Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81972116, מס' 81972085, מס' 81772394); תוכנית המפתח של הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (מס '2018B0303110003); פרויקט שיתוף הפעולה הבינלאומי של גואנגדונג (מס '2021A0505030011); שנזן פרויקטים של מדע וטכנולוגיה (לא. GJHZ20200731095606019, לא. JCYJ20170817172023838, לא. JCYJ20170306092215436, לא. JCYJ20170413161649437); קרן סין למדע בתר-דוקטוריאלי (No.2020M682907); קרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (No.2021A1515010985); פרויקט סאנמינג לרפואה בשנג'ן (SZSM201612079); כספים מיוחדים לבניית בתי חולים ברמה גבוהה במחוז גואנגדונג.

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה האנושית של בית החולים העממי השני של שנזן. דיאגרמה סכמטית של אקסוזומים שבודדו מפרוטוקול hSF-MSCs במבחנה מוצגת באיור 1.
1. תרבות וזיהוי SF-MSCs אנושיים
<ol><li>קציר 20 מ"ל של SF באמצעות מזרק ומחט מחולי OA קליניים.<ol><li>יש לחטא את מפ...

<ol>
	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlike+bone,+cartilage+regeneration+remains+elusive.">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration.">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li><li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI.">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li><li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation:+past,+present,+and+future.">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li><li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis.">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li><li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee:+a+proof-of-concept+clinical+trial.">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li><li>Pers, Y. M., Ruiz, M., No&#235;l, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis:+state+of+the+art+and+perspectives.">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li><li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells.">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 329 (2018).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model.">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy.">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li><li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy.">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities.">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li><li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+(3D)+spheroids.">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury.">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury.">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 206 (2020).</li></ol>

תאי הגזע המזנכימליים נמצאים בשימוש נרחב ברפואה רגנרטיבית בשל ההתחדשות העצמית שלהם, התמיינות לתאי רקמה עם פונקציות מיוחדות, ואפקטים פרקריניים16,17. יש לציין כי ההשפעות הפראקריניות המופעלות על ידי אקסוזומים משכו תשומת לב רבה18. אקסוזומים נושאים א?...

דלקת מפרקים ניוונית (OA), הנובעת מסחוס המפרקים ומפירוק העצם הבסיסי, נותרה אתגר חמור המוביל לנכות 1,2. ללא אספקת דם ועצבים, יכולת הריפוי העצמי של הסחוס היא מינימלית לאחר שנפצע 3,4. בעשורים האחרונים, טיפולים המבוססים על השתלת כונדרוציטים אוטולוגית (ACI) התקדמו מעט בטיפול OA5. עבור בידוד והרחבה של כונדרוציטים, יש צורך בקצירת סחוס קטן מהאזור שאינו נושא משקל של מפרק ה-OA, מה שגורם לפציעות בסחוס. כמו כן, ההליך ידרוש פעולה שנייה להשתלת הכונדרוציטים המורחבים6. לפיכך, טיפולים חד-שלביים לטיפול ב-OA ללא פגיעות סחוס נמצאים תחת חקירה מקיפה.
תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הוצעו כחלופות מבטיחות לטיפול ב-OA 7,8. MSCs, שמקורם ברקמות מרובות, יכולים להתמיין לכונדרוציטים עם גירוי ספציפי. חשוב לציין כי MSCs יכולים לווסת את התגובה החיסונית באמצעות נוגדי דלקת9. לכן, ל-MSCs יש יתרונות משמעותיים בטיפול ב-OA על ידי תיקון פגמים בסחוס וויסות התגובה החיסונית, במיוחד בסביבה הדלקתית. עבור טיפול OA, MSCs מנוזל סינוביאלי (SF-MSCs) משכו לאחרונה תשומת לב רבה בשל יכולת ההתמיינות החזקה יותר שלהם בכונדרוציטים בהשוואה למקורות MSCאחרים 10,11. יש לציין כי במרפאה האורתופדית, מיצוי SF דלקתי מחלל המפרק הוא טיפול שגרתי להקלה על תסמין הכאב של חולי OA. SF דלקתי מופק בדרך כלל מושלך כפסולת רפואית. הן המטופלים והן הרופאים מוכנים לשקול MSCs אוטולוגיים שבודדו מה- SF הדלקתי כטיפול OA עם מעט מאוד קונפליקטים אתיים. עם זאת, טיפול SF-MSC נפגע עקב סיכונים סרטניים, אחסון ארוך ומחסומי משלוח מרוחקים.
אקסוזומים, המופרשים על ידי סוגי תאים רבים, כולל MSCs, נושאים את רוב המידע הביולוגי של תא האב. הוא נחקר לעומק כטיפול ללא תאים12,13. על פי המשאבים המעודכנים הזמינים באתר ממשלת הניסויים הקליניים (ClinicalTrials.gov), מחקרים קליניים מקיפים יותר של אקסוזומים יוזמים ומתבצעים בתחומי המחקר של סרטן, יתר לחץ דם ומחלות נוירו-ניווניות. טיפול באקסוזום SF-MSC יכול להיות ניסוי מרגש ומאתגר להתמודדות עם OA. תנאי ייצור נאותים (GMP) וייצור אקסוזומים בקנה מידה גדול חיוניים לתרגום קליני. בידוד אקסוזומים בקנה מידה קטן בוצע באופן נרחב על בסיס תרבית תאים דו-ממדית (2D). עם זאת, אסטרטגיות ייצור אקסוזומים בקנה מידה גדול זקוקות לאופטימיזציה. במחקר זה פותחה שיטת ייצור אקסוזומים בקנה מידה גדול, המבוססת על תרבית SF-MSC מסיבית בתנאים נטולי קסנו. לאחר אולטרה-צנטריפוגה מתרביות-על של תרביות תאים, הבטיחות והתפקוד של האקסוזומים אומתו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

אקסוזומים המופרשים על ידי תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הוצעו כמועמדים מבטיחים לפגיעות סחוס ולטיפול באוסטאוארתריטיס. אקסוזומים ליישום קליני דורשים ייצור בקנה מידה גדול. למטרה זו, MSCs של נוזל סינוביאלי אנושי (hSF-MSCs) גודלו על חרוזי מיקרו-קריין, ולאחר מכן גודלו בתרבית במערכת תרבותית דינמית תלת-ממדית (3D). באמצעות שימוש בתרבית דינמית תלת-ממדית, פרוטוקול זה השיג בהצלחה אקסוזומים בקנה מידה גדול מסופרנאטנטים של תרבית SF-MSC. אקסוזומים נקטפו על ידי אולטרה-צנטריפוגציה ואומתו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים משודר, בדיקת העברת ננו-חלקיקים וכתם מערבי. כמו כן, זוהתה הבטיחות המיקרוביולוגית של אקסוזומים. תוצאות של זיהוי אקסוזומים מצביעות על כך שגישה זו יכולה לייצר מספר רב של אקסוזומים ברמת GMP (תנאי ייצור נאותים). אקסוזומים אלה יכולים לשמש במחקר בביולוגיה של אקסוזומים ובטיפול קליני באוסטאוארתריטיס.

ציטומטריה של זרימה שימשה לזיהוי סמני פני השטח של SF-MSCs, על פי הקריטריונים המינימליים להגדרת MSCs אנושיים שהומלצו על ידי האגודה הבינלאומית לטיפול תאי14,15. ניתוח ציטומטריה של זרימה גילה כי SF-MSCs שגודלו במחקר זה עמדו בקריטריוני הזיהוי של MSCs. הם היו שליליים עבור CD34, CD...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture at JoVE.com

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור מספר רב של אקסוזומים ברמת GMP מתאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי באמצעות ביוריאקטור תלת-ממדי.

הכנה בקנה מידה גדול של אקסוזומים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי על ידי תרבית ביוריאקטור תלת-ממדית

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

אנו מציגים פרוטוקול לייצור מספר רב של אקסוזומים ברמת GMP מתאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי באמצעות הביוריאקטור התלת-ממדי שלנו. אקסוזומים אלה יכולים לשמש במחקר ביולוגיה של אקסוזומים ובטיפול קליני בדלקת פרקים. המדגים את ההליך יהיה ד"ר יוג'יה ליאנג.התחל לאסוף את התאים המזנכימליים האנושיים, או MSCs, על ידי צנטריפוגה של הנוזל הסינוביאלי ב 1, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולתלות מחדש את כדור התא עם 10 מיליליטר של PBS. צנטריפוגה של התאים המחודשים ב 1, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך PBS לפני החייאת הכדור עם 10 מיליליטר של תרבית MSC אנושית בינונית בצפיפות תאים של חמש פעמים 10 לתאים הרביעי למיליליטר ולאחר מכן צלחת את התרחיף בצלחת 100 מ"מ.דגירה של המנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% פחמן דו חמצני. לאחר שבועיים, אספו את תרבית התאים כדי לזהות תאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי, או SF-MSCs, באמצעות ציטומטריית זרימה. כדי לעשות זאת, לעכל את הדור השלישי לעבור שלושה של SF-MSCs על ידי צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, השליכו את הסופר-נטנט לפני איסוף גלולת התא. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של המאגר החוסם את הכדור התא בריכוז של חמש פעמים 10 עד הרביעי ולאפשר את הכדור לעמוד במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות, צנטריפוגה של השעיית התא כפי שתואר קודם לכן, ולאחר מכן להשעות את הכדור מופרד ב 100 microliters של 1X PBS.מוסיפים מיקרוליטר אחד של הנוגדן הפלואורסצנטי החד-שבטי ביחס דילול של 1:100 לכל צינור כמתואר בכתב היד, ומניחים את הצינור לדגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעמיים עם 1X PBS והחזירו את התאים ב-100 מיקרוליטרים של 1X PBS. לאחר מכן, לזהות את fluorophores עד 10, 000 תאים על ציטומטר זרימה באמצעות ערוצים אדומים ו- FITC.כדי להכין את המיקרו-קרוואנים, יש להתנפח ולייבש 0.75 גרם של המיקרו-קרונות ב-1X DPBS בריכוז של 50 מיליגרם לגרם למשך שלוש שעות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לטשטש את ה-supernatant כדי לשטוף את המיקרו-קרונות ב-DPBS טריים למשך חמש דקות. לאחר החלפת המדיום ב-DPBS 1X טרי ב-50 מיליגרם של המיקרו-קרונות לגרם, יש לעקר את המיקרו-קרקרים על ידי אוטוקלאבינג בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-15 פאונד לאינץ' מרובע.לאחר מכן, אפשרו למיקרו-קרוואנים המעוקרים להתיישב לפני שהם מנטרלים את הסופר-נטנט. שוטפים את המיקרו-קרונות במדיום התרבית בריכוז של 50 מיליגרם של המיקרו-קרונות לגרם בטמפרטורת החדר. כאשר microcarriers מיושבים, להשליך את supernatant.כדי להכין ביוריאקטור פרפוזיה, לעקר את הביוריאקטור על ידי אוטוקלבינג כפי שתואר קודם לכן. בסיום, יש לספור את מספר ה-SF-MSCs שיש להקצות 2.5 כפול 10 ל-SF-MSCs השביעי ואת המיקרו-קריינות לביו-ריאקטור עם 250 מיליליטר של מדיום תרבית MSC ברמת GMP. מניחים את הביוריאקטור באינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במהירות של 15 סיבובים לדקה.שנה את מדיום התרבות כל שישה ימים. לאחר 14 יום, אספו את תרביות התאים ואת המיקרו-קריינות להמשך ניתוח. צנטריפוגה של תרבית התאים ב-300 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ואיסוף הסופר-נטנט תוך השלכת פסולת התאים.בארבע מעלות צלזיוס, צנטריפוגה ברצף את supernatant ב 2, 000 פעמים G במשך 10 דקות ולאחר מכן ב 10, 000 פעמים G במשך 30 דקות כדי להשליך את שלפוחית גדולה יותר ולאסוף את הכדור. לאחר החייאת הכדור ב 40 מיליליטר של PBS, צנטריפוגה ההשעיה התא ב 120, 000 פעמים G במשך 70 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להשעות את הכדור שנאסף המכיל אקסוזומים ב 500 microliters של PBS.לדלל את דגימות האקסוזום שבודדו זה עתה עם PBS סטרילי לריכוז של 10 עד 7 עד 10 עד החלקיקים התשיעי למיליליטר ולהזריק 500 מיקרוליטר של הדגימה עבור כל ריצה לתוך ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, או מערכת NTA, ב 30 מיקרוליטר לדקה ו 24.4 עד 24.5 מעלות צלזיוס. הגדר ידנית את מערכת הלכידה והניתוח בהתאם לפרוטוקול היצרן. דמיינו את החלקיקים על ידי פיזור אור לייזר ולכדו את התנועה הבראונית שלהם בווידאו דיגיטלי.לאחר מכן, נתח את קלטות הווידאו המוקלטות באמצעות תוכנה, תוך מעקב אחר לפחות 200 חלקיקים בודדים בכל ריצה. עבור כתם מערבי, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של חיץ הליזיס ומעכבי פרוטאז לאקסוזומים עם ערבוב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, אפשרו להם לעמוד על הקרח במשך 20 דקות.לאחר צנטריפוגה של התערובת ב 9, 391 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, למדוד את ריכוז החלבון supernatant באמצעות ערכת בדיקת חלבון. לאחר הבדיקה, מחממים את הדגימה עם 100 מיקרוליטרים של חיץ העמסת חלבון 4X בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, טען 15 מיקרוליטרים של חלבונים בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר כדי לרוץ על ידי אלקטרופורזה ג'ל ב 120 וולט במשך 70 דקות, ואלקטרו-כתם ב 100 וולט במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס.זהה את הסמנים הספציפיים שאינם אקסוזומים, כגון calnexin ואת הסמנים הביולוגיים האקסוזומליים כגון CD9, CD63 ו- CD81 על ידי כתם מערבי פלואורסצנטי. במחקר, ציטומטריה של זרימה שימשה לזיהוי סמני פני השטח של SF-MSCs. ניתוח ציטומטריה של זרימה גילה כי SF-MSCs בתרבית היו שליליים עבור CD34, CD45 ו- HLA-DR, וחיוביים עבור CD73, CD90 ו- CD105, ועמדו בקריטריוני הזיהוי של MSCs.תחת מיקרוסקופיה הפוכה, הבחין כי SF-MSCs להתרבות על microcarriers. ה-SF-MSC התפשט בתרבית תלת-ממד מהר יותר משישה ימים ואילך בהשוואה לתרבית דו-ממדית. האקסוזומים מ-SF-MSCs של תרבית דו-ממדית ותלת-ממדית זוהו באמצעות כתם מערבי ונמצא כי האקסוזומים מבטאים CD63, CD9 ו-CD81 בעוד שהם שליליים עבור קלנקסין.ניתוח הננוציטים הראה כי הקוטר של אקסוזומים דו-ממדיים ותלת-ממדיים הוא כ-120 ננומטר. הניתוח המיקרוסקופי של אלקטרונים בהולכה חשף את המורפולוגיה של אקסוזומים דו-ממדיים ותלת-ממדיים, והראה שלפוחיות כדוריות בערך. באמצעות ניתוח NTA נותח הריכוז של חלקיקים בגודל 30 עד 160 ננומטר.לאחר תרבית תלת-ממדית, ריכוז החלקיקים היה 4.0 כפול 10 עד 6 למיליליטר. עם זאת, לאחר התרבית הדו-ממדית, הריכוז של חלקיקים זהים היה 2.5 כפול 10 עד 6 למיליליטר. יתר על כן, תרבית תלת-ממדית ייצרה יותר חלבון אקסוזום מאשר תרבית דו-ממדית.הניתוח המייצג מראה את ההפנמה של אקסוזומים המסומנים בדיל על ידי כונדרוציטים ראשוניים. ניתן לראות אקסוזומים עם תווית דיל שנכנסו לכונדרוציטים ראשוניים עם שיא של שלוש שעות. מחקר במבחנה הראה כי אקסוזומים יכולים להעביר מיקרו-רנ"א-140 עם תווית סולפו-ציאנין3 לכונדרוציטים.ציפוי התאים, התחלת התגובה בביוריאקטור, ושל הסופר-נטנט הם השלבים החשובים ביותר בפרוטוקול זה. תרבית תלת-ממדית משמשת בדרך כלל לתרבית בקנה מידה גדול של תאים דבקים. שיטות אחרות כגון ספין פלקס יכולות לשמש גם לייצור בקנה מידה גדול של אקסוזומים.השיטה שלנו משפרת את התפוקה של אקסוזומים, ובכך מאפשרת יישום פרה-קליני מבוסס אקסוזום MSC.

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

מערכת 3D עבור chondrocytes culturing האדם במפרק של נוזל סינוביאלי

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול בהליוציץ השנתי

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

הליך ChIP-Seq חצי-אטומי למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...