Dr. Yujie Liang demonstriert.Beginnen Sie mit der Sammlung der menschlichen mesenchymalen Zellen oder MSCs, indem Sie die Synovialflüssigkeit bei 1.500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und das Zellpellet mit 10 Milliliter PBS resuspendieren. Zentrifugieren Sie die resuspendierten Zellen bei 1 500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie PBS, bevor Sie das Pellet mit 10 Milliliter humanem MSC-Kulturmedium bei einer Zelldichte von fünf mal 10 bis zur vierten Zelle pro Milliliter resuspendieren und dann die Suspension in einer 100-Millimeter-Schale beschichten.Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre, die 5% Kohlendioxid enthält. Nach zwei Wochen sammeln Sie den Zellkulturüberstand, um mesenchymale Stammzellen der Synovialflüssigkeit oder SF-MSCs mittels Durchflusszytometrie zu identifizieren. Um dies zu tun, verdauen Sie die dritte Generation der Passage drei von SF-MSCs durch Zentrifugation bei 1.000 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Dann verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie das Zellpellet sammeln. Als nächstes fügen Sie dem Zellpellet 400 Mikroliter des blockierenden Puffers in der Konzentration von fünfmal 10 bis zum vierten hinzu und lassen Sie das Pellet 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Nach 15 Minuten zentrifugieren Sie die Zellsuspension wie zuvor beschrieben und resuspendieren Sie dann das abgetrennte Pellet in 100 Mikrolitern 1X PBS.Fügen Sie einen Mikroliter des monoklonalen fluoreszierenden Antikörpers in einem Verdünnungsverhältnis von 1:100 pro Röhrchen hinzu, wie im Manuskript beschrieben, und stellen Sie das Röhrchen zur Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten ein. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit 1X PBS und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter 1X PBS. Anschließend detektieren Sie die Fluorophore in bis zu 10.000 Zellen auf einem Durchflusszytometer mit roten und FITC-Kanälen.Zur Herstellung der Mikroträger quellen und hydratisieren Sie 0,75 Gramm der Mikroträger in 1X DPBS in der Konzentration von 50 Milligramm pro Gramm für mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie dann den Überstand, um die Mikroträger fünf Minuten lang in frischem DPBS zu waschen. Nach dem Ersetzen des Mediums durch frisches 1X DPBS bei 50 Milligramm der Mikroträger pro Gramm sterilisieren Sie die Mikroträger durch Autoklavieren bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten bei 15 Pfund pro Quadratzoll.Lassen Sie dann die sterilisierten Mikroträger absetzen, bevor Sie den Überstand dekantieren. Die Mikroträger im Kulturmedium werden bei einer Konzentration von 50 Milligramm der Mikroträger pro Gramm bei Raumtemperatur gespült. Wenn die Mikroträger abgesetzt sind, verwerfen Sie den Überstand.Um den Perfusionsbioreaktor vorzubereiten, sterilisieren Sie den Bioreaktor durch Autoklavieren, wie zuvor beschrieben. Wenn Sie fertig sind, zählen Sie die Anzahl der SF-MSCs, um 2,5 mal 10 den siebten SF-MSCs und Mikroträger dem Bioreaktor zuzuweisen, der mit 250 Milliliter des GMP-konformen MSC-Kulturmediums perfundiert ist. Stellen Sie den Bioreaktor in einen Inkubator mit 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius bei einer Geschwindigkeit von 15 Umdrehungen pro Minute.Wechseln Sie das Kulturmedium alle sechs Tage. Nach 14 Tagen sammeln Sie die Zellkulturüberstände und Mikroträger zur weiteren Analyse. Zentrifugieren Sie den Zellkulturüberstand bei 300 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand, während Sie die Zelltrümmer entsorgen.Bei vier Grad Celsius zentrifugieren Sie den Überstand nacheinander bei 2.000 mal G für 10 Minuten und dann bei 10.000 mal G für 30 Minuten, um die größeren Vesikel zu verwerfen und das Pellet zu sammeln. Nach dem Resuspendieren des Pellets in 40 Milliliter PBS zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 120.000 mal G für 70 Minuten bei vier Grad Celsius. Dann resuspendieren Sie das gesammelte Pellet mit Exosomen in 500 Mikroliter PBS.Die frisch isolierten Exosomenproben werden mit sterilem PBS auf die Konzentration von 10 bis siebten bis 10 bis neunten Partikeln pro Milliliter verdünnt und 500 Mikroliter der Probe für jeden Durchlauf in die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA-System) bei 30 Mikrolitern pro Minute und 24,4 bis 24,5 Grad Celsius injiziert. Stellen Sie das Erfassungs- und Analysesystem manuell gemäß dem Protokoll des Herstellers ein. Visualisieren Sie die Partikel durch Laserlichtstreuung und erfassen Sie ihre Brownsche Bewegung auf digitalem Video.Als nächstes analysieren Sie die aufgezeichneten Videobänder mit einer Software und verfolgen mindestens 200 einzelne Partikel pro Lauf. Für das Western Blotting fügen Sie 300 Mikroliter des Lysepuffer- und Proteaseinhibitor-Cocktails zu den Exosomen hinzu, indem Sie auf und ab pipettieren. Dann lassen Sie sie 20 Minuten auf Eis stehen.Nach Zentrifugation der Mischung bei 9,391 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius wird die Proteinkonzentration im Überstand mit einem Proteinassay-Kit gemessen. Nach dem Assay erhitzen Sie die Probe mit 100 Mikrolitern 4X-Proteinladepuffer bei 100 Grad Celsius für 10 Minuten. Als nächstes laden Sie 15 Mikroliter Proteine in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter, um durch Gelelektrophorese bei 120 Volt für 70 Minuten und Elektro-Blotting bei 100 Volt für 60 Minuten bei vier Grad Celsius zu laufen.Erkennen Sie die nicht-exosomenspezifischen Marker wie Calnexin und die exosomalen Biomarker wie CD9, CD63 und CD81 durch fluoreszierendes Western Blotting. In der Studie wurde die Durchflusszytometrie verwendet, um die Oberflächenmarker von SF-MSCs zu identifizieren. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab, dass die kultivierten SF-MSCs negativ für CD34, CD45 und HLA-DR und positiv für CD73, CD90 und CD105 waren und die Identifizierungskriterien von MSCs erfüllten.Unter inverser Mikroskopie wurde festgestellt, dass sich die SF-MSCs auf Mikroträgern vermehren. Die SF-MSC vermehrte sich in der 3D-Kultur ab sechs Tagen schneller als die 2D-Kultur. Die Exosomen aus SF-MSCs der 2D- und 3D-Kultur wurden mittels Western Blotting identifiziert und die Exosomen exprimierten CD63, CD9 und CD81, während sie für Calnexin negativ waren.Die Nanozytenanalyse zeigte, dass der Durchmesser von 2D- und 3D-Exosomen etwa 120 Nanometer betrug. Die transmissionselektronenmikroskopische Analyse zeigte die Morphologie von 2D- und 3D-Exosomen und zeigte annähernd kugelförmige Vesikel. Mittels NTA-Analyse wurde die Konzentration von 30 bis 160 Nanometer großen Partikeln analysiert.Nach 3D-Kultur betrug die Partikelkonzentration 4,0 mal 10 zu sechs pro Milliliter. Nach der 2D-Kultur betrug die Konzentration der gleich großen Partikel jedoch 2,5 mal 10 zu den sechs pro Milliliter. Darüber hinaus produzierte die 3D-Kultur mehr Exosomenprotein als die 2D-Kultur.Die repräsentative Analyse zeigt die Internalisierung von Dil-markierten Exosomen durch primäre Chondrozyten. Dil-markierte Exosomen, die in primäre Chondrozyten eingedrungen sind, können mit einem Peak nach drei Stunden gesehen werden. In-vitro-Verabreichungsstudie zeigte, dass Exosomen Sulfo-Cyanin3-markierte microRNA-140 an Chondrozyten abgeben können.Die Beschichtung der Zellen, das Starten der Reaktion im Bioreaktor und die des Überstands sind die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll. Die 3D-Kultur wird häufig für die großflächige Kultur adhärenter Zellen verwendet. Andere Methoden wie Spinflex können auch für die großtechnische Produktion von Exosomen verwendet werden.Unsere Methode verbessert die Ausbeute an Exosomen und ermöglicht so eine MSC-Exosom-basierte präklinische Anwendung.

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