Name: large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00
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चीन का राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 81972116, नंबर 81972085, नंबर 81772394); गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन का प्रमुख कार्यक्रम (संख्या 2018 बी 0303110003); गुआंग्डोंग अंतर्राष्ट्रीय सहयोग परियोजना (संख्या 2021 ए0505030011); शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजनाएं (सं। GJHZ20200731095606019, सं. JCYJ20170817172023838, सं. JCYJ20170306092215436, सं. JCYJ20170413161649437); चीन पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (संख्या 2020 एम 682907); गुआंग्डोंग बेसिक और एप्लाइड बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (संख्या 2021 ए 1515010985); शेन्ज़ेन में चिकित्सा की संमिंग परियोजना (एसजेडएसएम 201612079); गुआंग्डोंग प्रांत में उच्च स्तरीय अस्पतालों के निर्माण के लिए विशेष निधियां।

इस अध्ययन को शेन्ज़ेन सेकंड पीपुल्स हॉस्पिटल की मानव आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। विट्रो प्रोटोकॉल में एचएसएफ-एमएससी से अलग एक्सोसोम का एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1 में दिखाय?...

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	<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis:+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study.">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. 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(138), (2018).</li><li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy.">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li><li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy.">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Lv, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model.">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture.">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. 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मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का व्यापक रूप से पुनर्योजी चिकित्सा में उनके आत्म-नवीकरण के कारण उपयोग किया जाता है, विशेष कार्यों के साथ ऊतक कोशिकाओं में विभेदित किया जाता है, और पैराक्रिन प्रभाव16,17<...

ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए), संयुक्त उपास्थि और अंतर्निहित हड्डी के टूटने के परिणामस्वरूप, विकलांगता 1,2 के लिए एक गंभीर चुनौती बनी हुई है। रक्त और तंत्रिका आपूर्ति के बिना, उपास्थि आत्म-उपचार क्षमता एक बार घायल होने के बाद न्यूनतम होती है 3,4. पिछले दशकों में, ऑटोलॉगस चोंड्रोसाइट्स प्रत्यारोपण (एसीआई) पर आधारित उपचारों ने ओए उपचार 5 में कुछ प्रगति कीहै। चोंड्रोसाइट्स अलगाव और विस्तार के लिए, ओए संयुक्त के गैर-वजन वाले क्षेत्र से छोटे उपास्थि की कटाई आवश्यक है, जिससे उपास्थि को चोटें लगती हैं। इसके अलावा, विस्तारित चोंड्रोसाइट्स6 को प्रत्यारोपित करने के लिए प्रक्रिया को दूसरे ऑपरेशन की आवश्यकता होगी। इस प्रकार, उपास्थि की चोटों के बिना ओए उपचार के लिए एक-चरण उपचार व्यापक अन्वेषण के अधीन हैं।
मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) को ओए उपचार 7,8 के लिए आशाजनक विकल्प के रूपमें सुझाया गया है। कई ऊतकों से उत्पन्न, एमएससी विशिष्ट उत्तेजना के साथ चोंड्रोसाइट्स में अंतर कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, एमएससी एंटी-सूजन 9 के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं कोसंशोधित कर सकते हैं। इसलिए, एमएससी उपास्थि दोषों की मरम्मत और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करके ओए उपचार में महत्वपूर्ण लाभ रखते हैं, खासकर सूजन वातावरण में। ओए उपचार के लिए, श्लेष द्रव (एसएफ-एमएससी) से एमएससी ने हाल ही में अन्य एमएससी स्रोतों10,11 की तुलना में अपनी मजबूत चोंड्रोसाइट्स भेदभाव क्षमता के कारण बहुत ध्यान आकर्षित किया है। विशेष रूप से, आर्थोपेडिक क्लिनिक में, संयुक्त गुहा से भड़काऊ एसएफ का निष्कर्षण ओए रोगियों के दर्द लक्षण को दूर करने के लिए एक नियमित चिकित्सा है। निकाले गए भड़काऊ एसएफ को आमतौर पर चिकित्सा अपशिष्ट के रूप में निपटाया जाता है। रोगी और डॉक्टर दोनों भड़काऊ एसएफ से अलग ऑटोलॉगस एमएससी को बहुत कम नैतिक संघर्षों के साथ ओए उपचार के रूप में मानने के लिए तैयार हैं। हालांकि, एसएफ-एमएससी थेरेपी ट्यूमरोजेनिक जोखिमों, लंबे समय तक भंडारण और दूर के शिपमेंट बाधाओं के कारण समझौता किया जाता है।
एमएससी सहित कई सेल प्रकारों द्वारा स्रावित एक्सोसोम, अधिकांश मूल सेल जैव-जानकारी ले जाते हैं। सेल-फ्री थेरेपी12,13 के रूप में इसकी गहराई से जांच की गई है। नैदानिक परीक्षण सरकार (ClinicalTrials.gov) की वेबसाइट पर उपलब्ध अद्यतन संसाधनों के अनुसार, कैंसर, उच्च रक्तचाप और न्यूरो-डीजेनेरेटिव रोगों के अनुसंधान क्षेत्रों में अधिक व्यापक एक्सोसोम नैदानिक अध्ययन शुरू किए गए हैं और किए गए हैं। एसएफ-एमएससी एक्सोसोम उपचार ओए से निपटने के लिए एक रोमांचक और चुनौतीपूर्ण परीक्षण हो सकता है। नैदानिक अनुवाद के लिए अच्छा विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी)-ग्रेड और बड़े पैमाने पर एक्सोसोम उत्पादन आवश्यक हैं। दो-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति के आधार पर छोटे पैमाने पर एक्सोसोम अलगाव व्यापक रूप से किया गया है। हालांकि, बड़े पैमाने पर एक्सोसोम उत्पादन रणनीतियों को अनुकूलन की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन में एक बड़े पैमाने पर एक्सोसोम विनिर्माण विधि विकसित की गई थी, जो क्सीन-मुक्त परिस्थितियों में बड़े पैमाने पर एसएफ-एमएससी संस्कृति पर आधारित थी। सेल कल्चर सुपरनैटेंट से अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एक्सोसोम सुरक्षा और कार्य को मान्य किया गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>P0903</td>
			<td>Bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1243C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1143C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555483</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A5271</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1242C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>&#160;A5270</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>&#160;A1703</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90 antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1167C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning fluorescence microscopy</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Microcarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dil</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Exosome label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-PCR Mycoplasma detection kit</td>
			<td>BI</td>
			<td>20-700-20</td>
			<td>Mycoplasma detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowcytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>MSC identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1652660</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.2</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td>Version 8.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1111C</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowenstein-Jensen culture medium</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.</td>
			<td>T0573</td>
			<td>Mycobacterium tuberculosis culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesenGro</td>
			<td>StemRD</td>
			<td>MGro-500</td>
			<td>MSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nanosight NS300</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA 2.3 software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey FC</td>
			<td>Gene Company Limited</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep electroporation buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3911</td>
			<td>Gene transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158924</td>
			<td>Removal of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud agar plate</td>
			<td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>P0919</td>
			<td>Fungi culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td></td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Rotary Cell Culture System (RCCS)</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4HD</td>
			<td>3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosome centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale preparation of synovial fluid mesenchymal stem cell-derived exosomes by 3d bioreactor culture

मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) द्वारा स्रावित एक्सोसोम को उपास्थि की चोटों और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस उपचार के लिए आशाजनक उम्मीदवारों के रूप में सुझाया गया है। नैदानिक अनुप्रयोग के लिए एक्सोसोम को बड़े पैमाने पर उत्पादन की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, मानव श्लेष द्रव एमएससी (एचएसएफ-एमएससी) को माइक्रोकैरियर मोतियों पर उगाया गया था, और फिर एक गतिशील तीन-आयाम (3 डी) संस्कृति प्रणाली में सुसंस्कृत किया गया था। 3 डी गतिशील संस्कृति का उपयोग करने के माध्यम से, इस प्रोटोकॉल ने सफलतापूर्वक एसएफ-एमएससी संस्कृति सुपरनैटेंट से बड़े पैमाने पर एक्सोसोम प्राप्त किए। एक्सोसोम को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया था और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप, नैनोपार्टिकल ट्रांसमिशन परख और पश्चिमी सोख्ता द्वारा सत्यापित किया गया था। इसके अलावा, एक्सोसोम की सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा का पता लगाया गया था। एक्सोसोम का पता लगाने के परिणाम बताते हैं कि यह दृष्टिकोण बड़ी संख्या में अच्छी विनिर्माण प्रथाओं (जीएमपी) ग्रेड एक्सोसोम का उत्पादन कर सकता है। इन एक्सोसोम का उपयोग एक्सोसोम जीव विज्ञान अनुसंधान और नैदानिक पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस उपचार में किया जा सकता है।

इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर सेलुलर थेरेपी14,15 द्वारा अनुशंसित मानव एमएससी को परिभाषित करने के लिए न्यूनतम मानदंडों के अनुसार, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग एसएफ-एमएससी के सतह मार्करों की ?...

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Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

यहां, हम 3 डी बायोरिएक्टर का उपयोग करके श्लेष द्रव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से बड़ी संख्या में जीएमपी-ग्रेड एक्सोसोम का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

3 डी बायोरिएक्टर कल्चर द्वारा श्लेष द्रव मेसेनकाइमल स्टेम सेल-व्युत्पन्न एक्सोसोम की बड़े पैमाने पर तैयारी

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

हम अपने 3 डी बायोरिएक्टर का उपयोग करके श्लेष द्रव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से बड़ी संख्या में जीएमपी-ग्रेड एक्सोसोम का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इन एक्सोसोम का उपयोग एक्सोसोम जीव विज्ञान अनुसंधान और नैदानिक गठिया उपचार में किया जा सकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ यूजी लियांग करेंगे।चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,500 गुना जी पर श्लेष द्रव को सेंट्रीफ्यूज करके मानव मेसेनकाइमल कोशिकाओं, या एमएससी को इकट्ठा करना शुरू करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और सेल पेलेट को 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ फिर से निलंबित करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,500 गुना जी पर पुन: निलंबित कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और 10 मिलीलीटर मानव एमएससी कल्चर माध्यम के साथ पैलेट को पांच गुना 10 गुना 10 गुना चौथी कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर के सेल घनत्व पर पुन: निलंबित करने से पहले पीबीएस को छोड़ दें और फिर निलंबन को 100 मिलीमीटर डिश में प्लेट करें।डिश को 5% कार्बन डाइऑक्साइड वाले वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। दो सप्ताह के बाद, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके श्लेष द्रव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं, या एसएफ-एमएससी की पहचान करने के लिए सेल कल्चर सुपरनैटेंट एकत्र करें। ऐसा करने के लिए, एसएफ-एमएससी की तीसरी पीढ़ी के मार्ग तीन को चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 1,000 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पचाएं।फिर, सेल गोली एकत्र करने से पहले सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। इसके बाद, ब्लॉकिंग बफर के 400 माइक्रोलीटर को सेल पेलेट में पांच गुना 10 से चौथे की एकाग्रता पर जोड़ें और गोली को कमरे के तापमान पर 15 मिनट तक खड़े रहने दें। 15 मिनट के बाद, सेंट्रीफ्यूज सेल निलंबन जैसा कि पहले वर्णित है, फिर 1 एक्स पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर में अलग गोली को फिर से निलंबित करता है।पांडुलिपि में वर्णित 1: 100 प्रति ट्यूब के कमजोर पड़ने के अनुपात पर मोनोक्लोनल फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का एक माइक्रोलीटर जोड़ें, और ट्यूब को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन के लिए रखें। इनक्यूबेशन बाद, कोशिकाओं को 1X PBS के साथ दो बार धोएं और 1X PBS के 100 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। फिर, लाल और एफआईटीसी चैनलों का उपयोग करके प्रवाह साइटोमीटर पर 10,000 कोशिकाओं में फ्लोरोफोर का पता लगाएं।माइक्रोकैरियर तैयार करने के लिए, कमरे के तापमान पर कम से कम तीन घंटे के लिए 50 मिलीग्राम प्रति ग्राम की एकाग्रता पर 1एक्स डीपीबीएस में 0.75 ग्राम माइक्रोकैरियर को उबालें और हाइड्रेट करें। फिर, पांच मिनट के लिए ताजा डीपीबीएस में माइक्रोकैरियर को धोने के लिए सुपरनैटेंट को डिकेंट करें। प्रति ग्राम 50 मिलीग्राम माइक्रोकैरियर पर ताजा 1एक्स डीपीबीएस के साथ माध्यम को बदलने के बाद, 15 पाउंड प्रति वर्ग इंच पर 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव करके माइक्रोकैरियर को निष्फल करें।फिर, सतह पर तैरने वाले को अलग करने से पहले निष्फल माइक्रोकैरियर को व्यवस्थित करने की अनुमति दें। कमरे के तापमान पर प्रति ग्राम माइक्रोकैरियर के 50 मिलीग्राम की एकाग्रता पर संस्कृति माध्यम में माइक्रोकैरियर को कुल्ला करें। जब माइक्रोकैरियर बस जाते हैं, तो सुपरनैटेंट को छोड़ दें।छिड़काव बायोरिएक्टर तैयार करने के लिए, पहले वर्णित के रूप में ऑटोक्लेविंग द्वारा बायोरिएक्टर को निष्फल करें। जब ऐसा किया जाता है, तो एसएफ-एमएससी की संख्या को सातवें एसएफ-एमएससी को 2.5 गुना 10 आवंटित करने के लिए गणना करें और जीएमपी-ग्रेड एमएससी कल्चर माध्यम के 250 मिलीलीटर के साथ बायोरिएक्टर को माइक्रोकैरियर आवंटित करें। बायोरिएक्टर को 15 रोटेशन प्रति मिनट की गति से 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक इनक्यूबेटर में रखें।हर छह दिन में संस्कृति माध्यम बदलें। 14 दिनों के बाद, आगे के विश्लेषण के लिए सेल कल्चर सुपरनैटेंट और माइक्रोकैरियर एकत्र करें। सेल कल्चर सुपरनैटेंट को चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूज करता है और सेलुलर मलबे को त्यागते हुए सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करता है।चार डिग्री सेल्सियस पर, क्रमिक रूप से सुपरनैटेंट को 10 मिनट के लिए 2,000 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूज करें और फिर 30 मिनट के लिए 10,000 गुना जी पर बड़े पुटिकाओं को त्यागने और गोली एकत्र करने के लिए। पीबीएस के 40 मिलीलीटर में गोली को फिर से चार्ज करने के बाद, सेल निलंबन को चार डिग्री सेल्सियस पर 70 मिनट के लिए 120,000 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर में एक्सोसोम युक्त एकत्रित गोली को फिर से निलंबित करें।बाँझ पीबीएस के साथ ताजा पृथक एक्सोसोम नमूनों को प्रति मिलीलीटर नौवें कणों के लिए 10 से सातवें से 10 की एकाग्रता तक पतला करें और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण या एनटीए प्रणाली में प्रत्येक रन के लिए नमूने के 500 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें, 30 माइक्रोलीटर प्रति मिनट और 24.4 से 24.5 डिग्री सेल्सियस। मैन्युअल रूप से निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कैप्चर और विश्लेषण प्रणाली सेट करें। लेजर प्रकाश प्रकीर्णन द्वारा कणों की कल्पना करें और डिजिटल वीडियो पर उनकी ब्राउनियन गति को कैप्चर करें।इसके बाद, सॉफ्टवेयर का उपयोग करके रिकॉर्ड किए गए वीडियोटेप का विश्लेषण करें, प्रति रन कम से कम 200 व्यक्तिगत कणों को ट्रैक करें। वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए, लाइसिस बफर और प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल के 300 माइक्रोलीटर को एक्सोसोम में ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मिश्रण के साथ जोड़ें। फिर, 20 मिनट के लिए बर्फ पर खड़े होने दें।चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 9, 391 गुना जी पर मिश्रण के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रोटीन परख किट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले में प्रोटीन एकाग्रता को मापें। परख के बाद, 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर 4 एक्स प्रोटीन लोडिंग बफर के 100 माइक्रोलीटर के साथ नमूने को गर्म करें। इसके बाद, 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर प्रोटीन के 15 माइक्रोलीटर लोड करें ताकि 70 मिनट के लिए 120 वोल्ट पर जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा चलाया जा सके, और चार डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 100 वोल्ट पर इलेक्ट्रो-ब्लोटिंग।फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा गैर-एक्सोसोम विशिष्ट मार्करों, जैसे कैलनेक्सिन और सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81 जैसे एक्सोसोमल बायोमाकर्स का पता लगाएं। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चला है कि सुसंस्कृत एसएफ-एमएससी सीडी 34, सीडी 45 और एचएलए-डीआर के लिए नकारात्मक थे, और सीडी 73, सीडी 90 और सीडी 105 के लिए सकारात्मक थे, जो एमएससी के पहचान मानदंडों को पूरा करते थे।उल्टे माइक्रोस्कोपी के तहत, यह देखा गया कि एसएफ-एमएससी माइक्रोकैरियर पर प्रसार करते हैं। एसएफ-एमएससी 2 डी संस्कृति की तुलना में छह दिनों से 3 डी संस्कृति में अधिक तेज़ी से बढ़ गया। 2 डी और 3 डी कल्चर के एसएफ-एमएससी से एक्सोसोम की पहचान वेस्टर्न ब्लॉटिंग का उपयोग करके की गई थी और एक्सोसोम को कैलनेक्सिन के लिए नकारात्मक होने के दौरान सीडी 63, सीडी 9 और सीडी 81 को व्यक्त करते हुए पाया गया था।नैनोसाइट विश्लेषण से पता चला कि 2 डी और 3 डी एक्सोसोम का व्यास लगभग 120 नैनोमीटर था। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण ने 2 डी और 3 डी एक्सोसोम की आकृति विज्ञान का खुलासा किया, जो मोटे तौर पर गोलाकार पुटिकाओं को दिखाते हैं। एनटीए विश्लेषण का उपयोग करते हुए, 30-से 160-नैनोमीटर आकार के कणों की एकाग्रता का विश्लेषण किया गया था।3 डी संस्कृति के बाद, कण एकाग्रता 4.0 गुना 10 से छह प्रति मिलीलीटर थी। हालांकि, 2 डी संस्कृति के बाद, समान आकार के कणों की एकाग्रता छह प्रति मिलीलीटर से 2.5 गुना 10 गुना थी। इसके अलावा, 3 डी संस्कृति ने 2 डी संस्कृति की तुलना में अधिक एक्सोसोम प्रोटीन का उत्पादन किया।प्रतिनिधि विश्लेषण प्राथमिक चोंड्रोसाइट्स द्वारा दिल-लेबल एक्सोसोम के आंतरिककरण को दर्शाता है। प्राथमिक चोंड्रोसाइट्स में प्रवेश करने वाले दिल-लेबल एक्सोसोम को तीन घंटे में चरम के साथ देखा जा सकता है। इन विट्रो डिलीवरी अध्ययन से पता चला है कि एक्सोसोम चोंड्रोसाइट्स को सल्फो-साइनिन 3-लेबल माइक्रोआरएनए -140 प्रदान कर सकते हैं।कोशिकाओं को चढ़ाना, बायोरिएक्टर में प्रतिक्रिया शुरू करना, और सुपरनैटेंट का इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं। 3 डी संस्कृति आमतौर पर अनुयायी कोशिकाओं की बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए उपयोग की जाती है। स्पिन फ्लेक्स जैसे अन्य तरीकों का उपयोग एक्सोसोम के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए भी किया जा सकता है।हमारी विधि एक्सोसोम की उपज में सुधार करती है, इस प्रकार एमएससी एक्सोसोम-आधारित प्रीक्लिनिकल अनुप्रयोग को सक्षम करती है।

Research

JoVE Journal

Biology

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